本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種抑菌組合物。
背景技術(shù)：
：抗生素從發(fā)現(xiàn)至今，在人類(lèi)醫(yī)療上扮演著十分重要的角色，拯救了無(wú)數(shù)的生命，并為人類(lèi)的健康做出了貢獻(xiàn)。但是，由于目前抗生素的廣泛使用和濫用，微生物對(duì)抗生素的耐藥性也越來(lái)越強(qiáng)，使許多抗生素對(duì)微生物的抗感染能力明顯降低，而且長(zhǎng)期使用抗生素對(duì)人體也有一定的毒副作用。因此必須尋找新的、更有效的抗菌劑。銀是一種銀白色金屬，其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性及陰性細(xì)菌、真菌具有廣譜的抗菌功能，并具有防止細(xì)菌粘附的能力。德國(guó)產(chǎn)科醫(yī)生Crede在1884年把濃度1％的硝酸銀溶液滴入新生兒眼中預(yù)防新生兒結(jié)膜炎，使嬰兒的失明率從10％降至0.2％。直到今天為止，許多國(guó)家仍在使用Crede預(yù)防法。20世紀(jì)60年代，Moyer將0.5％硝酸銀溶液用于燒傷的治療，使含銀藥物再次得到應(yīng)用。近幾十年國(guó)內(nèi)外的科學(xué)家的研究表明一定濃度的銀離子對(duì)各種細(xì)菌、病毒、真菌等微生物均有廣泛的殺滅作用。銀的另一形態(tài)——銀納米，是國(guó)內(nèi)外研究人員目前關(guān)注的熱點(diǎn)之一。它是一類(lèi)新型抗菌劑，具有廣譜抗菌、無(wú)耐藥性和安全性高的特點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外研究人員研制出的相應(yīng)的銀納米產(chǎn)品已應(yīng)用于各領(lǐng)域。隨著抗生素耐藥性的日益嚴(yán)重，銀納米在消毒殺菌領(lǐng)域的研究和應(yīng)用越來(lái)越受到了廣泛關(guān)注，成為極具發(fā)展前景的一代抗菌藥物。研究表明，銀納米具有殺菌作用是銀納米粒子所釋放的銀離子和納米效應(yīng)共同作用的：1.銀離子擾亂細(xì)菌內(nèi)部的代謝活動(dòng)，代謝酶中二硫鍵的合成，使細(xì)菌的代謝酶失去活性；增加活性氧的產(chǎn)生，阻礙呼吸鏈中Fe-Sclusters的生成；2.銀離子與細(xì)菌細(xì)胞壁上肽聚糖反應(yīng)，同時(shí)銀納米通過(guò)納米效應(yīng)干擾細(xì)胞壁的組成的化合鍵的鍵能，使細(xì)胞壁更易斷裂；3.銀納米進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部，可干擾DNA合成，抑制其轉(zhuǎn)錄。雖然銀離子和銀納米殺菌作用較強(qiáng)，但最新研究表明，它們的毒副作用也不容忽 視。銀離子由于處于離子狀態(tài)更容易進(jìn)出細(xì)胞，而銀納米也可以通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)吞和向外釋放作用，穿過(guò)一些特定細(xì)胞組成的生理屏障，對(duì)該部位的組織及細(xì)胞造成損傷。因此，為解決上述技術(shù)問(wèn)題，確有必要提供一種抗菌方案，在不影響抗菌效果的同時(shí)又降低銀或銀納米使用濃度。聯(lián)合用藥是目前臨床上最簡(jiǎn)便易行的克服細(xì)菌耐藥性的策略之一，聯(lián)合用藥的理論優(yōu)勢(shì)：不同藥物作用于細(xì)菌代謝不同階段；作用于不同分子靶位；使得抗菌效果大大高于單藥，從而可以減少單藥劑量，并減少毒副作用、減少耐藥發(fā)生。例如，中國(guó)專(zhuān)利CN101394741B中，涉及一種抑霉唑和銀化合物的組合，其提供改善的殺生物作用，用于保護(hù)所有有生命的或無(wú)生命的材料。但并不是任何兩種抗菌物質(zhì)組合起來(lái)都能有更好的效果，常用于聯(lián)合用藥評(píng)價(jià)的指標(biāo)是協(xié)同指數(shù)，只有協(xié)同指數(shù)在一定范圍內(nèi)時(shí)，才被認(rèn)為具有聯(lián)合用藥的可能性。而銀元素可以與哪些抗生素聯(lián)合使用、聯(lián)合使用的劑量范圍、以及對(duì)于哪些微生物具有比較優(yōu)異的滅殺效果等問(wèn)題，迄今為止還沒(méi)有很明確的研究結(jié)果。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本案發(fā)明人通過(guò)將銀化合物和銀納米分別與多種不同的抗生素聯(lián)用，考察其對(duì)于不同微生物的抗菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)銀化合物或銀納米與多黏菌素B聯(lián)用時(shí)，對(duì)于抗鮑曼不動(dòng)桿菌(Ab)具有較為明顯的協(xié)同增效作用，因而可以顯著降低銀和多黏菌素B的用量，使得銀可以被用于體內(nèi)使用，對(duì)于新抗菌藥物的開(kāi)發(fā)具有重要意義。因此，本申請(qǐng)的第一個(gè)目的在于提供一種抑菌組合物，可以減少抗生素和銀的單藥劑量，從而減少毒副作用，減少耐藥發(fā)生等。一種抑菌組合物，其主要成份為抗生素和銀，其中，所述抗生素為多黏菌素B，所述銀包括銀化合物和銀納米。根據(jù)本發(fā)明，所述銀納米與多黏菌素B的重量比為40:1～5:4。優(yōu)選的，所述銀納米與多黏菌素B的重量比為20:1～5:2。根據(jù)本發(fā)明，所述銀化合物為硝酸銀。進(jìn)一步的，所述硝酸銀與多黏菌素B的重量比為80:1～5:4。優(yōu)選的，所述硝酸銀與多黏菌素B的重量比為40:1～5:2。本發(fā)明的第二個(gè)目的，在于提供所述抑菌組合物用于制備治療鮑曼不動(dòng)桿菌引起的感染的藥物的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述藥物的劑型優(yōu)選為注射劑。根據(jù)本發(fā)明，所述注射劑還包括注射用水和輔料，所述包括輔料為氨基酸、甘露醇、PVP。本發(fā)明運(yùn)用水相檸檬酸三鈉-硼氫化鈉還原法制備銀納米Ag-cit，運(yùn)用PVP穩(wěn)定乙醇還原法制備銀納米Ag-PVP，本發(fā)明的銀化合物選用硝酸銀。本發(fā)明采用微量稀釋法測(cè)定藥物敏感性，評(píng)價(jià)銀化合物或銀納米和多黏菌素B的抑菌組合物抗鮑曼不動(dòng)桿菌的抑菌活性。相較單獨(dú)銀化合物、銀納米或多黏菌素B的抗鮑曼不動(dòng)桿菌，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：1、銀化合物或銀納米與多黏菌素B聯(lián)用對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌具有協(xié)同效應(yīng)，可以減少多黏菌素B、銀化合物或銀納米對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的單藥劑量，從而減少毒副作用，減少耐藥發(fā)生。2、銀化合物或銀納米與多黏菌素B聯(lián)用在體內(nèi)增強(qiáng)了殺菌效果，同時(shí)，可大大減少體內(nèi)活菌量。3、本發(fā)明將銀化合物或銀納米與多黏菌素B制成抑菌注射劑，具有抑菌效果好、成本較低等諸多優(yōu)點(diǎn)，其對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌有較強(qiáng)抑制作用。4、降低銀化合物或銀納米使用濃度，進(jìn)一步提高銀化合物或銀納米作為抑菌注射劑的安全性。附圖說(shuō)明圖1為Ag-PVP的TEM圖；圖2為Ag-PVP粒徑分布圖；圖3為Ag-cit的TEM圖；圖4為Ag-cit粒徑分布圖；圖5為銀納米、硝酸銀與PMB聯(lián)用對(duì)小鼠腎臟帶菌的抑菌效果圖；圖6為銀納米、硝酸銀與PMB聯(lián)用對(duì)小鼠肺帶菌的抑菌效果圖；圖7為銀納米、硝酸銀與PMB聯(lián)用對(duì)小鼠血液帶菌的抑菌效果圖；圖8為銀納米、硝酸銀與PMB聯(lián)用對(duì)小鼠腹水帶菌的抑菌效果圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例2和實(shí)施例9均采用具有耐碳青霉烯類(lèi)抗生素的鮑曼不動(dòng)桿菌(華山醫(yī)院aba1604)作為測(cè)試菌；實(shí)施例2～9的銀納米均為采用實(shí)施例1的方法合成的銀納米。實(shí)施例1銀納米的合成Ag-PVP合成：將稱(chēng)取的0.78gPVP和49mL無(wú)水乙醇加入三頸圓底燒瓶中，超聲充分混勻，置于70℃油浴中，同時(shí)，磁力攪拌器攪拌溶液，15min后緩慢加入1mL的1％AgNO3溶液，保持70℃加熱120min。待反應(yīng)液冷卻至室溫，此時(shí)溶膠的顏色呈橙黃色。TEM檢測(cè)，圖1為此方法制備的銀納米的TEM圖，圖2為銀納米粒徑分布，平均粒徑為13nm。Ag-cit合成：將20mL的1％檸檬酸三鈉溶液和75mL水加入三頸圓底燒瓶中，置于70℃油浴中，同時(shí)，磁力攪拌器攪拌溶液，15min后加入1.7mL的1％AgNO3溶液，然后迅速添加2mL新配制的0.1％NaBH4溶液。攪拌速度400r/min，反應(yīng)1小時(shí)后結(jié)束反應(yīng)。待反應(yīng)液冷卻至室溫，加水稀釋至100mL，此時(shí)溶膠的顏色呈淺黃色。TEM檢測(cè)，圖3為此方法制備的銀納米的TEM圖，圖4為銀納米粒徑分布，平均粒徑為8nm。實(shí)施例2銀及多黏菌素B的抑菌實(shí)驗(yàn)1、方法(1)硝酸銀或銀納米和抗生素敏感性測(cè)定：先將硝酸銀或銀納米和多黏菌素B分別在滅菌的96空平板上對(duì)比稀釋成一系列濃度，硝酸銀濃度分別為50、25、12.5、6.3、3.1、1.6ppm，銀納米濃度分別為25、12.5、6.3、3.1、1.6ppm，多黏菌素B。用接種環(huán)挑取生長(zhǎng)于LB平板的新鮮菌落置于LB培養(yǎng)基中，37℃孵18h，LB培養(yǎng)基稀釋至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，再稀?0,000倍，使最終菌液濃度為5×105CFU/mL。將稀釋好的菌液分別移至96孔板內(nèi)，按不同比例加入稀釋成一系列濃度各樣品。37℃孵育18h，觀察結(jié)果，計(jì)算抑制率和MIC值。(1)棋盤(pán)法測(cè)定復(fù)方抗菌劑效果聯(lián)合藥敏：硝酸銀或銀納米與抗生素按微量LB肉湯稀釋法分別在96孔板縱列和橫列進(jìn)行稀釋?zhuān)诿靠缀?0μLLB培養(yǎng)基中加入硝酸銀或銀納米抗生素復(fù)方抗菌劑10μL，稀釋度根據(jù)菌株對(duì)硝酸銀或銀納米和抗生素的MIC值結(jié)果確定，并隨板留孔做單藥微量肉湯的MIC值測(cè)定。將菌株接種至試管中，37℃孵育18h，LB培養(yǎng)基稀釋至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，再稀?0,000倍，使最終菌液濃度為5×105CFU/mL。37℃孵育18h，觀察結(jié)果，計(jì)算抑制率，測(cè)定MIC值和協(xié)同抑制指數(shù)(FIC)。2、結(jié)果銀化合物或銀納米和多黏菌素B對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC值范圍結(jié)果、以及不同配比下的聯(lián)合抑菌效果。表1.銀和多黏菌素B對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC(ppm)AgNO3銀納米多黏菌素BMIC(ppm)2.51.250.25結(jié)論：銀納米對(duì)Ab的MIC均為1.25ppm，硝酸銀對(duì)Ab的MIC為2.5ppm，多黏菌素B對(duì)Ab的MIC為0.25ppm。以下為多黏菌素B與銀聯(lián)合抑制鮑曼不動(dòng)桿菌，多黏菌素B表現(xiàn)出與銀納米或硝酸銀協(xié)同抑制鮑曼不動(dòng)桿菌的作用。其中，F(xiàn)IC≤0.5協(xié)同效應(yīng)；1>FIC>0.5部分協(xié)同效應(yīng)；FIC＝1為相加作用；2>FIC>1無(wú)關(guān)效應(yīng)；FIC≥2拮抗效應(yīng)。表2.銀納米與多黏菌素B聯(lián)用優(yōu)選配比(質(zhì)量比)研究結(jié)論：當(dāng)銀納米與PMB聯(lián)用時(shí)，不同配比對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的活性不同。在40:1～5:4的范圍之內(nèi)，具有協(xié)同或部分協(xié)同作用，而在20:1～5:2的范圍之內(nèi)，具有較強(qiáng)的協(xié)同作用。表3.AgNO3與多黏菌素B聯(lián)用優(yōu)選配比(質(zhì)量比)研究結(jié)論：當(dāng)硝酸銀與PMB聯(lián)用時(shí)，不同比例對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的活性不同。在80:1～5:4的范圍之內(nèi)，具有協(xié)同或部分協(xié)同作用，而在40:1～5:2的范圍之內(nèi)，具有較強(qiáng)的協(xié)同作用。實(shí)施例3注射液制備配方：硝酸銀52g，多粘菌素B12.5g，甘氨酸1.5g，甘露醇3.5g，PVP1.5g，共制備1000支。將硝酸銀、多粘菌素B、甘氨酸、甘露醇、PVP加入8000ml注射用水中，補(bǔ)加注射用水至10000ml，加活性炭攪拌，過(guò)濾，滅菌，灌裝。實(shí)施例4注射液制備配方：硝酸銀62.5g，多粘菌素B12.5g，甘氨酸1.7g，甘露醇3.6g，PVP1.8g，共制備1000支。將硝酸銀、多粘菌素B、甘氨酸、甘露醇、PVP加入8000ml注射用水中，補(bǔ)加注射用水至10000ml，加活性炭攪拌，過(guò)濾，滅菌，灌裝。實(shí)施例5注射液制備配方：硝酸銀105g，多粘菌素B12.5g，甘氨酸1.8g，甘露醇3.8g，PVP1.7g，共制備1000支。將硝酸銀、多粘菌素B、甘氨酸、甘露醇、PVP加入8000ml注射用水中，補(bǔ)加注射用水至10000ml，加活性炭攪拌，過(guò)濾，滅菌，灌裝。實(shí)施例6注射液制備配方：銀納米16g，多粘菌素B12.5g，甘氨酸1.5g，甘露醇3.5g，PVP1.5g，共制備1000支。將銀納米、多粘菌素B、甘氨酸、甘露醇、PVP和加入8000ml注射用水中，補(bǔ)加注射用水至10000ml，加活性炭攪拌，過(guò)濾，滅菌，灌裝。實(shí)施例7注射液制備配方：銀納米24g，多粘菌素B12.5g，甘氨酸1.6g，甘露醇3.7g，PVP1.6g，共制備1000支。將銀納米、多粘菌素B、甘氨酸、甘露醇、PVP和加入8000ml注射用水中，補(bǔ)加注射用水至10000ml，加活性炭攪拌，過(guò)濾，滅菌，灌裝。實(shí)施例8注射液制備配方：銀納米31g，多粘菌素B12.5g，甘氨酸1.6g，甘露醇3.8g，PVP1.8g，共制備1000支。將銀納米、多粘菌素B、甘氨酸、甘露醇、PVP加入8000ml注射用水中，補(bǔ)加注射用水至10000ml，加活性炭攪拌，過(guò)濾，滅菌，灌裝。實(shí)施例9體內(nèi)抑菌效果評(píng)價(jià)1、鮑曼不動(dòng)桿菌小鼠腹腔感染模型建立1.1鮑曼不動(dòng)桿菌小鼠重度感染模型模型建立：鮑曼不動(dòng)桿菌置于含LB培養(yǎng)液的試管中，37℃，220rpm培養(yǎng)16h。然后100倍稀釋于新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃，220rpm增菌培養(yǎng)3h，生理鹽水稀釋?zhuān)s5×1011CFU鮑曼不動(dòng)桿菌注射到小鼠腹腔，小鼠24h死亡。小鼠平均體重為20g。1.2模型建立：腹腔注射500μL1×1011CFU/mL的鮑曼不動(dòng)桿菌溶液(8％黏蛋白生理鹽水溶液)1.3給藥過(guò)程：待模型建立完畢1h后，分別腹腔注射100μL銀納米溶液和硝酸銀溶液，觀察。2、銀納米、硝酸銀的LD50測(cè)定健康小鼠腹腔注射100μL銀納米溶液和硝酸銀溶液，測(cè)定Ag-PVP、硝酸銀的LD50。銀納米的LD50測(cè)定：銀納米溶液濃度為22.431mM，即銀含量為0.2423mg，LD50為12.12mg/kg；硝酸銀LD50測(cè)定：硝酸銀溶液濃度為43.285mM，即銀含量為0.4675mg，硝酸銀的LD50為36.79mg/kg。3、銀納米、硝酸銀治療鮑曼不動(dòng)桿菌小鼠模型劑量確定銀納米、硝酸銀各選用三個(gè)治療劑量，分別為高(1/10LD50)、中(1/20LD50)、低(1/30LD50)。小鼠體重按平均每只20g計(jì)。表4.不同銀劑量下小鼠存活比例組與銀納米組在中、低兩個(gè)劑量，24h后觀察小鼠存活率均為0％。后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中硝酸銀劑量與銀納米劑量選擇在(1/20～1/10)LD50之間。4、銀納米(16.2μg)、硝酸銀(28.9μg)與PMB聯(lián)用治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染小鼠模型，16小時(shí)后各組小鼠器官帶菌數(shù)比較。4.1銀納米、硝酸銀與PMB聯(lián)用對(duì)小鼠腎臟帶菌的抑菌效果，見(jiàn)圖5。4.2銀納米、硝酸銀與PMB聯(lián)用對(duì)小鼠肺帶菌的抑菌效果，見(jiàn)圖6。4.3銀納米、硝酸銀與PMB聯(lián)用對(duì)小鼠血液帶菌的抑菌效果，見(jiàn)圖7。4.4銀納米、硝酸銀與PMB聯(lián)用對(duì)小鼠腹水帶菌的抑菌效果，見(jiàn)圖8。結(jié)論從小鼠各器官帶菌分析，銀與多黏菌素B聯(lián)用大大減少了小鼠體內(nèi)活菌量。可以有效降低銀與多黏菌素B各自的用量。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3