本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥和納米材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種氧化還原敏感型可降解納米微球載體的制備方法。

背景技術(shù)：
近年來，提高抗癌藥物載體轉(zhuǎn)載效率的研究成為熱點(diǎn)，主要研究方向是集多功能于同一載體，實(shí)現(xiàn)多因子靶向、復(fù)合載藥和可控釋藥。載體的載藥元件設(shè)計(jì)、靶向制導(dǎo)方法、藥物釋放策略等方面的新思路不斷涌現(xiàn)，新型高效多功能納米載體的構(gòu)建越來越受到研究者的青睞。智能型藥物載體一般由通過含有環(huán)境敏感基團(tuán)相連的載藥基質(zhì)與藥物共同組成。選取可降解的材料，如聚氨基酸、殼聚糖等作為載藥基質(zhì)，不但能提高載體對正常組織細(xì)胞的生物相容性，而且避免載體在生物體內(nèi)的沉積，有效減少腫瘤治療過程的副作用。智能型藥物釋放行為控制就是選擇合適的鏈接基團(tuán)，使之在特定的條件下快速降解，釋放出藥物，并且不會(huì)對藥物的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生任何影響。智能型藥物載體在一定程度上能夠克服臨床普遍存在的多藥耐藥問題，智能型藥物載體的研究對腫瘤治療具有重要意義。解決載體存在的可引發(fā)不良反應(yīng)、易被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織吞噬、主動(dòng)靶向性差等問題是目前研究的重點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對目前腫瘤載體主動(dòng)靶向性能不高，體內(nèi)不可降解導(dǎo)致沉積引發(fā)不良發(fā)應(yīng)，以及對載藥的控釋效率低等問題，提供一種有機(jī)-無機(jī)載藥基質(zhì)相結(jié)合、對腫瘤細(xì)胞的pH值和還原性環(huán)境高度敏感的氧化還原敏感型納米靶向載體的制備方法。該微球載體具有靶向功能強(qiáng)、藥物控釋智能、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、無毒副作用等特點(diǎn)。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種氧化還原敏感型納米靶向載體的制備方法，采用微乳液技術(shù)合成磷酸鈣微粒，在微粒表面涂布一層可降解的有機(jī)大分子物質(zhì)形成載藥核心。把還原性環(huán)境敏感型交聯(lián)元件組裝到載藥核心上，之后接枝改性的靶向因子，最終合成智能型靶向納米微球載體。具體制備步驟如下：一、CaP微粒制備：(1)取濃度為0.1～0.5moL/L的CaCl2溶液加入到由環(huán)己烷/聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚組成的油相中，油相中環(huán)己烷與聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚的體積比為70∶10～100，CaCl2溶液與油相的體積比為1∶10～30。(2)另取濃度為10～30mmoL/L的Na2HPO3溶液和濃度為20～50mmoL/L二羥基苯丙氨酸(DOPA)的三氯甲烷溶液滴入到另一份上述油相中，Na2HPO3溶液與油相的體積比為1∶10～30，DOPA的三氯甲烷溶液與油相體積比為1∶20～60，Na2HPO3與DOPA的摩爾比為1∶0.5～5。(3)兩相混合攪拌2～8h，控制Na2HPO3與CaCl2的摩爾比為1∶10～25。(4)加入乙醇，乙醇與混合相總體積比為1∶3～8，高速離心，棄上清液，沉淀用乙醇清洗，冷凍干燥得到CaP微粒。二、載藥核心裝配：取CaP微粒用去離子水或者三氯甲烷重懸，CaP微粒濃度為5～20mg/mL，將改性活化的大分子和抗癌藥物溶于DMSO，改性活化的大分子濃度為1～10mg/mL，抗癌藥物濃度為0.5～5mg/mL，將兩組溶液混合，控制CaP微粒與活化的大分子的摩爾比為1∶0.5～4，CaP微粒與抗癌藥物的摩爾比為1∶0.1～10，室溫環(huán)境下攪拌4～24h，組裝成載藥核心微粒，高速離心，冷凍干燥。三、氧化還原敏感型控釋元件組裝：取載藥核心微粒分散到濃度為1～15mg/mL的N，N-二甲基甲酰胺(MSDS)溶液中，添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)的水溶液和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，加入含有二硫鍵的控釋元件，控制載藥核心微粒與含有二硫鍵的控釋元件的摩爾比為1∶1～5，載藥核心微粒與EDC·HCl的質(zhì)量比為1∶1～5，載藥核心微粒與NHS的質(zhì)量比為1∶1～5，40～60℃條件下攪拌12～48h，將控釋元件組裝到載藥核心上。四、靶向元件修飾：取上述含有控釋元件的產(chǎn)物加入到濃度為0.1～1mmol/LEDTA的中性磷酸緩沖液中，含有控釋元件的產(chǎn)物與緩沖液的比例為1∶0.5～4(m/v)，加入靶向分子，控制靶向分子濃度為1～20mmol/L，在室溫氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下反應(yīng)12～48h，用去離子水透析，凍干，獲得智能型納米靶向載體。本發(fā)明中，所述載藥核心的大分子為活化的殼聚糖(CS)、聚己內(nèi)酯(PCL)或聚乙稀亞胺(PEI)的其中之一或任意兩者的共聚物。本發(fā)明中，所述載藥核心運(yùn)載的抗癌藥物為鹽酸阿霉素(DOX)和/或siRNA。本發(fā)明中，所述氧化還原敏感型控釋元件為巰基乙胺修飾的寡肽片段(PAsp(MEA))、胱氨二鹽酸鹽或二硫代二丙酸的一種。本發(fā)明中，所述靶向元件選用腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、雙功能肽R13或葉酸的一種。本發(fā)明中，所述Na2HPO3與CaCl2的摩爾比可進(jìn)一步優(yōu)化為1∶12～20，Na2HPO3與DOPA的摩爾比可進(jìn)一步優(yōu)化為1∶0.8～4，油相中環(huán)己烷與聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚的體積比可進(jìn)一步優(yōu)化為70∶20～80。本發(fā)明中，所述CaP微粒與活化的大分子的摩爾比可進(jìn)一步優(yōu)化為1∶0.8～3.4。本發(fā)明中，所述載藥核心微粒與含有二硫鍵的控釋元件的摩爾比可進(jìn)一步優(yōu)化為1∶1.2～4，載藥核心微粒與EDC·HCl的質(zhì)量比可進(jìn)一步優(yōu)化為1∶1.2～4，載藥核心微粒與NHS的質(zhì)量比可進(jìn)一步優(yōu)化為1∶1.2～4。本發(fā)明中，所述靶向分子濃度可進(jìn)一步優(yōu)化為1～16mmol/L。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)對正常細(xì)胞無毒，釋放藥物伴隨降解。(2)靶向性強(qiáng)，藥物智能控釋。(3)本發(fā)明所述智能靶向載體能夠有效提高腫瘤治療效果，具有較高的應(yīng)用前景。附圖說明圖1為負(fù)載鹽酸阿霉素(DOX)的GCP-SS-R掃描電鏡圖片。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。實(shí)施例1本實(shí)施例按以下步驟制備負(fù)載鹽酸阿霉素(DOX)的GCP-SS-R：a、取10mL0.3moL/L的CaCl2溶液加入到200mL油相中。油相的組成：環(huán)己烷/聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚為80/30(v/v)。另取10mL15mmoL/LNa2HPO3溶液和5mL濃度為30mmol/L的DOPA三氯甲烷溶液到另一份上述油相中。兩相混合攪拌2h。加入100mL乙醇，10000rpm離心30min，除去上層環(huán)己烷和表面活性劑，用乙醇清洗3次，冷凍干燥得到CaP微粒。b、取100mgCaP微粒添加10ml去離子水，另取100mg改性活化的殼聚糖和10mgDOX溶于50mLDMSO，CaP乳濁液緩慢滴入到殼聚糖溶液中，25℃不斷攪拌，反應(yīng)8h，10000rpm離心30min，棄上清，冷凍干燥，獲得負(fù)載DOX的GCP微粒。c、取100mgGCP微粒轉(zhuǎn)移到50mL濃度為5mg/mL的MSDS溶液中，向溶液中緩慢滴加10mL(濃度10％，m/v)EDC·HCl水溶液和10mL(濃度10％，m/v)NHS，室溫反應(yīng)，加入100mgPAsp(MEA)，不斷攪拌，40℃氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下反應(yīng)20h，將控釋元件組裝到載藥核心上。d、取50mg上述產(chǎn)物加入到含有50mL0.1mmol/LEDTA的中性磷酸緩沖液中，加入20μgR13，在室溫氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下反應(yīng)24h。用截留分子量為8000的透析袋透析48h，冷凍干燥，獲得智能型納米靶向載體GCP-SS-R，其掃描電鏡圖如圖1所示。檢測結(jié)果顯示，GCP-SS-R納米微球粒徑分布均勻，平均粒徑為108-176nm。DOX包封率為75.3％，在谷胱甘肽的濃度為2mM，pH為5.0的PBS中8小時(shí)的釋放量達(dá)到52.4％。實(shí)施例2本實(shí)施例按以下步驟制備負(fù)載siRNA的PCP-SS-T：a、按照實(shí)施例1的a步驟制備CaP微粒。b、取10mgCaP微粒添加5ml去離子水，另取10mg改性活化的PEI和100μgsiRNA溶于10mLDMSO，CaP乳濁液緩慢滴入到PEI溶液中，25℃條件下不斷攪拌8h，10000rpm離心30min，棄上清，冷凍干燥，獲得負(fù)載siRNA的PCP微粒。c、取10mgPCP微粒轉(zhuǎn)移到10mL濃度為5mg/mL的MSDS溶液中，向溶液中緩慢滴加2mL(濃度10％，m/v)EDC·HCl水溶液和2mL(濃度10％，m/v)NHS，室溫反應(yīng)，加入10mgPAsp(MEA)，不斷攪拌，40℃氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下反應(yīng)48h，將控釋元件組裝到載藥核心上。d、取10mg上述產(chǎn)物加入到含有10mL濃度為0.1mmol/LEDTA的中性磷酸緩沖液中，加入100μgTRAIL，在30℃氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下反應(yīng)48h。用截留分子量為8000的透析袋透析72h，低溫冷凍干燥，獲得智能型納米靶向載體PCP-SS-T。PCP-SS-T納米微球粒徑分布均勻，平均粒徑為150-197nm。siRNA包封率為89.3％，在谷胱甘肽的濃度為2mM，pH為5.0的PBS中8小時(shí)的釋放量達(dá)到72.4％。實(shí)施例3本實(shí)施例按以下步驟制備負(fù)載DOX和siRNA的PCP-SS-T：a、按照實(shí)施例1的a步驟制備CaP微粒。b、取10mgCaP微粒添加5ml去離子水，另取10mg改性活化的PEI-CS共聚物和溶于10mLDMSO，加入100μgsiRNA和1mgDOX，將CaP乳濁液緩慢滴入到PEI-CS溶液中，25℃條件下不斷攪拌8h，10000rpm離心30min，棄上清，冷凍干燥，獲得負(fù)載siRNA和DOX的PCCP微粒。c、取10mgPCCP微粒轉(zhuǎn)移到10mL濃度為5mg/mL的MSDS溶液中，向溶液中緩慢滴加2mL(濃度10％，m/v)EDC·HCl水溶液和2mL(濃度10％，m/v)NHS，室溫反應(yīng)，加入10mg胱氨二鹽酸鹽，不斷攪拌，40℃氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下反應(yīng)6h，將控釋元件組裝到載藥核心上。d、取10mg上述產(chǎn)物加入到含有10mL濃度為0.1mmol/LEDTA的中性磷酸緩沖液中，添加100μgTRAIL，在30℃氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下反應(yīng)48h。用截留分子量為8000的透析袋透析72h，低溫冷凍干燥，獲得智能型納米靶向載體PCCP-SS-T。檢測結(jié)果顯示，PCCP-SS-T納米微球粒徑分布均勻，平均粒徑為214-299nm。siRNA包封率為84.9％，DOX包封率為85.2％。在谷胱甘肽的濃度為2mM，pH為5.0的PBS中8小時(shí)siRNA的釋放量達(dá)到63.1％，DOX達(dá)到71.4％。