本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種莪術(shù)油及其用途和藥物制劑。

本發(fā)明所述的莪術(shù)油是以溫莪術(shù)為原料獲得的莪術(shù)油，溫莪術(shù)種植基地包括但不限于海南省。

背景技術(shù)：

莪術(shù)為姜科植物，分為廣西莪術(shù)、蓬莪術(shù)、溫莪術(shù)，產(chǎn)于廣西、江西、四川、浙江及海南等省。莪術(shù)油是從莪術(shù)干燥根莖中提取的揮發(fā)油，中醫(yī)理論認(rèn)為莪術(shù)油具有行氣破血、消積止痛的功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明莪術(shù)油還具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤等功效。莪術(shù)油的化學(xué)成分較為復(fù)雜，大多數(shù)為倍半萜類(lèi)化合物，沸點(diǎn)高而且具有熱敏性，高溫下容易發(fā)生氧化、分解或轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

莪術(shù)油經(jīng)過(guò)廣泛的臨床應(yīng)用，證實(shí)其具有高效、低毒的特點(diǎn)且對(duì)多種疾病有效。莪術(shù)油制劑在宮頸癌、肝癌及心血管疾病治療方面均取得了令人滿意的療效。臨床使用的莪術(shù)油制劑一般包括莪術(shù)油注射液、莪術(shù)油葡萄糖注射液、復(fù)方莪術(shù)油栓劑、復(fù)方莪術(shù)油軟膠囊等。

莪術(shù)油作為傳統(tǒng)的活血化瘀中藥近年來(lái)逐漸引起了醫(yī)藥界的重視，并在其資源、植化、藥理、制劑、臨床等方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究，證實(shí)莪術(shù)油是一個(gè)藥理活性強(qiáng)、高效、安全的藥物。腫瘤和心 血管疾病是目前兩大醫(yī)學(xué)難題，同時(shí)也帶來(lái)了兩個(gè)具有廣闊拓展空間的藥品市場(chǎng)。莪術(shù)油的抗腫瘤和抗血栓活性及臨床上的確切療效，再加上其抗病毒和抗菌活性，都極大地預(yù)示著莪術(shù)油將會(huì)在未來(lái)的藥品市場(chǎng)占據(jù)一席之地?？偟膩?lái)說(shuō)，莪術(shù)油是一個(gè)很有發(fā)展前途的藥物，隨著今后對(duì)它的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究，莪術(shù)油將會(huì)在我國(guó)的新藥創(chuàng)制體系中大放異彩。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于上述原因，申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)多年研究，得到一種新的莪術(shù)油，該莪術(shù)油中莪術(shù)倍半萜類(lèi)有效部位含量大于等于40％且小于等于75％，其中呋喃二烯含量大于等于8％小于等于18％，吉馬酮含量大于等于5％小于等于10％，莪術(shù)二酮含量大于等于10％小于等于20％；莪術(shù)油中含有莪術(shù)烯和桉油精，其中莪術(shù)烯含量大于等于15％小于等于35％，其中桉油精的含量大于等于5％小于等于21％；研究表明，本發(fā)明得到的莪術(shù)油具有更好的抗氧化作用；本發(fā)明得到的新莪術(shù)油可以作為藥物原料使用。

本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

一種莪術(shù)油，莪術(shù)油含有莪術(shù)倍半萜類(lèi)含量大于等于40％且小于等于75％，其中莪術(shù)倍半萜為呋喃二烯、莪術(shù)二酮、吉馬酮和莪術(shù)烯。

一種莪術(shù)油，莪術(shù)油含有莪術(shù)倍半萜類(lèi)含量大于等于50％且小于等于75％，其中莪術(shù)倍半萜為呋喃二烯、莪術(shù)二酮、吉馬酮和莪術(shù)烯。

其中呋喃二烯含量大于等于8％小于等于18％，吉馬酮含量大于等于5％小于等于10％，莪術(shù)二酮含量大于等于10％小于等于20％。

其中莪術(shù)油中莪術(shù)烯含量大于等于15％小于等于35％。

其中莪術(shù)油中含有桉油精，桉油精的含量大于等于5％小于等于21％。

莪術(shù)油中呋喃二烯、莪術(shù)二酮、吉馬酮和莪術(shù)烯含量大于等于40％小于等于75％，其中呋喃二烯大于等于8％小于等于18％，吉馬酮含量大于等于5％小于等于10％，莪術(shù)二酮含量大于等于10％小于等于20％；莪術(shù)油中含有莪術(shù)烯和桉油精，其中莪術(shù)烯含量大于等于15％小于等于35％，其中桉油精的含量大于等于5％小于等于21％。

莪術(shù)油中呋喃二烯、莪術(shù)二酮、吉馬酮和莪術(shù)烯含量大于等于50％小于等于75％，其中呋喃二烯含量大于等于8％小于等于18％，吉馬酮含量大于等于5％小于等于10％，莪術(shù)二酮含量大于等于10％小于等于20％；莪術(shù)油中含有莪術(shù)烯和桉油精，其中莪術(shù)烯含量大于等于15％小于等于30％，其中桉油精的含量大于等于7％小于等于21％。

以莪術(shù)油為原料制備的藥物制劑。

其中藥物制劑包括眼耳鼻喉、外陰、陰道、直腸、肛周、皮膚、粘膜等外用制劑，或者片劑、膠囊、顆粒劑等口服制劑，或者注射劑等。

其中藥物制劑包括：滴眼劑、滴耳劑、洗劑、陰道栓劑、直腸 栓劑，軟膏劑、膠囊劑、軟膠囊劑、片劑、泡騰片、顆粒劑、口服液、凝膠劑、膜劑、泡沫劑等外用或口服制劑、或注射劑。

其中藥物制劑原料為莪術(shù)油為164重量份，冰片為150重量份。

所述藥物制劑在制備預(yù)防和/或治療人乳頭瘤病毒感染的藥物中的應(yīng)用。

所述藥物制劑在預(yù)防和/或治療各種病毒、細(xì)菌、霉菌、衣原體、支原體、滴蟲(chóng)等感染、眼耳鼻喉感染、外陰炎、各種陰道炎、混合感染性陰道炎、皮膚感染、粘膜感染、痔瘡感染、便秘、宮頸炎、附件炎、CIN I-CINIII、宮頸癌、抗氧化等藥物中的應(yīng)用。

上述所述的莪術(shù)油的制備方法包括但不限于為：

取莪術(shù)，洗凈、切片，55-90℃烘成含水量40％-60％，粉碎成粒度為5-15mm莪術(shù)顆粒；取莪術(shù)顆粒置提取罐中，密閉，通入水蒸氣提取24-40小時(shí)，收集油水分離器中的揮發(fā)油，加入3％-10％揮發(fā)油重量的氯化鈉或無(wú)水硫酸鈉，攪拌，靜置分離，取上清液、得莪術(shù)油。

本發(fā)明新得到的莪術(shù)油，是在前處理中采用低于100℃的干燥方法，并且使莪術(shù)含水量降低到40％-60％，再進(jìn)行蒸餾，蒸餾后采用加入鹽精制的方法，得到新的莪術(shù)油。

本發(fā)明所述的莪術(shù)油是以溫莪術(shù)為原料獲得的莪術(shù)油，產(chǎn)地包括但不限于海南省。

本發(fā)明莪術(shù)油具有現(xiàn)有技術(shù)的藥理活性。

本發(fā)明莪術(shù)油為中藥領(lǐng)域的“有效部位”概念。

所謂中藥有效部位，是指當(dāng)一味中藥或復(fù)方中藥提取物中的一類(lèi)或幾類(lèi)化學(xué)成分的含量達(dá)到總提取物的50％以上，而且一類(lèi)或幾類(lèi)已知化學(xué)成分被認(rèn)為是有效成分，該一類(lèi)或幾類(lèi)成分的混合體即被認(rèn)為是有效部位。

呋喃二烯：CAS號(hào)：19912-61-9；吉馬酮：CAS號(hào)：6902-91-6；莪術(shù)二酮：CAS號(hào)：13657-68-6；莪術(shù)烯：CAS號(hào)：17910-09-7；桉油精：CAS號(hào)：470-82-6。

上述所述的莪術(shù)油有效部位，可以按照本發(fā)明的水蒸氣蒸餾的方法制備得到，也可以以符合藥典標(biāo)準(zhǔn)的莪術(shù)油為原料，按照制備液相的方法制備得到：

液相色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，梯度為：0～20min是等比例的把A60％和B40％變換成A95％和B5％，21～35min維持A95％和B5％；檢測(cè)波長(zhǎng)為216nm。

本發(fā)明下述試驗(yàn)，是在多次創(chuàng)造性試驗(yàn)基礎(chǔ)上，針對(duì)本發(fā)明所要保護(hù)的技術(shù)方案進(jìn)行的結(jié)論性試驗(yàn)。

一、抗氧化作用

試驗(yàn)藥物：

試驗(yàn)1組：莪術(shù)油：其中呋喃二烯含量17.8％，吉馬酮含量6.4％，莪術(shù)二酮含量15.7％；莪術(shù)油中含有莪術(shù)烯和桉油精，其中莪術(shù)烯含量9.4％，其中桉油精的含量4.6％。

制備方法：取莪術(shù)，洗凈、切片，55℃烘成含水量7.8％，粉碎成粒度為10mm莪術(shù)顆粒；取莪術(shù)顆粒置提取罐中，密閉，通入水蒸氣提取26小時(shí)，收集油水分離器中的揮發(fā)油，得莪術(shù)油。

試驗(yàn)2組：莪術(shù)油：其中呋喃二烯含量15.9％，吉馬酮含量7.5％，莪術(shù)二酮含量15.6％；莪術(shù)油中含有莪術(shù)烯和桉油精，其中莪術(shù)烯含量11.7％，其中桉油精的含量4.9％。

制備方法：取莪術(shù)，洗凈、切片65℃烘成含水量37.4％，粉碎成粒度為10mm莪術(shù)顆粒；取莪術(shù)顆粒置提取罐中，密閉，通入水蒸氣提取28小時(shí)，收集油水分離器中的揮發(fā)油，得莪術(shù)油。

試驗(yàn)3組：莪術(shù)油：呋喃二烯含量14.1％，吉馬酮含量7.6％，莪術(shù)二酮含量16.5％；莪術(shù)油中含有莪術(shù)烯和桉油精，其中莪術(shù)烯含量15.1％，其中桉油精的含量5.0％。

制備方法：取莪術(shù)，洗凈、切片，70℃烘成含水量40％，粉碎成粒度為10mm莪術(shù)顆粒；取莪術(shù)顆粒置提取罐中，密閉，通入水蒸氣提取32小時(shí)，收集油水分離器中的揮發(fā)油，加入3％揮發(fā)油重量的氯化鈉，攪拌，靜置分離，取上清液，得莪術(shù)油。

試驗(yàn)4組：莪術(shù)油：呋喃二烯含量13.7％，吉馬酮含量8.9％，莪術(shù)二酮含量18.9％；莪術(shù)油中含有莪術(shù)烯和桉油精，其中莪術(shù)烯含量25.3％，其中桉油精的含量14.7％。

制備方法：取莪術(shù)，洗凈、切片，85℃烘成含水量50％，粉碎成粒度為10mm莪術(shù)顆粒；取莪術(shù)顆粒置提取罐中，密閉，通入 水蒸氣提取38小時(shí)，收集油水分離器中的揮發(fā)油，加入6％揮發(fā)油重量的氯化鈉，攪拌，靜置分離，取上清液，得莪術(shù)油。

試驗(yàn)5組：莪術(shù)油：其中呋喃二烯含量11.8％，吉馬酮含量9.9％，莪術(shù)二酮含量19.5％；莪術(shù)油中含有莪術(shù)烯和桉油精，其中莪術(shù)烯含量27.8％，其中桉油精的含量20.4％。

取莪術(shù)，洗凈、切片，90℃烘成含水量60％，粉碎成粒度為15mm莪術(shù)顆粒；取莪術(shù)顆粒置提取罐中，密閉，通入水蒸氣提取40小時(shí)，收集油水分離器中的揮發(fā)油，加入10％揮發(fā)油重量無(wú)水硫酸鈉，攪拌，靜置分離，取上清液，得莪術(shù)油。

含量檢測(cè)方法：(中國(guó)藥典2010年版一部附錄VI D)測(cè)定。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為216nm。理論板數(shù)按莪術(shù)二酮峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

對(duì)照品溶液的制備取莪術(shù)二酮、呋喃二烯、吉馬酮、莪術(shù)烯、桉油精對(duì)照品適量，精密稱定，加無(wú)水乙醇制成每1ml含莪術(shù)二酮35μg、呋喃二烯50μg、吉馬酮20μg、莪術(shù)烯20μg、桉油精10μg的混合溶液，即得。

供試品溶液的制備取本品0.1g，精密稱定，置50ml量瓶中， 加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各5μ1，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

試驗(yàn)動(dòng)物：BALB/C小鼠，雌雄各半，18-22g。

藥物配制：取上述莪術(shù)油，加入食用色拉油，配制成5mg/10mL，備用。

試驗(yàn)方法：取小鼠，隨機(jī)分組(空白對(duì)照組、市售莪術(shù)油組、試驗(yàn)1組至試驗(yàn)5組)，每組20只，雌雄各半，各組灌胃給藥，給藥量為1ml(5mg/kg)，每天一次，空白對(duì)照組給予生理鹽水1ml，連續(xù)給藥13天，斷頭取血，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，測(cè)定方法按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行；統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用t檢驗(yàn)。

試驗(yàn)結(jié)果：見(jiàn)表1。

表1不同莪術(shù)油抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

注：與空白對(duì)照組比較**P＜0.01；與試驗(yàn)2組比較##P＜0.01，#P＜0.05。

試驗(yàn)結(jié)論：上述試驗(yàn)表明，隨著莪術(shù)烯和桉油精的含量的增加，其抗氧化效果增加，而莪術(shù)烯含量大于15％、桉油精含量大于5％的莪術(shù)油其抗氧化效果顯著增加，與試驗(yàn)2組有顯著差異或極顯著差異，說(shuō)明本發(fā)明新莪術(shù)油具有重要意義。

二、其他藥理學(xué)試驗(yàn)

莪術(shù)油：呋喃二烯含量14.1％，吉馬酮含量7.6％，莪術(shù)二酮含量16.5％；莪術(shù)油中含有莪術(shù)烯和桉油精，其中莪術(shù)烯含量15.1％，其中桉油精的含量5.0％。

制備方法：取莪術(shù)，洗凈、切片，70℃烘成含水量40％，粉碎成粒度為10mm莪術(shù)顆粒；取莪術(shù)顆粒置提取罐中，密閉，通入水蒸氣提取40小時(shí)，收集油水分離器中的揮發(fā)油，加入3％揮發(fā)油重量的氯化鈉，攪拌，靜置分離，取上清液，得莪術(shù)油。

試驗(yàn)藥①：上述方法得到的莪術(shù)油。

試驗(yàn)藥②：將上述方法得到莪術(shù)油和冰片制成的栓劑(每枚栓劑含莪術(shù)油164mg，冰片150mg)

(一)抗人乳頭瘤病毒試驗(yàn)

試驗(yàn)藥：試驗(yàn)藥②將上述方法得到莪術(shù)油和冰片制成的栓劑(每枚栓劑含莪術(shù)油164mg，冰片150mg)

細(xì)胞系

CaSki細(xì)胞系，HPV16陽(yáng)性的人宮頸癌細(xì)胞株，H8細(xì)胞系，人宮頸鱗狀上皮永生化細(xì)胞系，均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物物理室提供。

實(shí)驗(yàn)方法

1、細(xì)胞培養(yǎng)

CaSki細(xì)胞在含5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，H8細(xì)胞在含2％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，其所含試驗(yàn)藥37℃，5％CO₂飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。

2、藥物濃度的選擇

將1枚受試藥溶解于44ml無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中，其所含試驗(yàn)藥濃度為3.95×10⁴mg/L待溶液澄清后，孔徑為22μm的濾器過(guò)濾除菌，分裝后4℃避光保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組最終加入的試驗(yàn)藥濃度分別為19.77mg/L，39.55mg/L，79.09mg/L，對(duì)照組則加入等量的培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞形態(tài)觀察

活細(xì)胞照相：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)板，每孔10×10⁴個(gè)細(xì)胞，在各實(shí)驗(yàn)組的6孔培養(yǎng)板中每孔放置一片蓋玻片，形成附有細(xì)胞的蓋片，d2細(xì)胞貼壁后更換為含藥培養(yǎng)基，培養(yǎng)3d后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

4、四甲基偶氮唑藍(lán)比色法檢測(cè)不同濃度的試驗(yàn)藥液對(duì)CaSki和H8細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況

將細(xì)胞接種于六板96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔3000個(gè)細(xì)胞，d2更 換為含藥培養(yǎng)基，所含試驗(yàn)藥濃度分別為19.77mg/L，39.55mg/L，79.09mg/L，并設(shè)正常對(duì)照，每個(gè)濃度平行5孔。37℃，5％CO₂飽和濕度下培養(yǎng)24h，后每孔加入5mg/ml四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)22μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜150μl，37℃培養(yǎng)20min，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，波長(zhǎng)492nm，連續(xù)6d，觀察其生長(zhǎng)情況。

5、細(xì)胞周期檢測(cè)

在六孔培養(yǎng)板中以含不同濃度藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)5d，每個(gè)藥物濃度平行3孔，收集細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，PBS清洗2次，預(yù)冷70％乙醇固定，4℃保存待檢。經(jīng)0.01％RNA酶處理細(xì)胞漿RNA，50mg/L碘化丙錠DNA染色30min后，經(jīng)300目篩過(guò)濾除去成團(tuán)細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期中不同時(shí)相的細(xì)胞百分比和細(xì)胞凋亡率。每份標(biāo)本測(cè)定5000個(gè)細(xì)胞。根據(jù)DNA含量區(qū)分細(xì)胞所處細(xì)胞周期時(shí)相。

6、mRNA表達(dá)檢測(cè)

收集培養(yǎng)d5的細(xì)胞，TRIZOL處理后提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴(kuò)增HPV16E6、E7，同時(shí)擴(kuò)增β-actin作為內(nèi)參照，HPV16E6、E7引物(616bp)：上游5`-TGACTTTGCTTTTCGGGATT3`，下游：5`-GAGAACAGATGGGGCACAC-3`。β-actin(552bp)引物序列：上游：5`-ATCATGTTTGA-GACCTTCAACACC-3`，下游：5`-CATGGTGGT-GCCGCCGCCAGACAG-3`。擴(kuò)增參數(shù)為：94℃遇變性5min，94℃變性45s，50℃復(fù)性45s，72℃延伸1min，擴(kuò)增30個(gè) 循環(huán)；72℃延伸5min；PCR產(chǎn)物45℃保存。2％瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，電壓40V。應(yīng)用Scion Image 4.0(NIH軟件進(jìn)行電泳條帶圖像灰度值的半定量分析。待測(cè)基因電泳條帶灰度比值＝待測(cè)條帶灰度值/同一份標(biāo)本內(nèi)參照β-actin條帶灰度值。每個(gè)加藥樣本至少檢測(cè)3次。

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)、t檢驗(yàn)等。

結(jié)果

試驗(yàn)藥②作用下細(xì)胞周期和凋亡率

試驗(yàn)藥作用于H8細(xì)胞，G1期細(xì)胞增加，G2期略細(xì)胞減少，但是均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。栓劑作用于CaSki細(xì)胞，G1期細(xì)胞增加(P＜0.05)，G2期細(xì)胞減少(P＜0.05)，S期細(xì)胞減少(P＜0.05)，使細(xì)胞阻滯于G1期。試驗(yàn)藥作用于H8細(xì)胞，加藥組凋亡率略增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，(見(jiàn)表2)。栓劑作用于CaSki細(xì)胞，加藥組雖無(wú)明顯的凋亡峰，但有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)(見(jiàn)表3)

表2試驗(yàn)藥②作用下H8細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡率

表3試驗(yàn)藥②作用下CaSki細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡率

表4RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶灰度值

試驗(yàn)2：莪術(shù)油體外抗腫瘤篩選試驗(yàn)研究

試驗(yàn)藥：試驗(yàn)藥①(上述方法得到的莪術(shù)油)

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：

人直腸癌細(xì)胞株(HT-29)、人結(jié)直腸癌細(xì)胞株(DLD-1)：安普澤生物技術(shù)有限公司惠贈(zèng)，來(lái)源：ATCC(美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心)。

人肺癌細(xì)胞(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)NCI-H292、人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞95-D、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460[H460]、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H1650、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人肝癌細(xì)胞Hep G2、宮頸癌細(xì)胞HeLa、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、人惡性黑色素瘤細(xì)胞A-375、人胃癌細(xì)胞(未分化)HGC-27、人胃癌細(xì)胞MGC80-3：來(lái)源中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

實(shí)驗(yàn)方法：

調(diào)整細(xì)胞密度為5×10⁵～8×10⁵個(gè)/mL，96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔加細(xì) 胞懸液100μL(每孔約5×10⁴～8×10⁴個(gè))。于37℃體積分?jǐn)?shù)5％的CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中。試驗(yàn)藥①溶解于培養(yǎng)基中，配制成7檔濃度組(使其終濃度為6400μg/ml、3200μg/ml、1600μg/ml、800μg/ml、400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml)。每孔試藥加100μL；陰性對(duì)照組只加試劑不加藥，每組樣品設(shè)6個(gè)復(fù)孔。與藥物作用48h后，每孔加入20μL MTT(終濃度0.5mg/ml)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄上清，每孔加入150μL DMSO，搖床搖勻至結(jié)晶全部溶解，酶聯(lián)儀于測(cè)定波長(zhǎng)為490nm，將各加試液孔均值(T)與對(duì)照孔值(C)比較，以下列公式計(jì)算出各濃度組的百分抑制率[抑制率＝(1-T/C)×100％]，按IC₅₀計(jì)算軟件計(jì)算細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)；實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)均輸入EXCEL2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組計(jì)量數(shù)據(jù)均要計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行組間比較之前先進(jìn)行組間方差分析(F-test)，當(dāng)組間方差齊同時(shí)，組間比較采用Student-T檢驗(yàn)(非配對(duì)的T檢驗(yàn))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組間方差不齊時(shí)，采用校正的Student-T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)(表5)

表5

在本實(shí)驗(yàn)研究條件下，試驗(yàn)藥對(duì)肺癌、肝癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、胃癌和人黑色素瘤都有很強(qiáng)的抑制和殺傷效應(yīng)，IC₅₀在162.2～657.3μg/ml，其中對(duì)宮頸癌細(xì)胞(Hela)作用最強(qiáng)，IC₅₀為162.2±2.56μg/ml，且抑制率隨著藥物濃度的增加而增加，提示試驗(yàn)藥有較強(qiáng)細(xì)胞毒作用和顯著的濃度依賴，并且對(duì)宮頸癌的抑制作用最強(qiáng)。表明本方法制得的莪術(shù)油對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞有一定的抑制特異性和不同的敏感性。

試驗(yàn)3：體外抗真菌試驗(yàn)

試驗(yàn)藥：試驗(yàn)藥①(上述方法得到的莪術(shù)油)

對(duì)照藥：克霉唑陰道片(生產(chǎn)廠家：廣西萬(wàn)山紅藥業(yè)有限公司)

菌種

白色念珠球菌(含質(zhì)控株ACTT10231，共30株)，光滑念珠球菌(30株)，質(zhì)控株購(gòu)自廣東微生物菌種保藏中心，臨床株由海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科和海南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

試驗(yàn)方法

最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定方法：采用倍比稀釋法制成含藥平板，將每種受試菌液，滴入相應(yīng)平板，待干后再把平板倒置，然后放入培養(yǎng)箱35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。在無(wú)藥平板接種各菌株培養(yǎng)作陽(yáng)性對(duì)照。

最小殺菌濃度(MBC)測(cè)定方法：在無(wú)藥MH瓊脂平板底面玻璃用油筆畫(huà)上“#”，把每個(gè)平板分成12或16個(gè)區(qū)域(每個(gè)區(qū)域?qū)⑴囵B(yǎng)不同菌株)，并寫(xiě)上相應(yīng)菌株編號(hào)。受試菌在含藥MH肉湯培養(yǎng)了24h后，取出搖勻，用加樣槍吸取10ul，根據(jù)菌株編號(hào)，滴入無(wú)藥平板相應(yīng)編號(hào)的區(qū)域內(nèi)，待干后再把平板倒置，然后放入35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。陽(yáng)性對(duì)照區(qū)域標(biāo)“陽(yáng)”，接種無(wú)藥肉湯試管中菌株。

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6、表7

表6體外抗真菌試驗(yàn)的MIC測(cè)定結(jié)果

表7體外抗真菌試驗(yàn)的MBC測(cè)定結(jié)果

在本實(shí)驗(yàn)研究條件下，試驗(yàn)藥在體外有明顯的抗白色念珠球菌和光滑念珠球菌作用，其抗真菌活性與克霉唑陰道片無(wú)明顯差異

制備實(shí)施例

實(shí)施例1

莪術(shù)油：呋喃二烯含量14.1％，吉馬酮含量7.6％，莪術(shù)二酮含量16.5％；莪術(shù)油中含有莪術(shù)烯和桉油精，其中莪術(shù)烯含量15.1％，其中桉油精的含量5.0％。

制備方法：取莪術(shù)，洗凈、切片，70℃烘成含水量40％，粉碎成粒度為10mm莪術(shù)顆粒；取莪術(shù)顆粒置提取罐中，密閉，通入水蒸氣提取32小時(shí)，收集油水分離器中的揮發(fā)油，加入3％揮發(fā)油重量的氯化鈉，攪拌，靜置分離，取上清液，得莪術(shù)油。

實(shí)施例2

莪術(shù)油：呋喃二烯含量13.7％，吉馬酮含量8.9％，莪術(shù)二酮含量18.9％；莪術(shù)油中含有莪術(shù)烯和桉油精，其中莪術(shù)烯含量25.3％，其中桉油精的含量14.7％。

制備方法：取莪術(shù)，洗凈、切片，85℃烘成含水量50％，粉碎成粒度為10mm莪術(shù)顆粒；取莪術(shù)顆粒置提取罐中，密閉，通入水蒸氣提取38小時(shí)，收集油水分離器中的揮發(fā)油，加入6％揮發(fā)油重量的氯化鈉，攪拌，靜置分離，取上清液，得莪術(shù)油。

實(shí)施例3

莪術(shù)油：其中呋喃二烯含量11.8％，吉馬酮含量9.9％，莪術(shù)二酮含量19.5％；莪術(shù)油中含有莪術(shù)烯和桉油精，其中莪術(shù)烯含量27.8％，其中桉油精的含量大20.4％。

取莪術(shù)，洗凈、切片，90℃烘成含水量60％，粉碎成粒度為15mm莪術(shù)顆粒；取莪術(shù)顆粒置提取罐中，密閉，通入水蒸氣提取40小時(shí)，收集油水分離器中的揮發(fā)油，加入10％揮發(fā)油重量無(wú)水硫酸鈉，攪拌，靜置分離，取上清液，得莪術(shù)油。

上述實(shí)施例莪術(shù)油具有現(xiàn)有技術(shù)的藥理活性，并比現(xiàn)有技術(shù)的莪術(shù)油具有更好的藥理作用；

上述實(shí)施例莪術(shù)油為中藥領(lǐng)域的“有效部位”概念。

所謂中藥有效部位，是指當(dāng)一味中藥或復(fù)方中藥提取物中的一類(lèi)或幾類(lèi)化學(xué)成分的含量達(dá)到總提取物的50％以上，而且一類(lèi)或幾 類(lèi)已知化學(xué)成分被認(rèn)為是有效成分，該一類(lèi)或幾類(lèi)成分的混合體即被認(rèn)為是有效部位。

呋喃二烯：CAS號(hào)：19912-61-9；吉馬酮：CAS號(hào)：6902-91-6；莪術(shù)二酮：CAS號(hào)：13657-68-6；莪術(shù)烯：CAS號(hào)：17910-09-7；桉油精：CAS號(hào)：470-82-6。

上述通過(guò)具體實(shí)施方式的描述對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。