海芋(Alocasia macrorrhiza(L.)SCHOTT)為天南星科植物海芋，其根莖為壯藥，生于山澗陰濕處，或樹旁溝邊、河邊。分布于廣東、廣西、四川等地。該植物能清熱、解毒、活血、消腫，治疔瘡、癰腫、丹毒，跌打損傷，慢性氣管炎、鉤端螺旋體病等疾病[有毒中藥藥性藥理及臨床研究應(yīng)用實(shí)用手冊(cè)，(1977年，上海人民出版社)，pp.302-303]。迄今為止，對(duì)海芋的研究很少，多見于一般藥效學(xué)報(bào)道。有關(guān)海芋的抗癌藥理活性很少報(bào)道，僅見侯學(xué)文從中分離得到一個(gè)凝集素，其對(duì)肺腺癌細(xì)胞株P(guān)18僅有很少殺傷能力。癌癥是當(dāng)今社會(huì)發(fā)病率高、死亡率高的一種頑痰，目前尚無治愈率較高的藥物的報(bào)道。本發(fā)明人在尋找中草藥抗癌活性成分過程中，發(fā)現(xiàn)海芋生物堿提取物具有很好的抗腫瘤活性，并且從中獲得多個(gè)具有抗癌活性的生物堿化合物。
本發(fā)明的目的在于提供一種抗癌新藥海芋木脂生物堿提取物的制備方法，其工藝簡(jiǎn)單實(shí)用，為海芋的應(yīng)用提供了廣泛的途徑。
本發(fā)明的目的是通過如下方案實(shí)現(xiàn)的：以海芋(Alocasia macrorrhiza(L.)SCHOTT)為原料，采用溶劑提取法、溶劑萃取法、樹脂吸附法、正相柱層析法等工藝中的一種或者多種工藝，并結(jié)舍濃縮干燥、冷凍干燥，噴霧干燥等常用干燥方法制備成海芋生物堿提取物，將制成的海芋提取物作為抗癌活性成分用于治療多種癌癥。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：工藝簡(jiǎn)單實(shí)用，抗癌療效好，并且無毒副作用。為尖尾芋應(yīng)用提供了廣泛的途徑。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)地描述。
實(shí)施例：
1.溶劑提取法/溶劑萃取法提取制備海芋生物堿提取物
1.海芋2kg用70％乙醇在90℃下回流，合并提取液，濃縮得到130g乙醇提取物。將乙醇提取物混懸于水中，用石油醚萃取脫脂，脫脂后經(jīng)濃縮干燥即可得到尖尾芋提取物，收率為70％
2.溶劑提取法/樹脂吸附法合用提取制備尖尾芋提取物
海芋1.0kg用70％乙醇在90℃下回流，合并提取液，濃縮得到130g乙醇提取物。乙醇提取物上AB-8型吸附樹脂柱，先用水、5％乙醇-水洗脫以除去色素和雜質(zhì)，而后用60％乙醇-水洗脫。其中60％乙醇-水洗脫部分減壓濃縮除乙醇，再經(jīng)冷凍干燥可得到尖尾芋提取物，收率為30％。
3.海芋提取物的體外抑瘤實(shí)驗(yàn)
3.1細(xì)胞株、試劑及儀器
人宮頸癌Hela細(xì)胞株購自中科院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)液，Gibco產(chǎn)品；胎牛血清，Gibco產(chǎn)品；胰蛋白酶，Gibco產(chǎn)品；DMSO溶液，Sigma公司；96孔板，Corning公司；Revco 3000培養(yǎng)箱，Thermo公司；Multishkan MK3酶標(biāo)儀，Thermo公司。
3.2腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法
人宮頸癌Hela細(xì)胞株用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為3℃，5％CO2濃度及飽和濕度。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用25％胰酶消化細(xì)胞，洗滌吹散細(xì)胞稀釋至106/ml，每孔100μL接種于96孔板，以備MTT實(shí)驗(yàn)。
3.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT法)
海芋生物堿提取物溶于DMSO溶液，取含1‰DMSO的尖尾芋提取物溶液，用含10％胎牛血清的DMEM溶液配成濃度分別為100、50、20、2μg/mL的尖尾芋提取物溶液，每孔100μL接種于96孔板，混勻，使尖尾芋提取物每孔終濃度分別達(dá)到50、25、10、1μg/mL，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)16、32、48h。每孔加入5mg/mLMTT溶液5μL，繼續(xù)培養(yǎng)5h，測(cè)定各孔吸光度。以不加任何處理的培養(yǎng)細(xì)胞為空白對(duì)照，以單用培養(yǎng)細(xì)胞作為陰性對(duì)照。每個(gè)濃度梯度均設(shè)置12個(gè)平行組，分別計(jì)算細(xì)胞抑制率。按照以下公式計(jì)算抑制率：
抑制率＝1-(實(shí)驗(yàn)組吸光度平均值/對(duì)照組吸光度平均值)×100％
結(jié)果見表1
表1海芋生物堿提取物對(duì)Hela細(xì)胞體外增殖的抑制作用
t檢驗(yàn)，*p＜0.05，**p＜0.01
結(jié)果表明：不同濃度，不同培養(yǎng)時(shí)間的海芋生物堿提取物可顯著抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖，提示其可能有一定的抗癌效果。