本發(fā)明涉及植物提取領(lǐng)域，具體涉及一種補(bǔ)血草提取物及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

1956年Harman提出了自由基衰老學(xué)說[Harman,D.Aging:A theory based on free radical and radiation chemistry.J.Gerontol.1956,11:289-300.]，其認(rèn)為過多的自由基是造成生物老化的重要原因。根據(jù)這一理論，體內(nèi)過量的活性氧自由基與不飽和脂肪酸作用產(chǎn)生丙二醛等物質(zhì)，丙二醛將與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)等作用生產(chǎn)褐色素，沉淀于皮膚便成為各種色斑。過量的自由基還能使皮膚內(nèi)的膠原纖維、彈性纖維發(fā)生交聯(lián)和變性、變脆、失去彈性，當(dāng)皮膚水分不足時，容易使彈性纖維斷裂，出現(xiàn)暗紋、細(xì)紋、皺紋等皮膚老化現(xiàn)象。此外，環(huán)境中的離子輻射以及諸如空氣污染與化學(xué)物質(zhì)等的環(huán)境污染物，也會使生物體內(nèi)不斷的產(chǎn)生自由基。例如環(huán)境中的紫外線會使皮膚真皮中的纖維母細(xì)胞及粒線體受到刺激，進(jìn)而釋放出超氧陰離子，而過量的超氧陰離子則會轉(zhuǎn)換成其它破壞性更強(qiáng)的自由基。雖然人體內(nèi)具有能夠維持氧化與抗氧化之間平衡狀態(tài)的抗氧化防御系統(tǒng)，用以減緩活性氧及自由基的產(chǎn)生，但若是長期過度的曝曬在陽光下，則人體內(nèi)大量產(chǎn)生的自由基會導(dǎo)致皮膚的抗氧化防御能力降低，造成皮膚的傷害，例如光老化、表皮皺紋、皮膚免疫力失調(diào)等。抗氧劑是具有捕捉自由基能力的物質(zhì)，可以清除皮膚中的活性自由基，減輕自由基引起的皮膚氧化應(yīng)激損傷，從而改善由氧化應(yīng)激等造成的皮膚老化。目前已知有維生素E、維生素C等生物體內(nèi)的清除自由基型抗氧化劑，另外也報(bào)道了植物來源的抗氧化劑如蓮花、梅果提取物等(專利文獻(xiàn)CN201110158540.9含有蓮花提取物和烏梅提取物作為有效成分而具有抗氧化活性的皮膚外用劑組合物)。

關(guān)于皮膚黑色素的形成，目前研究表明主要是由于黑素細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)引起，即酪氨酸在作為催化劑的酪氨酸酶的作用下，生成多巴醌，再通過酶的催化作用或非酶的氧化作用形成黑色素。關(guān)于抑制上述黑色素生成的美白活性物，通常以抑制酪氨酸酶活性為主要靶點(diǎn)。來源于植物提取物的酪氨酸酶抑制劑作為潛在的美白活性物，同時又具有安全性和對皮膚低刺激性的預(yù)期，目前已有各種開發(fā)的報(bào)道，例如專利文獻(xiàn)CN201310411195.4白蘞提取物美白功效的檢測方法；CN201310382406.6白木香果皮提取物在制備美白化妝品中的應(yīng)用。

皮膚老化的原因可以分為光老化和內(nèi)因引起的老化，UV暴露引起的光老化會引起皮膚彈性蛋白酶的活性增加。彈性蛋白酶(Elastase)分布于多種組織和細(xì)胞中，彈性蛋白酶活性增加可導(dǎo)致皮膚彈性纖維的水解，從而加速真皮內(nèi)膠原蛋白和彈性蛋白的分解，使皮膚失去彈性，出現(xiàn)皺紋等皮膚老化現(xiàn)象。目前已知有植物來源的抗老化活性物具有彈性蛋白酶抑制作用，如蓼藍(lán)(專利文獻(xiàn)CN200680023570.6皮膚外用劑)、香豌豆(專利文獻(xiàn)CN200680009020.9含有香豌豆提取物的化妝料)等。

補(bǔ)血草(Limonium sinense(Girard)Kuntze)是白花丹科(Plumbaginaceae)補(bǔ)血草屬(Limonium Mill.)補(bǔ)血草的花或者全草。補(bǔ)血草別名又叫情人草、一枝梅、海赤芍、白花玉錢香、中華補(bǔ)血草(《中國高等植物圖鑒》)。補(bǔ)血草的主要化學(xué)成分包括鞣質(zhì)、黃酮、花色素等，如楊梅樹皮苷、蕓香苷、楊梅樹皮素、槲皮素、四羥基黃酮等。補(bǔ)血草的主要藥理作用為消炎、止痛、活血、補(bǔ)血、調(diào)經(jīng)、止血等，于花初開時采集全草鮮用或干用?！吨袊参镏尽酚涊d了補(bǔ)血草是哈薩克傳統(tǒng)民族藥，補(bǔ)血草的根或全草在民間用于止血、收斂和利水。新疆植物志中草藥記載把情人草種在花盆作為家花。補(bǔ)血草因其花朵細(xì)小，干膜質(zhì)，色彩淡雅，觀賞時期長，是重要的配花材料。補(bǔ)血草植株很高，花枝很長，可以長久不凋謝，有紫、淡紫、玫瑰粉、藍(lán)、紅、白、黃各色品種，被稱為“勿忘我”，市場上的“勿忘我”鮮花、干花和花茶，并不是紫草科勿忘草屬的植物勿忘草(Myosotis silvatica Ehrh.ex Hoffm.)的 花，實(shí)際上都是補(bǔ)血草屬植物補(bǔ)血草(Limonium sinense(Girard)Kuntze)或是二色補(bǔ)血草(Limonium bicolor(Bag.)Kuntze)的花。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一種補(bǔ)血草提取物及其制備方法和用途。本發(fā)明的補(bǔ)血草提取物的制備方法簡單，制得的補(bǔ)血草提取物可以作為酪氨酸酶抑制劑、彈性蛋白酶抑制劑、抗氧化活性劑和抗老化活性劑的應(yīng)用；進(jìn)一步優(yōu)選在制備護(hù)膚品或化妝品中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種補(bǔ)血草提取物的制備方法，其采用下述方法中的任意一種，

方法一、包括下述步驟：將補(bǔ)血草與溶劑混合，提取，過濾，減壓脫除溶劑，即可；

方法二、包括下述步驟：

(1)將補(bǔ)血草與溶劑混合，提取，過濾，減壓脫除溶劑，即可得到補(bǔ)血草粗提物；

(2)將補(bǔ)血草粗提物溶解于水后，上樣到樹脂填充柱，依次用水和乙醇溶液洗脫，分別收集洗脫液，減壓脫除乙醇和水，即可。

其中，所述的補(bǔ)血草一般為補(bǔ)血草屬(Limonium Mill.)植物，較佳地為補(bǔ)血草屬補(bǔ)血草(Limonium sinense(Girard)Kuntze)、二色補(bǔ)血草(Limonium bicolor(Bag.)Kuntze)、喀什補(bǔ)血草(Limonium kaschgaricum(Rupr.)Ik.-Gal.)、大葉補(bǔ)血草(Limonium gmelinii(Willd.)Kuntze)、彎穗補(bǔ)血草(Limonium drepanostachyum Ik.-Gal.)、曲枝補(bǔ)血草(Limonium flexuosum(L.)Kuntze)、木本補(bǔ)血草(Limonium suffruticosum(L.)Kuntze)、灰桿補(bǔ)血草(Limonium roborowskii Ik.-Gal.)、煙臺補(bǔ)血草(Limonium franchetii(Debx.)Kuntze)、珊瑚補(bǔ)血草(Limonium coralloides(Tausch)Lincz.)、簇枝補(bǔ)血草(Limonium chrysocomum(Kar.&Kir.)Kuntze)、精河補(bǔ)血草(Limonium leptolobum(Regel)Kuntze)、繁枝補(bǔ)血草(Limonium myrianthum(Schrenk))、海芙蓉(Limonium wrightii(Hance)Kuntze)、細(xì)枝補(bǔ)血草(Limonium tenellum(Turcz.)Kuntze)、耳葉補(bǔ)血草(Limonium otolepis(Schrenk)Ktze.)和黃花補(bǔ)血草(Limonium aureum(L.)Hill)中的一種或多種，更佳地為補(bǔ)血草屬補(bǔ)血草(Limonium sinense(Girard)Kuntze)。

其中，步驟(1)中，所述的提取較佳地為超聲提取、攪拌提取或逆流循環(huán)提取，所述的超聲提取的時間較佳地為0.5～1.5小時，所述的攪拌提取的時間較佳地為1.5～2小時，所述的逆流循環(huán)提取的時間較佳地為0.3～1小時。

其中，步驟(1)中，所述的溶劑較佳地為體積百分比為60～80％的乙醇水溶液。

其中，所述的補(bǔ)血草與溶劑的體積質(zhì)量比較佳地為10～40mL/g。

其中，步驟(2)中，所述的乙醇溶液洗脫較佳地為依次用10％～30％乙醇水溶液、31％～50％乙醇水溶液、51％～70％乙醇水溶液、71％～90％乙醇水溶液和91％～99％乙醇水溶液進(jìn)行濃度梯度洗脫，更佳地為依次用20％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液、60％乙醇水溶液、80％乙醇水溶液和95％乙醇水溶液進(jìn)行濃度梯度洗脫；百分比為體積百分比。

其中，所述的補(bǔ)血草可為補(bǔ)血草全植株，包括補(bǔ)血草花和/或補(bǔ)血草全草。

其中，所述的樹脂可為本領(lǐng)域常規(guī)使用的大孔樹脂，較佳地為市售的D101樹脂或AB-8樹脂。

其中，所述的水較佳地為去離子水。

本發(fā)明還提供了由上述制備方法得到的補(bǔ)血草提取物，所述的補(bǔ)血草提取物較佳地為31％～50％乙醇水溶液洗脫得到的提取物，更佳地為40％乙醇水溶液洗脫得到的提取物；百分比為體積百分比。

本發(fā)明還提供了上述補(bǔ)血草提取物作為酪氨酸酶抑制劑、彈性蛋白酶抑制劑、抗氧化活性劑或抗老化活性劑的應(yīng)用；進(jìn)一步優(yōu)選在制備護(hù)膚品或化妝品中的應(yīng)用。

在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā) 明各較佳實(shí)例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明的補(bǔ)血草提取物的制備方法簡單，制得的補(bǔ)血草提取物可以作為非疾病診斷和/或治療用途的酪氨酸酶抑制劑、彈性蛋白酶抑制劑、抗氧化活性劑和抗老化活性劑的應(yīng)用，可以將補(bǔ)血草提取物配合在外用劑中，作為防止肌膚老化、維持年輕健康的肌膚狀態(tài)的抗老化劑使用。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。

除另有說明外，下述實(shí)施例中的百分比均為體積百分比。

實(shí)施例1

補(bǔ)血草提取物的制備

將100g市售的補(bǔ)血草全植株(補(bǔ)血草屬補(bǔ)血草(Limonium sinense(Girard)Kuntze)的花、莖葉和根)干燥后粉碎，與2000mL 70％乙醇溶液(v/v，本發(fā)明中所有乙醇溶液均為體積濃度)混合浸泡，超聲輔助提取1小時，過濾，濾液經(jīng)減壓脫除溶劑后，得到補(bǔ)血草粗提物20g。

取補(bǔ)血草粗提物，用去離子水溶解后，上樣到市售AB-8樹脂填充柱，依次用去離子水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇和95％乙醇梯度洗脫(百分比為體積百分比)，分別收集洗脫液，減壓脫除乙醇和水，稱重，分別得到水洗脫部位11g、20％乙醇洗脫部位2.0g、40％乙醇洗脫部位2.2g、60％乙醇洗脫部位2.1g、80％乙醇洗脫部位1.1g和95％乙醇洗脫部位1.0g的補(bǔ)血草提取物。

實(shí)施例2

補(bǔ)血草提取物中總黃酮含量的測定

將實(shí)施例1制得的補(bǔ)血草提取物，按照中華人民共和國藥典(2010版)方法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，測定補(bǔ)血草提取物中總黃酮含量。

測定步驟為：1)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分別置25ml量瓶中，各加30％乙醇至6.0ml，加5％亞硝酸鈉溶液(質(zhì)量百分比濃度)1ml?；靹?，放置6分鐘，再加10％硝酸鋁溶液(質(zhì)量百分比濃度)1ml，搖勻，放置6分鐘。加氫氧化鈉試液10ml，再加30％乙醇至刻度，搖勻，放置15分鐘，以相應(yīng)試劑為空白，用紫外-可見分光光度法，在510nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2)取實(shí)施例1制得的各洗脫部位的補(bǔ)血草提取物完全溶于去離子水，配制成1mg/mL水溶液。將一定量樣品置于25ml容量瓶中，其它按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備步驟，自“加5％亞硝酸鈉溶液1ml”起，操作同步驟1)，依次測定吸光度，同時取樣品溶液3ml，除不加氫氧化鈉試液外，其余同上操作，作為空白，計(jì)算補(bǔ)血草提取物中總黃酮含量(以蘆丁計(jì))，如下表1所示。

表1 補(bǔ)血草提取物總黃酮含量

由表1可見，補(bǔ)血草經(jīng)提取后獲得的粗提物含有較多的黃酮類化合物，黃酮是補(bǔ)血草的主要活性成分，經(jīng)吸附樹脂分離后，補(bǔ)血草40％乙醇洗脫部位富集的黃酮最多，比粗提物中黃酮含量有很大提高，其生物活性也相應(yīng)增 強(qiáng)。

實(shí)施例3

酪氨酸酶抑制活性的檢測

將實(shí)施例1制備的各洗脫部位的補(bǔ)血草提取物完全溶于去離子水，配制成1.0mg/mL水溶液，即樣品溶液，用于測定酪氨酸酶抑制活性，以熊果苷為參照物。

測定步驟為：磷酸鹽緩沖溶液(pH6.8，30mM)70μL、1.66mM酪氨酸溶液80μL、樣品溶液80μL混合均勻，在37℃恒溫水槽中溫育5分鐘以上，加入酪氨酸酶溶液(125U/ml)10μL，在37℃恒溫10min后，用酶標(biāo)儀測定475nm波長的吸光度A₄₇₅。用去離子水替換樣品水溶液，作為參比溶液同樣測定吸光度，結(jié)果見表2。

酪氨酸酶活性抑制率計(jì)算公式為：抑制率(％)＝(A₀-(A₄₇₅-B))/A₀×100％，其中A₀是參比溶液的吸光度，A₄₇₅是樣品溶液的吸光度，B是樣品空白溶液的吸光度。

表2 酪氨酸酶抑制活性的測定結(jié)果

由表2可見，補(bǔ)血草經(jīng)提取后獲得的粗提物具有對酪氨酸酶活性的抑制作用，經(jīng)吸附樹脂分離后，所得的乙醇洗脫部位均能實(shí)現(xiàn)對酪氨酸酶活性的抑制，并且比粗提物的抑制作用大大增強(qiáng)。其中補(bǔ)血草40％乙醇洗脫部位對酪氨酸酶活性的抑制作用最強(qiáng)。

實(shí)施例4

抗氧化活性的檢測

按實(shí)施例1方法制備得到的補(bǔ)血草粗提物和提取物，用DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)法測定其清除自由基抗氧化活性。測定步驟為：將補(bǔ)血草提取物分別用去離子水配制成0.01mg/mL水溶液，移取2mL于10mL具塞試管中，加入2mL DPPH乙醇溶液(2×10^-4mol/L)，充分混勻，室溫靜置30min后用分光光度計(jì)測定517nm波長的吸光度A₅₁₇；同時測定2mL提取物溶液與2mL乙醇混合后的吸光度A₀，2mL水與2mL DPPH乙醇溶液混合后的吸光度C以及2mL水與2mL乙醇溶液混合后的吸光度C₀。平行測定三次，取平均值，根據(jù)以下公式計(jì)算自由基清除率，清除率越大，說明提取物的抗氧化能力越強(qiáng)。

自由基清除率(％)＝[1-(A₅₁₇-A₀)/(C-C₀)]×100％

表3 DPPH法清除自由基活性的檢測結(jié)果

由表3可見，補(bǔ)血草經(jīng)提取后獲得的粗提物，能實(shí)現(xiàn)對DPPH自由基的清除作用，經(jīng)吸附樹脂分離后，所得乙醇洗脫部位均能實(shí)現(xiàn)對DPPH自由基的清除，其中補(bǔ)血草40％乙醇洗脫部位與粗提物的清除作用相比較有很大的提高，其對自由基的半清除濃度SC₅₀為0.005mg/mL。

實(shí)施例5

按照實(shí)施例1制備的補(bǔ)血草提取物，溶于去離子水，配制成1.0mg/mL水溶液，即為樣品溶液，用于測定彈性蛋白酶抑制活性。

測定方法按照文獻(xiàn)(Am.J.Pharmacol.Toxicol.,2009,4,127-129)方法進(jìn)行，測定步驟為：在96孔板中加入10μL樣品溶液和130μL含有1.015mM反應(yīng)底物Succ-Ala-Ala-Ala-p-硝基酰替苯胺的0.1M Tris-HCl緩沖溶液(pH8.0)，在25℃下溫育5分鐘，加入15μL彈性蛋白酶溶液(0.5U/mL)，繼續(xù)在25℃下溫育30min，然后用酶標(biāo)儀測定410nm波長的吸光度A₄₁₀。用去離子水替換樣品水溶液，作為參比溶液同樣測定吸光度，結(jié)果見表4。

彈性蛋白酶活性抑制率計(jì)算公式為：抑制率(％)＝(A₀-(A₄₁₀-B))/A₀×100％，其中A₀是參比溶液的吸光度，A₄₁₀是樣品溶液的吸光度，B是樣品空白溶液的吸光度。

表4 彈性蛋白酶活性抑制的測定結(jié)果

由表4可知，在本發(fā)明中使用的補(bǔ)血草提取物均具有抑制彈性蛋白酶作用，其中補(bǔ)血草40％乙醇洗脫部位抑制彈性蛋白酶作用最強(qiáng)，因此可以將補(bǔ)血草提取物配合在外用劑中，作為防止肌膚老化、維持年輕健康的肌膚狀態(tài)的抗老化劑使用。

實(shí)施例6

抗老化活性測試

按照實(shí)施例1制備的補(bǔ)血草40％乙醇洗脫部位用去離子水配制成質(zhì)量百分比為0.02％溶液，加入到人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中，以不含樣品的去離子水為空白對照。培養(yǎng)48小時后，隨機(jī)取一部分細(xì)胞樣本，將細(xì)胞染色后，用酶標(biāo)儀測定475nm處吸光度，評估對人成纖維細(xì)胞的增殖作用，空白對照的增殖率為100％，若增殖率高于100％為對細(xì)胞有增殖作用。取剩下的細(xì)胞樣本，用I型膠原蛋白測定試劑盒測定膠原蛋白的生成，空白對照的增加率為100％，若增加率大于100％為有促進(jìn)膠原蛋白生成作用。

表5 抗老化活性測試

由表5可知，在空白對照與補(bǔ)血草提取物之間觀察到了抗老化活性統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，顯示在本發(fā)明中使用的補(bǔ)血草40％乙醇洗脫部位對人成纖維細(xì)胞具有良好的增殖作用，具有促進(jìn)I型膠原蛋白生成的活性。因此，可以將補(bǔ)血草提取物配合在皮膚外用劑中，作為防止肌膚老化、維持年輕健康的肌膚狀態(tài)的抗老化劑使用。