鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii，Ab)噬菌體及其應(yīng)用，屬于微生物工程領(lǐng)域。分離出的噬菌體單體命名為SWH-Ab-1，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌具有廣譜的殺菌能力。噬菌體SWH-Ab-1保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)(地址：武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)校內(nèi)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，保藏日期是2014年10月23日，保藏編號(hào)為CCTCC M2014507。
CCTCC NO.M2014507
20141023
【專利說明】鮑曼不動(dòng)桿菌臨菌體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種能夠特異性裂解鮑曼不動(dòng)桿菌菌株的噬菌體及其在殺菌和防菌 中的應(yīng)用，屬于微生物工程領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii，Ab)屬非發(fā)酵、氧化酶陰性、觸酶陽性 的革蘭氏陰性菌，廣泛存在于自然界的水、土壤和醫(yī)院環(huán)境，是醫(yī)院獲得性感染的主要條件 致病菌之一，可引起住院病人的呼吸道、泌尿道和傷口感染，也是引起燒傷感染的病原菌。 該菌在醫(yī)院環(huán)境中分布很廣且可以長(zhǎng)期存活，極易造成危重患者的感染，常從被感染患者 的血、尿、膿液及呼吸道分泌物等標(biāo)本中分離出，在非發(fā)酵菌中感染僅次于銅綠假單胞菌。 相關(guān)數(shù)據(jù)顯示：不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率為33. 6%、米諾環(huán)素為51. 4%，對(duì)碳 青霉烯類抗生素美羅培南和亞胺培南的耐藥率分別為62. 1 %和63. 6%。對(duì)其他檢測(cè)的抗 菌藥物的耐藥率均達(dá)到56. 2%以上。碳青霉烯類被認(rèn)為是抗菌效果良好的抗生素，但是有 關(guān)耐青霉烯類細(xì)菌的報(bào)道逐年增加，由于醫(yī)院經(jīng)常使用碳青霉烯類抗生素所形成的選擇性 壓力，同樣會(huì)造成鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥菌株的優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，給臨床治療帶來很多困難。
[0003] 菌體（bacteriophage，phage)是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的 細(xì)菌病毒的總稱，噬菌體具有病毒特有的一些特性：個(gè)體微小，不具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)，只含 有單一核酸。所有已知的噬菌體都是在細(xì)菌細(xì)胞中利用細(xì)菌的核糖體、蛋白質(zhì)合成時(shí)所需 的各種因子、各種氨基酸和能量產(chǎn)生系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)其自身的生長(zhǎng)和增殖，一旦離開了宿主細(xì) 胞，噬菌體既不能生長(zhǎng)，也不能復(fù)制。作為病毒的一種，噬菌體分布極廣，凡是有細(xì)菌的場(chǎng) 所，就可能有相應(yīng)噬菌體的存在。噬菌體在其生活周期過程中呈現(xiàn)兩種類型，即毒性噬菌 體和溫和噬菌體。毒性噬菌體能使宿主菌細(xì)胞迅速的裂解死亡，而溫和噬菌體在感染宿主 菌后一般不引起宿主菌的立即死亡，而是將自身的基因組整合到宿主菌的染色質(zhì)中，這種 狀態(tài)又叫做溶原狀態(tài)。用于治療和控制細(xì)菌性感染的噬菌體主要是指毒性噬菌體。噬菌 體具有嚴(yán)格的宿主特異性，只寄居在易感宿主菌體內(nèi)，并且對(duì)哺乳類動(dòng)物細(xì)胞無任何影響。 此外，噬菌體裂解細(xì)菌的效率非常高，噬菌體感染細(xì)菌后，通過異常特殊機(jī)制，噬菌體DNA 進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，隨后進(jìn)行生物合成，產(chǎn)生大量子代噬菌體，子代噬菌體從細(xì)胞內(nèi)釋放到細(xì)胞 夕卜，宿主細(xì)胞隨即死亡。
[0004] 目前，噬菌體人體治療的臨床病例已積累達(dá)數(shù)千例，但過去幾十年噬菌體治療始 終未能得到廣泛應(yīng)用，除了抗生素的發(fā)現(xiàn)與廣泛使用以外，其根本原因在于噬菌體對(duì)宿主 菌特異性要求太高，人們不可能找到那么多型特異的噬菌體來適應(yīng)如此眾多種類、型別不 同的細(xì)菌感染。1980年后，隨著抗生素耐藥性問題日益加劇，科學(xué)家們又重新將目光投回 到噬菌體治療上，企盼從中獲得有效的抗生素替代治療方案來控制日益加劇的全球性耐藥 問題。噬菌體治療的疾病包括化膿性傷口感染、胃腸炎、膿毒癥、骨髓炎、皮炎、膿胸及肺炎 等，可治療的病原菌包括葡萄球菌、鏈球菌、克雷伯菌、埃希桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、 志賀菌及沙門菌等。2006年美國(guó)食品和藥品管理局首次批準(zhǔn)將噬菌體用作食品添加劑，主 要用于殺滅肉制品中的李氏桿菌。噬菌體治療具有指數(shù)增值、特異性強(qiáng)、易實(shí)時(shí)更新、副作 用小、無殘留及周期短、成本低等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，被廣大學(xué)者所青睞。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是開發(fā)對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌具有強(qiáng)烈裂解作用的噬菌體分離物，該噬菌 體分離物可以單獨(dú)或混合使用，可以特異性地部分或完全滅活鮑曼不動(dòng)桿菌，為工業(yè)化生 產(chǎn)噬菌體殺菌劑提供噬菌體株來源。
[0006] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 一種鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體SWH-Ab-Ι，保藏號(hào)為：CCTCC M2014507。
[0008] 該噬菌體具有1個(gè)多面體立體頭部，頭部直徑約為136nm，無囊膜，有一長(zhǎng)尾，尾長(zhǎng) 約272nm，尾寬約27nm。
[0009] 該噬菌體能夠用于抑制鮑曼不動(dòng)桿菌。將該噬菌體SWH-Ab-I作用于來源不同的 50株臨床鮑曼不動(dòng)桿菌菌株，能裂解其中11株宿主菌，具有較寬的宿主譜。
[0010] 本發(fā)明中的噬菌體SWH-Ab-I可以單獨(dú)或混合使用，當(dāng)MOI = 0. 001時(shí)，鮑曼不動(dòng) 桿菌噬菌體感染宿主菌產(chǎn)生的子代噬菌體效價(jià)為10. 2X 1012pfu/mL。本發(fā)明中的噬菌體可 作為殺菌劑應(yīng)用于防治環(huán)境中，包括但不限于環(huán)境中的鮑曼不動(dòng)桿菌的污染。
[0011] 本發(fā)明的有益效果是：分離到的噬菌體SWH-Ab-I對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌具有裂解活性， 具有較寬的宿主譜，可以有效地殺滅和防治鮑曼不動(dòng)桿菌，可以單獨(dú)或混合使用，可作為殺 菌劑應(yīng)用于防治環(huán)境中，或者應(yīng)用在制備防治細(xì)菌感染的生物藥物方面。噬菌體毒副作用 甚小，安全性高，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1為噬菌體SWH-Ab-I雙層平板檢測(cè)結(jié)果。
[0013] 圖2為噬菌體SWH-Ab-I電鏡照片。

【具體實(shí)施方式】
[0014] LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉 10g/L。
[0015] 鮑曼不動(dòng)桿菌宿主菌液由西南醫(yī)院檢驗(yàn)科臨床微生物室提供。
[0016] 實(shí)施例1鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體的分離制備
[0017] (1)污水的采集及處理
[0018] 污水采自第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院污水站未處理的污水，經(jīng)過4°C，10000r/min 離心lOmin，用0. 22 μ m濾膜過濾得到上清液。
[0019] (2)鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體的特異性擴(kuò)增
[0020] 取步驟⑴得到的上清液100mL，加入50mL LB液體培養(yǎng)基混勾，加入鮑曼不動(dòng)桿 菌宿主菌液0. 6) 2mL，混勻后，置于37°C恒溫?fù)u床，160r/min振蕩過夜培養(yǎng)，次日 4°C，10000r/min離心10min，取上清液，此步為菌體擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0021] (3)斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)測(cè)定特異性噬菌體的有無
[0022] 將步驟（2)得到的上清液用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行IO1?10 8連續(xù)梯度稀釋，取稀釋 后的濾液各10 μ L，分別加入到裝有0. 2mL鮑曼不動(dòng)桿菌宿主菌液（00_?為0. 6)的離心管 中，渦旋混勻后，室溫下靜置15min，使噬菌體充分吸附宿主菌，再加入50°C融化的0. 7%瓊 脂的半固體LB培養(yǎng)基5mL，振蕩混勻，均勻傾倒于1. 5%瓊脂的固體LB平板上，做好平板標(biāo) 記。將做好標(biāo)記的平板放入37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在2h、3h、4h、5h時(shí)觀察有無噬菌斑。以上 操作均在無菌條件下進(jìn)行。
[0023] (4)鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體的分離及擴(kuò)增
[0024] 挑取步驟（3)中在雙層平板中呈現(xiàn)的噬菌斑（如圖1所示），接種于2mL鮑曼不動(dòng) 桿菌宿主菌液（(? 6_"為0. 6)中，37°C，160r/min培養(yǎng)6h以擴(kuò)增噬菌體。培養(yǎng)6h后將菌液 4°C，lOOOOr/min離心lOmin，得到的上清液用0. 22 ym微孔濾膜過濾除菌后即為噬菌體原 液。
[0025] 實(shí)施例2鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體的純化
[0026] 將實(shí)施例1中得到的噬菌體原液用LB液體培養(yǎng)基稀釋至IO7倍，按照實(shí)施例1中 步驟（3)的方法進(jìn)行雙層瓊脂平板檢測(cè)。用接種環(huán)挑取形狀規(guī)則、邊緣光滑的單個(gè)噬菌斑， 接種于2mL鮑曼不動(dòng)桿菌宿主菌液（(? 6_"為0.6)中，37°C 160rpm/min振蕩培養(yǎng)4-6h，溶 液變得清亮，說明細(xì)菌裂解了，4°C，lOOOOr/min離心lOmin。最后得到的上清液用0. 22 μm 微孔濾膜過濾除菌。重復(fù)上述過程3?5次，即得到純化的噬菌體，將其命名為SWH-Ab-1， 在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏單位地址：中國(guó)?武漢?武漢大學(xué)，保藏號(hào)：CCTCC M2014507,分類命名：Acinetobacter baumannii phage，保藏日期為2014 年 10 月 23 日。
[0027] 實(shí)施例3.噬菌體的效價(jià)測(cè)定與保存
[0028] 將實(shí)施例2中純化后的噬菌體樣品用LB液體培養(yǎng)基稀釋至IO7倍，取10 μ L樣品， 加入到0.2mL鮑曼不動(dòng)桿菌宿主菌液（00_?為0.6)中，然后采用實(shí)施例1中步驟（3)的 雙層瓊脂平板培養(yǎng)法培養(yǎng)噬菌體，取密度適當(dāng)?shù)钠矫笥?jì)算噬斑個(gè)數(shù)。做3個(gè)重復(fù)，噬菌體效 價(jià)的計(jì)算取3個(gè)重復(fù)所得的平均值。菌體的效價(jià)（pfu/mL)=密度適當(dāng)?shù)钠桨迳系陌?數(shù)X稀釋度X100。結(jié)果測(cè)得：噬菌體的效價(jià)為8X10 9pfu/mL。將最終得到的噬菌體加無 菌甘油至終濃度30%后，-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0029] 實(shí)施例4.噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)
[0030] 按照感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，M0I)分別為 0· 001、0· 01、0· 1、1 和 10的比例分別加入實(shí)施例2中純化后的噬菌體液和鮑曼不動(dòng)桿菌宿主菌液（OD6tltlmiS 0. 2， 對(duì)應(yīng)細(xì)菌濃度為0. 2 X 5 X 108cfu/mL = I X 108cfu/mL)，在這5份樣品溶液中分別加入LB液 體培養(yǎng)基使5份樣品體積相同，37°C培養(yǎng)至細(xì)菌裂解澄清，lOOOOr/min離心10min，收集上 清液，按照實(shí)施例3的方法測(cè)定噬菌體效價(jià)，設(shè)置兩個(gè)重復(fù)，取兩個(gè)重復(fù)的平均值，同時(shí)以 不加噬菌體的鮑曼不動(dòng)桿菌宿主菌和不加宿主菌的噬菌體作為對(duì)照，以產(chǎn)生最高噬菌體效 價(jià)的MOI為最佳感染復(fù)數(shù)。
[0031] 如表1所示，當(dāng)MOI = 0. 001時(shí)，鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體感染宿主菌產(chǎn)生的子代噬菌 體效價(jià)為10. 2X1012pfu/mL，在5個(gè)感染復(fù)數(shù)中，該產(chǎn)出率是最高的。因此，我們可以確定 鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體SWH-Ab-I感染其宿主菌鮑曼不動(dòng)桿菌的最佳感染復(fù)數(shù)為0. 001。
[0032] 表1鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體SWH-Ab-I最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定
[0033]

【權(quán)利要求】
1. 一種鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體SWH-Ab-1，其特征在于：保藏號(hào)為：CCTCC M2014507。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體SWH-Ab-1，其特征在于：該噬菌體具有 1個(gè)多面體立體頭部，頭部直徑約為136nm，無囊膜，有一長(zhǎng)尾，尾長(zhǎng)約272nm，尾寬約27nm。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體SWH-Ab-1，其特征在于：該噬菌體能夠 用于抑制鮑曼不動(dòng)桿菌。
4. 權(quán)利要求1所述的噬菌體SWH-Ab-1在防治鮑曼不動(dòng)桿菌污染方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K35/76GK104498443SQ201410720388
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月2日
【發(fā)明者】張波, 羅娟 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院