人核仁磷酸化蛋白nolc1的原核表達和純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人核仁磷酸化蛋白NOLC1的原核表達和純化方法。涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明中構(gòu)建pET28a-NOLC1原核表達載體，并將其轉(zhuǎn)化于BL21菌株中，經(jīng)誘導產(chǎn)生His-NOLC1融合蛋白，使用鎳離子螯合柱(Ni-NTA)純化菌體破碎后的上清以獲得較為單一的融合蛋白，純化后的蛋白可為抗腫瘤細胞的藥物靶點設(shè)計提供理論依據(jù)，從而為NOLC1蛋白在臨床中的應用提出新的視角和途徑。
【專利說明】人核仁磷酸化蛋白N0LC1的原核表達和純化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種真核蛋白的原核重組質(zhì)粒的構(gòu)建、 蛋白表達及純化的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 人核仁磷酸化蛋白N0LC1，又名hNoppl40,是一個高度磷酸化的哺乳動物蛋白，與 RNA聚合酶I相互結(jié)合，參與核仁的發(fā)生，調(diào)節(jié)rDNA的轉(zhuǎn)錄，參與炎癥發(fā)生、細胞生長、細胞 凋亡、腫瘤發(fā)生等相關(guān)信號通路的調(diào)控。正因為NOLCl蛋白對信號通路中起到的重要的調(diào) 節(jié)作用，所以能夠得到單一純化的NOLCl蛋白將對其在臨床抗腫瘤方面的應用奠定基礎(chǔ)。
[0003] 傳統(tǒng)的分離、純化真核蛋白的方法，其成本高、效率低，最主要的困難是對技術(shù)方 面要求特別高，而且分離純化得到的目的蛋白純度相對也較低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種操作方便、表達量大、需時較短，純度高的人核仁磷酸化 蛋白NOLCl的原核表達和純化方法。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種重組質(zhì)粒pET28a-N0LCl，由原核表達載體pET28a 和氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的人核仁磷酸化蛋白NOLCl經(jīng)Nco I和Not I雙酶切后 連接而成。其制備方法包括以下步驟：
[0006] 1)合成人核仁磷酸化蛋白NOLCl基因，以P為引物，通過PCR擴增反應，制得擴增 產(chǎn)物；所述的引物P的序列為：
[0007] 上游引物 F : CCGCCATGGCGATGGTTCCCAGCGACCTGTATC
[0008] 下游引物 R : GCGGCGGCCGCCTCGCTGTCAAACTTAATAG
[0009] 2)將擴增產(chǎn)物和原核表達載體pET28a同時進行Nco I和Not I雙酶切，連接，制 得重組質(zhì)粒pET28a-N0LCl。
[0010] 一種人核仁磷酸化蛋白NOLCl的原核表達和純化方法，包括如下步驟：
[0011] 1)轉(zhuǎn)化：將上述的重組質(zhì)粒pET28a-N0LCl轉(zhuǎn)化于感受態(tài)大腸桿菌BL21中，獲得 陽性表達菌株BL21 ;
[0012] 2)目標蛋白的表達：將陽性表達菌株BL21接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C 180r/ min過夜培養(yǎng)至0D600 = 0. 5-0. 7,于菌液中加入IPTG至終濃度為0. 6mmol/L，置于24°C、 160r/min的搖床中培養(yǎng)過夜，4°C、12000r/min離心，富集菌體，PBS洗菌體3次后重懸菌 體，超聲破碎至菌懸液澄清，4°C，12000r/min將破碎后的液體離心15min，收集上清液，獲 得His-NOLCl融合蛋白；
[0013] 3)目標蛋白的純化：每IOOmg His-NOLCl融合蛋白加入5ml PBS和終濃度為ImM 的蛋白酶抑制劑，超聲破碎菌體，4°C、12000r/min離心，取上清液，負載上鎳離子螯合柱，以 Binding Buffer沖洗柱子，使用Elution Buffer洗脫，收集洗脫液，即為目標蛋白N0LC1。
[0014] 本發(fā)明，首先構(gòu)建pET28a-N0LCl原核表達載體，并將其轉(zhuǎn)化于大腸 BL21菌株中， 經(jīng)誘導產(chǎn)生His-NOLCl融合蛋白。通過對誘導溫度和時間等條件的優(yōu)化，得到大量可溶性 的His-NOLCl融合蛋白。同時使用鎳離子螯合柱（Ni-NTA)純化菌體破碎后的上清，利用鎳 離子螯合柱吸附含有組氨酸His-tag的蛋白，而pET28a載體上攜帶His-tag，pET28a-N0LCl 表達含His-NOLl的目的蛋白能夠被鎳柱的異性吸附而實現(xiàn)，從而獲得單一的融合蛋白。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明將人核仁磷酸化蛋白NOCLl克隆到攜帶His-tag的 表達載體pET28a上，通過轉(zhuǎn)化，使得大腸桿菌BL21中獲得可以表達His-NOLCl融合蛋白的 重組子。這種新的表達系統(tǒng)可以在誘導劑的作用下高效地表達可融性的目的蛋白，再通過 鎳柱純化系統(tǒng)純化目的蛋白。本發(fā)明的構(gòu)建、表達、純化系統(tǒng)可以高效地表達和純化人核 仁磷酸化蛋白NOCLl。本發(fā)明提供的純化方法可使融合蛋白His-NOLCl純化后的純度高達 95%，而以往的蛋白質(zhì)純化方法純化出蛋白質(zhì)的純度只能達到60%-70%左右，本發(fā)明提 供的表達及純化方法比其他方法純化出蛋白質(zhì)的純度高出30%左右，且純化的效率可達到 40mg/ml。本發(fā)明表達和純化的人核仁磷酸化蛋白N0CL1，在鼻咽癌細胞中NOLCl蛋白明顯 上調(diào)，下調(diào)NOLCl蛋白可以促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡。本發(fā)明提供的高純度NOLCl蛋白有望 可以被應用到抗腫瘤藥物的研究當中。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是融合蛋白His-NOLCl的SDS-PAGE檢測圖；
[0017] 其中，M是標準蛋白分子量；1是融合蛋白His-NOLCl。
[0018] 圖2是目標蛋白NOLCl的電泳圖；
[0019] 其中，M是標準蛋白分子量；1是蛋白NOLCl。

【具體實施方式】
[0020] 本發(fā)明所采用的技術(shù)手段，本領(lǐng)域的技術(shù)人員均可依據(jù)《分子克隆》和其他技術(shù)手 冊而獲知。
[0021] 實施例1人核仁磷酸化蛋白NOLCl的原核表達和純化方法
[0022] ( -）引物設(shè)計
[0023] 擴增人核仁磷酸化蛋白NOLCl基因，同時引入Nco I和Not I雙酶切位點；
[0024] 引物設(shè)計如下：上游引物F和下游引物R的序列如下：
[0025] F: CCGCCATGGCGATGGTTCCCAGCGACCTGTATC (斜體表示 Nco I 酶切位點）
[0026] R:GCGGCGGCCGCCTCGCTGTCAAACTTAATAG (斜體表示 Not I 酶切位點）
[0027] (二）PCR 擴增
[0028] 以pCMV-flag-NOLCl (由遼寧大學，生命科學院208實驗室成功構(gòu)建并提供）作為 模板。
[0029]

【權(quán)利要求】
1. 一種重組質(zhì)粒pET28a-N0LCl，其特征在于：由原核表達載體pET28a和氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1所示的人核仁磷酸化蛋白N0LC1經(jīng)Nco I和Not I雙酶切后連接而成。
2. 如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒pET28a-N0LCl，其特征在于：制備方法包括以下步 驟： 1) 合成人核仁磷酸化蛋白N0LC1基因，以P為引物，通過PCR擴增反應，制得擴增產(chǎn)物； 所述的引物P的序列為： 上游引物 F :CCGCCATGGCGATGGITCCCAGCGACCTGTATC 下游引物 R :GCGGCGGCCGCCTCGCTGTCAAACTTAATAG 2) 將擴增產(chǎn)物和原核表達載體pET28a同時進行Nco I和Not I雙酶切，連接，制得重 組質(zhì)粒 pET28a-N0LCl。
3. 人核仁磷酸化蛋白N0LC1的原核表達和純化方法，其特征在于：包括如下步驟： 1) 轉(zhuǎn)化：將權(quán)利要求1或2所述的重組質(zhì)粒pET28a-N0LCl轉(zhuǎn)化于感受態(tài)大腸桿菌BL21 中，獲得陽性表達菌株BL21 ; 2) 目標蛋白的表達：將陽性表達菌株BL21接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C 180r/min過 夜培養(yǎng)至0D600 = 0. 5-0. 7,于菌液中加入IPTG至終濃度為0. 6mmol/L，置于24°C、160r/ min的搖床中培養(yǎng)過夜，4 °C、12000r/min離心，富集菌體，PBS洗菌體3次后重懸菌體， 超聲破碎至菌懸液澄清，4°C，12000r/min將破碎后的液體離心15min，收集上清液，獲得 His-NOLCl融合蛋白； 3) 目標蛋白的純化：將His-NOLCl融合蛋白利用鎳離子螯合柱提純。
4. 如權(quán)利要求3所述的人核仁磷酸化蛋白N0LC1的原核表達和純化方法，其特征在于 所述的目標蛋白的純化是：每l〇〇mg His-NOLCl融合蛋白加入5ml PBS和終濃度為ImM的 蛋白酶抑制劑，超聲破碎菌體，4°C、12000r/min離心，取上清液，負載上鎳離子螯合柱，以 Binding Buffer沖洗柱子，使用Elution Buffer洗脫，收集洗脫液，即為目標蛋白N0LC1。
5. 權(quán)利要求3或4所述的人核仁磷酸化蛋白N0LC1在制備治療抗腫瘤藥物中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK104480132SQ201410677516
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月21日
【發(fā)明者】劉宏生, 朱春玉, 鄭方亮, 佘曉雙, 朱俊峰, 張力 申請人:遼寧大學