用于防治仿刺參腐皮綜合癥的微生態(tài)制劑及制備方法
【專利摘要】一種用于防治仿刺參腐皮綜合癥的微生態(tài)制劑及制備方法，屬于水產(chǎn)微生物領(lǐng)域，其活性成分為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)H1的菌體和它的胞外代謝產(chǎn)物；該菌株是從山東蓬萊健康養(yǎng)殖的仿刺參腸道糞便分離獲得，通過安全性、抑菌活性、毒性檢測以及人工拮抗?fàn)N爛弧菌實驗，證實巨大芽孢桿菌H1菌株能拮抗?fàn)N爛弧菌，有效地保護仿刺參稚參，用于防治由燦爛弧菌引起的仿刺參“腐皮綜合癥”，提高仿刺參保苗期的成活率。
CGMCC No9883
20141030
【專利說明】用于防治仿刺參腐皮綜合癥的微生態(tài)制劑及制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)微生物領(lǐng)域，具體涉及一種用于防治仿刺參"腐皮綜合癥"的微生 態(tài)制劑及制備方法。

【背景技術(shù)】：
[0002] 仿刺參（Apostichopus japonicas Selenka)養(yǎng)殖以其單種類產(chǎn)值最高和每年 20%的增長速度，成為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要支柱之一。2011年度，山東省仿刺參的養(yǎng)殖面 積達(dá)5. 3萬公頃，年產(chǎn)量7. 1萬噸（超過全國總產(chǎn)量一半），年產(chǎn)值達(dá)160億元。然而，近年 來隨著刺參養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，各種病害接踵而至，嚴(yán)重制約了該產(chǎn)業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā) 展。仿刺參保苗期和養(yǎng)成期發(fā)生的"腐皮綜合癥"波及面廣，傳染性強，死亡率極高，造成了 慘重的經(jīng)濟損失。其癥狀主要表現(xiàn)為：厭食、搖頭、腫嘴、排臟、身體萎縮、口部潰爛乃至體表 大面積潰瘍；每年的1-4月份養(yǎng)殖水體溫度較低時（< 8°C=是發(fā)病高峰，這種病在育苗場 多發(fā)生在2、3月份，池塘養(yǎng)殖則多發(fā)生在3、4月份，其高感染率通常引起成參50%的死亡 率和稚參的全部死亡，屬于急性死亡。而燦爛弧菌（Vibrio splendidus)是引起養(yǎng)殖刺參 "腐皮綜合癥"的主要病原菌之一，其致病力強，既能引起仿刺參表皮潰瘍，也能誘發(fā)稚參爛 胃病。
[0003] 為了控制仿刺參病害的發(fā)生，許多養(yǎng)殖戶選擇大量使用抗生素，而長期使用抗生 素會導(dǎo)致藥物的殘留、養(yǎng)殖環(huán)境惡化、病原耐藥性增強等負(fù)面影響。近年來，抗生素已經(jīng)陸 續(xù)被許多國家明令禁止作為飼料添加劑來使用，并嚴(yán)禁直接向養(yǎng)殖水域中潑灑抗生素。因 此，通過益生菌抑制病原微生物，調(diào)節(jié)養(yǎng)殖動物腸道微生態(tài)平衡，增強養(yǎng)殖動物免疫力以 及安全環(huán)保的生物防治手段在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中得到越來越多的關(guān)注。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用于防治仿刺參"腐皮綜合癥"的微生態(tài)制 劑及制備方法，所述微生態(tài)制劑的是包括巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium)Hl及其胞 外代謝產(chǎn)物，該菌株是從山東蓬萊健康養(yǎng)殖的仿刺參腸道糞便分離獲得，通過安全性、抑菌 活性、毒性檢測以及人工拮抗?fàn)N爛弧菌實驗，證實巨大芽孢桿菌Hl菌株能拮抗?fàn)N爛弧菌， 有效地保護仿刺參稚參，用于防治由燦爛弧菌引起的仿刺參"腐皮綜合癥"，提高仿刺參保 苗期的成活率。
[0005] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0006] -種用于防治仿刺參"腐皮綜合癥"的微生態(tài)制劑，其活性成分為巨大芽孢桿菌 (Bacillus megaterium)Hl的菌體和它的胞外代謝產(chǎn)物；
[0007] 巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium)Hl分離自山東蓬萊健康養(yǎng)殖的仿刺參 (Apostichopus japonicas Selenka)腸道糞便。該菌株于2014年10月30日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 9883,保藏地址： 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。
[0008] 進(jìn)一步，上述微生物制劑為液體制劑。
[0009] 本發(fā)明還提供一種上述微生態(tài)制劑的制備方法，具體包括如下步驟：菌種活化、種 子液制備和發(fā)酵培養(yǎng)；
[0010] ⑴菌種活化：將保存的巨大芽孢桿菌Hl菌株在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上劃線 活化，再挑取單菌落接種于胰蛋白胨大豆瓊脂斜面培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)24小時，獲得活化 巨大芽孢桿菌Hl菌株；
[0011] (2)種子液制備：無菌條件下將步驟（1)活化的巨大芽孢桿菌Hl菌株接種至無菌 胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基中，在28-30°C、搖床轉(zhuǎn)速150-170rpm條件下培養(yǎng)20-24小 時，獲得巨大芽孢桿菌Hl種子液；
[0012] (3)發(fā)酵培養(yǎng)：按照體積比0.1%的比例將步驟⑵的巨大芽孢桿菌Hl種子液 接入用海水配制的發(fā)酵培養(yǎng)基；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其重量百分比為豆柏粉0. 5%， 玉米漿0.2%，酵母膏0.01 %，KH2PO4O. 02%，磷酸高鐵0.005 % ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH7. 5-8. 0 ;在28-30°C、攪拌機轉(zhuǎn)速120-140rpm條件下培養(yǎng)20-24小時，獲得巨大芽孢桿 菌Hl菌株的液體制劑，活菌數(shù)IO ltl?10nCFU/ml，也即用于防治仿刺參"腐皮綜合癥"的微 生態(tài)制劑。
[0013] 進(jìn)一步，所述步驟（3)將巨大芽孢桿菌Hl種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基后用攪拌機以 120-140rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌，同時向發(fā)酵罐中通入過濾無菌空氣，通氣量與發(fā)酵液體積的 比值1:1，通氣單位L/min，罐壓為0. 03-0. 05Mpa。
[0014] 本發(fā)明還提供一種巨大芽孢桿菌Hl在防治仿刺參"腐皮綜合癥"的微生態(tài)制劑中 的應(yīng)用；
[0015] 本發(fā)明還提供一種巨大芽孢桿菌Hl在防治仿刺參"腐皮綜合癥"中的應(yīng)用，具體 為將上述所得微生態(tài)制劑潑灑于仿刺參養(yǎng)殖水體中，水體中最終活菌數(shù)為IO 5?IO6CFU/ ml 〇
[0016] 進(jìn)一步，所述的巨大芽孢桿菌Hl在防治仿刺參"腐皮綜合癥"中的應(yīng)用為將所述 的微生態(tài)制劑與仿刺參飼料混合后進(jìn)行投喂，用量與潑灑使用的量相同。
[0017] 巨大芽孢桿菌Hl菌株的分離篩選
[0018] Hl菌株分離自山東蓬萊健康養(yǎng)殖的仿刺參腸道糞便。2011年10月，無菌采集健 康的仿刺參腸道糞便，用10倍體積的無菌海水對腸道糞便進(jìn)行稀釋混勻后置于15ml離心 管中，直接靜置15min取上清。分別將上清液配制成0、10' 1(Γ2、1(Γ3四個不同的稀釋濃 度，每個濃度設(shè)置3個平行組；并各取100 μ 1涂布于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基；于28°C恒 溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)菌的分離和純化。
[0019] 以由燦爛弧菌引起的仿刺參的排臟和死亡作為靶標(biāo)，結(jié)合安全性、抑菌活性和毒 性的檢測，進(jìn)行生防菌的篩選。結(jié)果中篩選出一株對靶標(biāo)病害具有顯著防治效果的菌株，定 名為Hl菌株。
[0020] Hl菌株的分類鑒定
[0021] Hl菌株能在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上生長，形成圓或不規(guī)則形的菌落，表面 干燥不透明，培養(yǎng)后期起皺，呈奶黃色且具有一定粘性；孢子中生；革蘭氏陽性，運動性 弱，菌體呈桿狀，大小為（1.2?1.8) μ mX (2.0?3.5) μ m。該菌株革蘭氏染色呈陽性， 能夠水解明膠、淀粉，硝酸鹽還原陰性。Biolog鑒定，Hl菌株與巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium)具有最高相似率為98%。與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》第九版中描述的Bacillus megaterium種屬特征相符。該菌16S rDNA全長序列（見序列表SEQ1，長度為1518bp)通過 NCBI 的BLAST檢索系統(tǒng)（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Blast/)與Bacillus megaterium Cl (AJ491841)進(jìn)行同源序列比對，相似性達(dá)100% ;通過用MEGA4. 0作進(jìn)化樹（圖1)。因 此Hl鑒定為BaciIlus megaterium，根據(jù)中文命名規(guī)則，命名為巨大芽孢桿菌Hl。
[0022] 巨大芽孢桿菌Hl菌株的安全性、抑菌活性和毒性的檢測
[0023] 將分離純化獲得的巨大芽孢桿菌Hl菌株接種至綿羊血瓊脂平板（購自青島奕維 生物科技有限公司）上；置于28°C恒溫培養(yǎng)18-24小時后觀察菌落形態(tài)及溶血情況。以大 腸桿菌JM109 (Escherichia coli)為陰性對照。巨大芽孢桿菌Hl菌株無溶血性。
[0024] 與中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院海洋微生物實驗室保藏的仿刺參致病弧菌燦爛弧 菌（Vibrio splendidus) LJ08在2216E平板上進(jìn)行牛津杯法抑菌實驗，28°C恒溫培養(yǎng)24小 時后，巨大芽孢桿菌Hl呈現(xiàn)明顯的抑菌圈（圖2)。
[0025] 毒性試驗于預(yù)先消毒的盛有3L砂濾海水的玻璃燒杯中進(jìn)行。挑選個體大小相當(dāng) 的健康稚參（平均體質(zhì)量為1.07±0.08g)用于試驗，每20頭一組，設(shè)3個平行。巨大芽 孢桿菌Hl菌株以IO 7CFUAiI的浸泡濃度，對仿刺參進(jìn)行毒性試驗。整個試驗期間不投喂任 何飼料，水溫保持在18-20°C，充氣培養(yǎng)。每隔3天，徹底換水一次，補加菌懸液一次，保持 IO7CFUAiI的浸泡濃度，連續(xù)兩周，觀察仿刺參排臟情況。巨大芽孢桿菌Hl菌株對稚參均無 刺激排臟的作用，且實驗期間無稚參死亡，說明巨大芽孢桿菌Hl對仿刺參是安全的，可以 作為潛在的有益菌（圖3)。
[0026] 對燦爛弧菌的拮抗實驗挑選個體大小相當(dāng)?shù)慕】抵蓞B(yǎng)殖（平均體質(zhì)量為 1. 07±0. 08g)于預(yù)先消毒的盛有3L砂濾海水的玻璃燒杯中，每20頭一組，每組設(shè)3個平 行。其中空白對照組未做任何處理，陽性對照組僅添加濃度為l〇 lclCFU/ml的燦爛弧菌菌懸 液3ml。拮抗組同時添加濃度為101(lCFU/ml的Hl菌株和燦爛弧菌菌懸液各3ml。整個試 驗期間不投喂任何飼料，水溫保持在18_20°C，充氣培養(yǎng)。每隔3天，徹底換水一次，補加菌 懸液一次，保持原有的浸泡濃度。連續(xù)觀察兩周，統(tǒng)計稚參排臟率，并計算保護率（％)= {(陽性對照組平均排臟率一試驗組平均排臟率）/陽性對照組平均排臟率} X 100%。在拮 抗實驗的第14天，取Iml各實驗組換水前的稚參養(yǎng)殖海水進(jìn)行系列稀釋，定量涂布TCBS瓊 脂平板檢測實驗水體中燦爛弧菌數(shù)量的變化。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件Duncan法對實驗 數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。在實驗的第14天，添加巨大芽孢桿菌Hl拮抗組實驗水體中的燦爛弧 菌數(shù)量為（I. 55±0. 5) X 105CFU/ml，而陽性對照組燦爛弧菌數(shù)量為（2. 16±0. 6) X IO7CFU/ ml，巨大芽孢桿菌Hl拮抗組與陽性對照組差異顯著（p<0. 05)，進(jìn)一步證實Hl對燦爛弧 菌具有明顯的抑菌作用，與牛津杯抑菌試驗結(jié)果一致。經(jīng)過兩周的人工拮抗實驗，空白對照 組的累計排臟率為〇% ;僅添加燦爛弧菌的陽性對照組累計排臟率為（43. 33±5. 77) % ;而 巨大芽孢桿菌Hl拮抗組的累計排臟率為（3. 33 ±2. 89) % (圖3)。統(tǒng)計分析顯示：H1拮抗 組和陽性對照組差異顯著（P < 0. 05)，說明巨大芽孢桿菌Hl具有很好的保護仿刺參稚參的 作用。經(jīng)計算獲得的巨大芽孢桿菌Hl對仿刺參稚參的排臟保護率為92. 7%。
[0027] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果
[0028] (1)本發(fā)明微生態(tài)制劑的主要成分為巨大芽孢桿菌菌株Hl及其胞外代謝物，該微 生態(tài)制劑對由燦爛弧菌引起的仿刺參"腐皮綜合癥"特異性強，且防效高，對仿刺參稚參的 排臟保護率為92. 7%。（2)利用本發(fā)明微生態(tài)制劑防治由燦爛弧菌引起的仿刺參"腐皮綜 合癥"不易產(chǎn)生抗藥性，對人、畜安全，無環(huán)境污染。（3)本發(fā)明制備方法簡單、成本低、使 用方便。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1根據(jù)16S rRNA基因序列構(gòu)建的Hl菌株及與其親源關(guān)系較近的Bacillus megaterium代表菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化距離的計算采用P-distance計算模型，樹的拓?fù)?形狀采用neighbor-joining方法構(gòu)建，分支上的數(shù)字為1000次bootstrap分析所得值，標(biāo) 尺0. 0002代表此長度為萬分之2的核苷酸序列替換。
[0030] 圖2巨大芽孢桿菌Hl菌株體外拮抗?fàn)N爛弧菌LJ08 (牛津杯法）
[0031] 圖3巨大芽孢桿菌Hl菌株對燦爛弧菌LJ08的拮抗實驗
[0032] 巨大芽抱桿菌H1，拉丁文名稱為Bacillus megaterium H1，于2014年10月 29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 9883,保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編 100101。

【具體實施方式】：
[0033] 下面通過實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的解釋，但本發(fā)明的保護范圍不受 實施例任何形式上的限制。
[0034] 實施例1
[0035] -種巨大芽孢桿菌Hl生產(chǎn)的微生物制劑，其活性成分為巨大芽孢桿菌Hl的菌體 和它的胞外代謝產(chǎn)物。其制備方法按照如下步驟進(jìn)行：
[0036] (1)菌種活化：將保存于_80°C的巨大芽孢桿菌Hl菌株在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng) 基上劃線活化，28°C培養(yǎng)至長出單菌落，再挑取單菌落接種于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基斜 面培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)24小時，得到活化菌株。
[0037] (2)種子液制備：按常規(guī)方法制備胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基，其成分及組成： 胰蛋白胨 1.5% (g/100ml)、大豆蛋白胨 0.5% (g/100ml)、氯化鈉 0.5% (g/100ml);在 500mL錐形瓶中裝入胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基200mL，pH為7. 6。置高壓蒸氣滅菌器中， 在121°C，105kPa下滅菌20分鐘。待培養(yǎng)液溫度降至30°C后，于瓶中接入步驟（1)活化好 的一接種環(huán)菌苔，在搖床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速170rpm，28°C培養(yǎng)24小時，獲得 種子液。
[0038] (3)發(fā)酵罐培養(yǎng)基的制備：用海水配制的發(fā)酵培養(yǎng)基，按重量百分比將豆柏粉 0. 5%，玉米漿0. 2%，酵母膏0. 01%，KH2PO4O. 02%，磷酸高鐵0. 005%加入海水中，于316L 不銹鋼發(fā)酵罐中攪拌均勻，在121°C，105kPa下滅菌20分鐘，降溫至30°C以下備用。
[0039] (4)發(fā)酵培養(yǎng)：向發(fā)酵罐中按體積比0. 1%的比例接入步驟⑵的巨大芽孢桿菌 Hl種子液，攪拌機轉(zhuǎn)速為120rpm，通入過濾無菌空氣，通氣量與發(fā)酵液體積的比值1: 1，通 氣單位L/min，罐壓為0. 04Mpa，pH 7. 6, 28°C下培養(yǎng)24小時。每隔2小時取樣鏡檢，菌數(shù) 達(dá)IOltl?10nCFU/ml后即停止發(fā)酵培養(yǎng)，所得菌液為巨大芽孢桿菌Hl液體微生物制劑。
[0040] 實施例2
[0041] 2012年1月至3月，我們在山東安源水產(chǎn)股份有限公司進(jìn)行了為期2個月的仿刺 參保苗養(yǎng)殖實驗。巨大芽孢桿菌Hl微生態(tài)制劑按照實施例1的方法經(jīng)發(fā)酵罐生產(chǎn)，活菌數(shù) 達(dá)3. 5 X 101(lCFU/ml，菌液呈淺棕色狀，于室溫保存。實驗在該公司實驗車間6個仿刺參保苗 池進(jìn)行，設(shè)對照組和潑灑巨大芽孢桿菌Hl微生態(tài)制劑的實驗組，每組3平行，其中每池水體 為8立方米。選取健康稚參個體（平均體質(zhì)量為0. 81 ±0. 37g，體長I. 3-2. Icm)，個體投放 密度為〇. 5kg/方水體，進(jìn)行24小時充氣養(yǎng)殖。保證水體溶解氧>5mg/L，水溫16?18°C， 避光，每天換水量50-100%。飼料和添加劑按正常生產(chǎn)投喂，初始飼料投喂量按參苗體濕 重的5%，每天早晨投喂一次。仿刺參致病弧菌燦爛弧菌LJ08每天早晨按養(yǎng)殖水體最終活 菌數(shù)IO 4CFUAiI的量進(jìn)行各池拌料投喂。實驗組巨大芽孢桿菌Hl微生態(tài)制劑用法為每天 換水后潑灑一次，每立方米水體潑灑4毫升，保持巨大芽孢桿菌Hl在養(yǎng)殖水體的最終活菌 數(shù)為I. 4X 105CFU/ml。每4至7天倒池，在參苗框換池時統(tǒng)計各池底參苗死苗和有腐皮癥 狀的個數(shù)。結(jié)果表明，2月內(nèi)潑灑巨大芽孢桿菌Hl微生態(tài)制劑的實驗組池底參苗腐皮及死 苗數(shù)平均為75. 67±7. 59只/池，對照池的參苗腐皮及死苗數(shù)平均為287. 33±52. 64只/ 池。加本發(fā)明微生態(tài)制劑有效地控制了由燦爛弧菌引起腐皮癥，提高了仿刺參稚參的成活 率，可應(yīng)用于仿刺參大規(guī)模的保苗生產(chǎn)。
[0042] 實施例3
[0043] 2013年12月，我們在青島貝寶海洋科技股份有限公司進(jìn)行了為期3個月的仿刺參 保苗越冬養(yǎng)殖實驗。巨大芽孢桿菌菌株Hl由公司按照實施例1的方法二級發(fā)酵罐生產(chǎn)， 菌數(shù)達(dá)8. 6 X 101(lCFU/ml，于室溫保存。實驗在該公司循環(huán)水車間9個仿刺參保苗池進(jìn)行，設(shè) 對照組、投喂巨大芽孢桿菌Hl微生態(tài)制劑實驗組和投喂枯草芽孢桿菌菌液實驗組，枯草芽 孢桿菌菌液為市售（標(biāo)稱l〇 nCFU/ml)，每組3個平行，其中每池水體為6立方米。選取健 康稚參個體（平均體質(zhì)量為3. 12±0. 97g，體長3. 01-4. 12cm)，個體投放密度為0. 5kg/方 水體。養(yǎng)殖池24小時充氣，溶解氧>5mg/L，水溫14?16 °C，避光，每天換水量80%。初始 飼料投喂量按參苗體濕重的5%，每天早晨投喂一次。仿刺參致病弧菌燦爛弧菌LJ08每天 換水后按養(yǎng)殖水體最終活菌數(shù)為l〇 4CFU/ml進(jìn)行各池潑灑。實驗組巨大芽孢桿菌Hl微生 態(tài)制劑和枯草芽孢桿菌菌液的用量分別為每立方米水體3毫升，拌飼料投喂。每5至7天 倒池，參苗框換池時統(tǒng)計各池池底參苗死苗和有腐皮癥狀的個數(shù)，并于3個月后進(jìn)行各池 稱重。結(jié)果表明，投喂巨大芽孢桿菌Hl微生態(tài)制劑的實驗組池底參苗腐皮及死苗數(shù)平均為 35. 33±1. 70只/池，對照組的參苗腐皮及死苗數(shù)平均為187. 33. 06±31. 67只/池，投喂枯 草芽孢桿菌菌液實驗組的參苗腐皮及死苗數(shù)平均為142. 67± 15. 97只/池。投喂巨大芽孢 桿菌Hl微生態(tài)制劑的實驗組參苗體質(zhì)量比對照組和投喂枯草芽孢桿菌菌液實驗組分別增 重38. 75%和26. 51%。結(jié)果證明在仿刺參冬季低溫保苗期投喂巨大芽孢桿菌Hl微生態(tài)制 劑可有效降低參苗腐皮癥的發(fā)生，并顯著提高產(chǎn)量，巨大芽孢桿菌Hl微生態(tài)制劑適宜于仿 刺參冬季保苗大規(guī)模養(yǎng)殖時應(yīng)用。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于防治仿刺參腐皮綜合癥的微生態(tài)制劑，其特征在于其活性成分為巨大芽孢 桿菌（Bacillus megaterium)Hl的菌體和它的胞外代謝產(chǎn)物； 所述的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium)Hl分離自山東蓬萊健康養(yǎng)殖的仿刺參 (Apostichopus japonicas Selenka)腸道糞便，該菌株于2014年10月29日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 9883,保藏地址： 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于防治仿刺參腐皮綜合癥的微生態(tài)制劑，其特征在于 所述微生態(tài)制劑為液體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于它的具體步驟如下： (1) 菌種活化：將保存的巨大芽孢桿菌H1菌株在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上劃線活 化，再挑取單菌落接種于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)24小時，SP可 獲得活化巨大芽孢桿菌H1菌株； (2) 種子液制備：無菌條件下將步驟（1)活化的巨大芽孢桿菌H1菌株接種至無菌胰蛋 白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基中，在28-30°C、搖床轉(zhuǎn)速150-170rpm條件下培養(yǎng)20-24小時，獲 得巨大芽孢桿菌H1種子液； (3) 發(fā)酵培養(yǎng)：按照體積比0. 1%的比例將步驟（2)的巨大芽孢桿菌H1種子液接入用 海水配制的發(fā)酵培養(yǎng)基；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其重量百分比為豆柏粉0.5%，玉米漿 0. 2%，酵母膏0. 01 %，KH2P040 . 02%，磷酸高鐵0. 005% ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH7. 5-8. 0 ;在 28-30°C、攪拌機轉(zhuǎn)速120-140rpm條件下培養(yǎng)20-24小時，獲得巨大芽孢桿菌H1菌株的液 體制劑，活菌數(shù)101°?l〇nCFU/ml，也即用于防治仿刺參腐皮綜合癥的微生態(tài)制劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述步驟（3)將巨大芽孢桿菌H1種子 液接入發(fā)酵培養(yǎng)基后用攪拌機以120-140rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌，同時向發(fā)酵罐中通入過濾 無菌空氣，通氣量與發(fā)酵液體積的比值1:1，通氣單位L/min，罐壓為0. 03-0. 05Mpa。
5. -種巨大芽孢桿菌HI在防治仿刺參腐皮綜合癥中的應(yīng)用，將權(quán)利要求1所述的微生 態(tài)制劑潑灑于仿刺參養(yǎng)殖水體中，水體中最終活菌數(shù)為1〇5?l〇6CFU/ml。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種巨大芽孢桿菌HI在防治仿刺參腐皮綜合癥中的應(yīng)用，其 特征在于所述的巨大芽孢桿菌H1在防治仿刺參腐皮綜合癥中的應(yīng)用方法為將所述的微生 態(tài)制劑與仿刺參飼料混合后進(jìn)行投喂，用量與潑灑使用的量相同。
7. -種巨大芽孢桿菌H1在防治仿刺參腐皮綜合癥的微生態(tài)制劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P31/04GK104367597SQ201410657397
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】祁自忠, 韓茵, 陳四清, 鄒安革, 王亮, 余彬 申請人:中國海洋大學(xué)