一種黃萱益肝片的制備方法及其在制備抑制畸胎瘤細胞f9細胞增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種黃萱益肝片的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的黃萱益肝片的制備方法，由土大黃291g、萱草103g、千里光92g、獼猴桃92g、紅土茯苓92g、野薔薇62g、獐芽菜62g、騷羊古62g、南五味子62g作為原料藥制成，采用超臨界萃取、微波萃取和大孔樹脂吸附制備而成，使得大黃素含量有很大提高。本發(fā)明還提供了黃萱益肝片在制備抑制小鼠畸胎瘤細胞F9細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【專利說明】一種黃萱益肝片的制備方法及其在制備抑制畸胎瘤細胞 F9細胞增殖藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種黃萱益肝片的制備方法及其在制備抑制 小鼠畸胎瘤細胞F9細胞增殖藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 黃萱益肝散標準號WS-10465(ZD-0465)-2002,記載于國家中成藥標準匯編內(nèi)科肝 膽分冊。由土大黃291g、萱草103g、千里光92g、獼猴桃92g、紅土茯苓92g、野薔薇62g、獐 芽菜62g、騷羊古62g、南五味子62g作為原料藥制成，具有清熱解毒，疏肝利膽的功效。用 于肝膽濕熱所致的慢性乙型肝炎。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有黃萱益肝散在提取制備方面采用CO2超臨界萃取、微波技術(shù)和 大孔樹脂吸附技術(shù)提取的報道，而中藥直接打粉取的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患 者用量過大，不方便服用，嚴重影響了本品在臨床上應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種黃萱益肝片的制備方法。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種黃萱益肝片在制備抑制小鼠畸胎瘤細胞F9細 胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過如下的方案實現(xiàn)的： 一種黃萱益肝片的制備方法，由土大黃291g、萱草103g、千里光92g、稱猴桃92g、紅土 茯苓92g、野薔薇62g、獐芽菜62g、騷羊古62g、南五味子62g作為原料藥制成，所述的制備 方法由下列步驟組成：取野薔薇、騷羊古、南五味子，粉碎成細粉，加入到C02超臨界萃取器 中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力20-30MPa，溫度 30-50°C，CO 2流量l-3ml/g生藥·π?η，萃取時間130-170min，得超臨界萃取物，備用；萃取 后的野薔薇、騷羊古、南五味子殘渣與其他六味藥材，粉碎，加入5L的60%乙醇，投入微波萃 取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮， 加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮 并干燥，得微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙醇制顆粒，干燥， 壓片，制成200片，每片重0. 5g。
[0007] 上述的黃萱益肝片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑占總萃取溶劑的 體積百分比為5%。
[0008] 上述的黃萱益肝片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25 MPa。
[0009] 上述的黃萱益肝片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為60°C。
[0010] 上述的黃萱益肝片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中CCV流量2ml/g生 藥· min〇
[0011] 上述的黃萱益肝片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取時間為150min。
[0012] 上述的黃萱益肝片的制備方法中，所述微波萃取功率為700W。
[0013] 上述的黃萱益肝片的制備方法中，所述微波萃取每次萃取時間為8分鐘。
[0014] 上述的黃萱益肝片在制備抑制小鼠畸胎瘤細胞F9細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0015] 現(xiàn)有技術(shù)中，黃萱益肝散口服，成人一次9g，一日3次。黃萱益肝散服藥量大。米 用本發(fā)明方法制備成的黃萱益肝片每片重〇. 5g，每次僅需2片，一日服用3次。在具有更多 活性成分的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過下述試驗證明。
[0016] 試驗一、不同方法制備的黃萱益肝片中大黃素含量的比較 1、儀器及試藥本發(fā)明黃萱益肝片：按實施例1方法制備，使用918g原料藥，經(jīng)提取制成 200片，每片重0. 5g。原黃萱益肝散，按照WS-10465 (ZD-0465) -2002標準方法制備，作為 對照。Agilentl200高效液相色譜儀；AE240電子分析天平；大黃素對照品（中國藥品生物 制品檢定所)。
[0017] 2、方法 照高效液相色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VI D)測定。
[0018] 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0. 25% 磷酸溶液（80 : 20)為流動相；檢測波長為436nm。理論板數(shù)按大黃素峰計算應(yīng)不低于 3000。
[0019] 對照品溶液的制備取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的大黃素對照品適量，精密稱 定，加甲醇制成每Iml含0. 05mg的溶液，即得。
[0020] 本發(fā)明產(chǎn)品供試品溶液的制備取本發(fā)明的黃萱益肝片，研細，取〇.4g，精密稱 定，置索氏提取器中，加乙醇適量，加熱回流提取至無色，提取液濃縮至約5ml，放冷，加入稀 鹽酸5ml，氯仿30ml，加熱回流30分鐘，放冷，分取氯仿液，水液用氯仿振搖提取2次（20ml、 15ml)，合并氯仿液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解并移至IOml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖 勻，離心，取上清液，即得。
[0021] 對照品供試品溶液的制備取本對照的黃萱益肝散，研細，混勻，取2g，精密稱定， 置索氏提取器中，加乙醇適量，加熱回流提取至無色，提取液濃縮至約5ml，放冷，加入稀鹽 酸5ml，氯仿30ml，加熱回流30分鐘，放冷，分取氯仿液，水液用氯仿振搖提取2次（20ml、 15ml)，合并氯仿液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解并移至IOml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖 勻，離心，取上清液，即得。
[0022] 測定法分別精密吸取對照品溶液、本發(fā)明產(chǎn)品供試品溶液與對照品供試品溶液 各1〇μ1，注入液相色譜儀，測定，即得。
[0023] 3、結(jié)果 結(jié)果表明，本發(fā)明黃萱益肝片中大黃素的含量為2-4mg/片；而原黃萱益肝散中大黃素 的含量為〇. 21mg/粒，每片大黃素含量相當(dāng)于散劑每g散劑含量的10-20倍，在服用量減少 的情況下，大黃素含量有很大提高。
[0024] 上述研究表明，采用本發(fā)明制備方法制備的黃萱益肝片，有效成分含量遠遠高于 WS-10465 (ZD-0465) -2002標準記載的方法制備的黃萱益肝散。

【具體實施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作更進一步的說明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解 本發(fā)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發(fā)明上述 內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0026] 實施例1 取土大黃291g、萱草103g、千里光92g、獼猴桃92g、紅土茯苓92g、野薔薇62g、獐芽菜 62g、騷羊古62g、南五味子62g :取野薔薇、騷羊古、南五味子，粉碎成細粉，加入到CO2超臨 界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa， 溫度40°C，CO 2流量2ml/g生藥· min，萃取時間150min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的 野薔薇、騷羊古、南五味子殘渣與其他六味藥材，粉碎，加入5L的60%乙醇，投入微波萃取裝 置中進行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大 孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得 微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成 200片，每片重0. 5g。
[0027] 經(jīng)檢測，成品中大黃素的含量為4. 02mg/片。
[0028] 實施例2 取土大黃291g、萱草103g、千里光92g、獼猴桃92g、紅土茯苓92g、野薔薇62g、獐芽菜 62g、騷羊古62g、南五味子62g :取野薔薇、騷羊古、南五味子，粉碎成細粉，加入到CO2超臨 界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力30MPa， 溫度50°C，CO 2流量3ml/g生藥· min，萃取時間130min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的 野薔薇、騷羊古、南五味子殘渣與其他六味藥材，粉碎，加入5L的60%乙醇，投入微波萃取裝 置中進行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大 孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得 微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成 200片，每片重0. 5g。
[0029] 經(jīng)檢測，成品中大黃素的含量為2. 03mg/片。
[0030] 實施例3 取土大黃291g、萱草103g、千里光92g、獼猴桃92g、紅土茯苓92g、野薔薇62g、獐芽菜 62g、騷羊古62g、南五味子62g :取野薔薇、騷羊古、南五味子，粉碎成細粉，加入到CO2超臨 界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力20MPa， 溫度30°C，CO 2流量lml/g生藥· min，萃取時間170min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的 野薔薇、騷羊古、南五味子殘渣與其他六味藥材，粉碎，加入5L的60%乙醇，投入微波萃取裝 置中進行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大 孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得 微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成 200片，每片重0. 5g。
[0031] 經(jīng)檢測，成品中大黃素的含量為3. 17mg/片。
[0032] 實施例4 :黃萱益肝片抑制小鼠畸胎瘤細胞F9細胞增殖的實驗研究資料 1.實驗材料 1. 1實驗用細胞株 小鼠畸胎瘤細胞F9細胞，山東大學(xué)實驗室細胞庫，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0033] I. 2實驗藥物 研究藥物：本發(fā)明黃萱益肝片：按實施例1方法制備。
[0034] 藥液儲液：稱取IOOmg黃萱益肝片，溶于5ml無水乙醇中，0. 2Mm濾器過濾， 50(^ldoff管分裝，-20°C存儲，同時0. 2Mm濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
[0035] 1. 3實驗試劑 DMEM ( GIBCO公司Cat. No. 12100-061 Lot. No. 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技 有限公司Lot. No. 100419) ;NaHC03(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat. No. 11810-033 Lot. No. 1088387) Jrypsin (AMRESC0 公司）;EDTA (AMRESC0 公司）;Penicillin G Sodium Salt (AMRESC0公司I) !Streptomycin Sulfate(AMRESCO);無水乙醇（溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限公 司）；MTT (Biosharp 批號：0793) :PBS (實驗室自配）； 1. 4實驗器材 萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號：DMIL);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型 號：SPECTRAMX 190);C02培養(yǎng)箱（FORMA型號：3111);超凈臺（蘇凈集團安泰公司制造型號： SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號：S/N 020579);精密移液器(法國吉爾森公司型 號：P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號：BT323S);全自動高壓滅菌鍋（日本SANYO 公司型號：MLS-3020);臺式電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實驗設(shè)備公司型號：DHG9123A);冰 箱（西門子公司型號：KG18V21TI);液氮罐（CBS型號：2001);低速離心機(上海安亭科學(xué)儀 器廠型號：KA-1000) ;0.2Mm 濾器（MILLIP0RE 型號：SLGP033RB) ;lcm 培養(yǎng)皿（NEST 公司）、 96孔培養(yǎng)板（NEST公司）；細胞計數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0036] 2.實驗方法 1)F9細胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進行常規(guī)培養(yǎng)（10cm培養(yǎng)皿)，當(dāng)細胞生長至 對數(shù)期時，收集細胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0. 25%胰蛋白酶-0. 04%EDTA， 37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中， IOOOrpm離心5min，調(diào)整細胞懸液濃度3 X IO4個/ml。
[0037] 2)將細胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液18〇μ1，培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱 中（37°C，5%C0 2)常規(guī)培養(yǎng)。
[0038] 3)根據(jù)細胞生長情況，一般長至50%_70%，加入黃萱益肝片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0039] 4) 24h 后加入 2〇μ1 MTT 溶液（5mg/ml，即 0· 5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0040] 5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔如入20〇μ1二甲基亞砜，置搖床 上低速振蕩l〇min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0041] 6)同時設(shè)置本底(不加細胞，只加培養(yǎng)液)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介 質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個復(fù)孔。
[0042] 7)結(jié)果以藥物對細胞的抑制率表示：細胞增值抑制率（%)=(對照孔OD值-給藥 孔OD值)、對照孔OD值X 100%。實驗重復(fù)3次。
[0043] 3.統(tǒng)計處理 采用Microsoft Excel 2007軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗，數(shù)據(jù)以mean土S. D .表不。
[0044] 4.實驗結(jié)果 MTT法實驗后統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組比較，當(dāng)劑量達到5mg/ml時，對F9細胞增殖抑 制有差異（P〈〇. 05)，劑量在lOmg/ml時該差異具有顯著性（P〈0. 01)，當(dāng)劑量達到15-20mg/ ml時有極顯著性差異（P〈0. 001)。
[0045] 表1黃萱益肝片對F9細胞增殖抑制影響研究（X土 SD)

【權(quán)利要求】
1. 一種黃萱益肝片的制備方法，由土大黃291g、萱草103g、千里光92g、稱猴桃92g、紅 土茯苓92g、野薔薇62g、獐芽菜62g、騷羊古62g、南五味子62g作為原料藥制成，其特征在 于，所述的制備方法由下列步驟組成：取野薔薇、騷羊古、南五味子，粉碎成細粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力 20-30MPa，溫度30-50°C，C02流量l-3ml/g生藥.min,萃取時間130-170min，得超臨界萃取 物，備用；萃取后的野薔薇、騷羊古、南五味子殘渣與其他六味藥材，粉碎，加入5L的60%乙 醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并 萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓 回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙 醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0. 5g。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃萱益肝片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中 夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃萱益肝片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中 萃取壓力為25MPa。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃萱益肝片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中 萃取溫度為60°C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃萱益肝片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中 CO2 流量 2ml/g 生藥? min。
6. 據(jù)權(quán)利要求1所述的黃萱益肝片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中萃 取時間為150min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃萱益肝片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取功率為 700W。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃萱益肝片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取每次萃 取時間為8分鐘。
9. 權(quán)利要求1所述的黃萱益肝片在制備抑制小鼠畸胎瘤細胞F9細胞增殖藥物中的應(yīng) 用。
【文檔編號】A61P31/20GK104324288SQ201410638423
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】權(quán)棟棟, 王洪濤, 劉艷輝, 權(quán)威宇, 胡乃合 申請人:山東中大藥業(yè)有限公司