曲美替尼在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥物應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了曲美替尼在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物中的應(yīng)用。曲美替尼可顯著逆轉(zhuǎn)由膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥性，使得P-糖蛋白高表達(dá)細(xì)胞恢復(fù)對(duì)抗癌藥物的敏感性。所述逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物可將曲美替尼與抗癌藥物合用，通過(guò)恢復(fù)抗性細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏感性，達(dá)到抗性腫瘤的治療與控制效果。
【專利說(shuō)明】曲美替尼在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種曲美替尼在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥 性藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是我國(guó)攻關(guān)的重點(diǎn)疾病之一。腫瘤治療過(guò)程中的一大缺點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞對(duì) 常規(guī)抗癌化療藥產(chǎn)生原發(fā)或誘發(fā)性的耐藥性，導(dǎo)致臨床化療失敗。腫瘤細(xì)胞在化療的過(guò)程 中長(zhǎng)期接觸某一種化療藥物，不僅會(huì)產(chǎn)生對(duì)這一藥物的抗性，還會(huì)對(duì)其他結(jié)構(gòu)和功能不同 的多種化療藥物產(chǎn)生交叉抗性，這種現(xiàn)象被稱作多藥耐藥（MDR)。因此，腫瘤耐藥基因的表 達(dá)和逆轉(zhuǎn)MDR的研究成為腫瘤治療亟待解決的問題。MDR的發(fā)生與多種因素有關(guān)，目前研 究最廣泛的是ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette, ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，目前已經(jīng)明確了 49種 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，都有共同的ATP結(jié)合域，水解ATP釋放能量將藥物泵出膜外，這些膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 降低了多藥耐藥腫瘤細(xì)胞內(nèi)抗腫瘤藥物的積累和滯留，使藥物濃度低于治療濃度的閾值， 因?yàn)橄拗屏四[瘤細(xì)胞的殺滅。哺乳動(dòng)物中相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子水平的研究，已能分離和描述 多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因編碼，主要的三種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括P-糖蛋白（P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白 (MRP)和乳腺癌耐藥蛋白（BCRP)。P-糖蛋白是一種能量依賴性藥泵，可以將藥物從胞內(nèi)泵 至胞外，從而降低藥物在MDR細(xì)胞內(nèi)的濃度進(jìn)而導(dǎo)致治療失敗，其耐藥譜主要為來(lái)源于天 然的抗癌藥物，如蒽環(huán)類、長(zhǎng)春堿類、鬼白毒素類、紫杉醇類等。
[0003] 理論上，克服多藥耐藥有兩種途徑，一是開發(fā)對(duì)MDR細(xì)胞不具有抗藥性的新抗癌 藥物；二是尋找MDR逆轉(zhuǎn)劑與抗癌藥物合用，恢復(fù)MDR細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏感性。后者是一 種較為有前景的想法。P-gp并不是腫瘤細(xì)胞特有的，在正常組織細(xì)胞如肝、腎、腸等也表達(dá) MDR，其生理功能與解毒和分泌有關(guān)。近幾年，有人同時(shí)去除小鼠的多藥耐藥基因 mdrla和 mdrlb，結(jié)果小鼠仍然可以健康存活，這表明P-gp并不是動(dòng)物基本生理功能所必須的成分。 已有報(bào)道P-gp的抑制劑與抗癌藥物合用能抑制多藥耐藥基因的表達(dá)和降低對(duì)阿霉素抗藥 性的誘發(fā)率。這表明在腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)抗藥性前，逆轉(zhuǎn)劑與抗癌藥物合用也有補(bǔ)益。
[0004] 人們?yōu)榱藢ふ矣行У哪孓D(zhuǎn)劑進(jìn)行了廣泛的研究。1982年鈣通道的阻斷劑維拉帕米 VerapamiI (VRP)被發(fā)現(xiàn)具有體外逆轉(zhuǎn)MDR的作用，標(biāo)志著第一代MDR逆轉(zhuǎn)劑產(chǎn)生，但由于 其心血管的毒副作用，使其達(dá)不到具有逆轉(zhuǎn)MDR作用的血藥濃度而不能用于體內(nèi)逆轉(zhuǎn)MDR。 類似的研究還有鈣調(diào)素的抑制劑、環(huán)孢霉素 A及多種多樣的親脂性陽(yáng)離子化合物等。以瑞 士 Ssdonz公司開發(fā)的PSC833為代表的MDR逆轉(zhuǎn)劑的問世，標(biāo)志著第二代MDR逆轉(zhuǎn)劑產(chǎn)生。 第二代逆轉(zhuǎn)劑較第一代逆轉(zhuǎn)劑活性強(qiáng)，毒性低，體內(nèi)也具有逆轉(zhuǎn)MDR作用，但在臨床應(yīng)用未 見光輝前景。由于這類化合物影響著抗癌藥物的血藥動(dòng)力學(xué)，為了降低抗癌藥物的副作用 至可耐受程度，這類逆轉(zhuǎn)劑與抗癌藥物合用，必須減少抗癌藥物的給藥量至常規(guī)用量以下， 這也就限制了抗癌藥物本身的抗癌效果。
[0005] 新一代的逆轉(zhuǎn)劑，除了必須高效低毒外，還必須考慮逆轉(zhuǎn)劑對(duì)抗癌藥物吸收、代 謝、排泄的影響。新近，有報(bào)道化合物0C144-93具有強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)活性，其作用機(jī)理主要是與 Ρ-gp結(jié)合，從而影響Ρ-gp的藥泵功能。這種化合物不影響抗癌藥物的藥代動(dòng)力學(xué)，因此，抗 癌藥物與這類化合物合用時(shí)，抗癌藥不需減量，這標(biāo)志著第三代MDR逆轉(zhuǎn)劑的出現(xiàn)。
[0006] 曲美替尼（Trametinib)是激酶MEKl和MEK2的小分子抑制劑，2013年被美國(guó) FDA批準(zhǔn)用于治療黑色素瘤，作為一種單藥口服片劑，適用于攜帶原癌基因 BRAF V600E或 V600K突變的手術(shù)不可切除性黑色素瘤或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤成人患者的治療，已在臨床廣泛 應(yīng)用，但現(xiàn)有技術(shù)中并未研究曲美替尼的逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種曲美替尼 在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] 曲美替尼在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物中的應(yīng)用。Trametinib能夠逆轉(zhuǎn)多藥耐 藥細(xì)胞的抗藥性，即Trametinib能夠恢復(fù)P-gp介導(dǎo)的MDR細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)抗癌藥物的敏感性， 為耐藥腫瘤治療的藥物開發(fā)開辟一條嶄新的途徑。
[0010] 所述的逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物含有抗癌藥物成分。
[0011] 上述逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物還包括載體和助劑。
[0012] 上述逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物的劑型包括片劑、顆粒、膠囊、口服液或注射液。 [0013] 所述的抗癌藥物是指含有長(zhǎng)春堿類、蒽環(huán)類、紫杉醇類、喜樹堿類、鬼白毒素類抗 癌藥物中的一種或兩種以上的藥物。
[0014] 所述的長(zhǎng)春堿類化合物優(yōu)選硫酸長(zhǎng)春地辛、硫酸長(zhǎng)春新堿或長(zhǎng)春新堿；蒽環(huán)類化 合物優(yōu)選米托蒽醌或阿霉素；紫杉醇類化合物優(yōu)選紫杉醇或多西他賽；喜樹堿類化合物優(yōu) 選拓?fù)涮婵担还戆锥舅仡惢衔飪?yōu)選依托泊苷或替尼泊苷。
[0015] 所述載體優(yōu)選自乳糖、淀粉、明膠、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮 和水中的一種或兩種以上。
[0016] 所述的助劑包括崩解劑、潤(rùn)滑劑和助溶劑中的一種或兩種以上。
[0017] 所述的崩解劑優(yōu)選微晶纖維素；潤(rùn)滑劑優(yōu)選滑石粉、膠體硅膠、硬脂酸甘油酯、硬 脂酸鈣或鎂粉；助溶劑優(yōu)選甲磺酸、富馬酸、甘露醇、山梨醇單月桂酸酯、單硬脂酸酯或單油 酸酯。
[0018] 本發(fā)明通過(guò)耐藥細(xì)胞株進(jìn)行體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn),從功能、細(xì)胞、蛋白等多個(gè)水平進(jìn)行 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)曲美替尼能夠特異性的有效逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥，從而得出曲美替尼 能夠恢復(fù)MDR細(xì)胞對(duì)p-gp耐藥譜，如長(zhǎng)春堿類、蒽環(huán)類、紫杉醇類、喜樹堿類、鬼白毒素類抗 癌藥物的敏感性。
[0019] 將曲美替尼與抗癌藥物共同作用于P-gp高表達(dá)的耐藥細(xì)胞（KBv2J株及其親本細(xì) 胞（KB)株上，從功能、細(xì)胞、蛋白等多個(gè)層次評(píng)價(jià)曲美替尼逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的效果。應(yīng)用MTT 比色法檢測(cè)曲美替尼對(duì)耐藥細(xì)胞（KBv2tltl)和親本細(xì)胞（KB)的細(xì)胞毒性；將曲美替尼與抗癌 藥物共同作用，檢測(cè)其恢復(fù)耐藥細(xì)胞對(duì)抗癌藥物敏感性的效果；檢測(cè)曲美替尼在P-gp耐藥 細(xì)胞中介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯及凋亡；應(yīng)用Western Blot檢測(cè)曲美替尼對(duì)耐藥細(xì)胞中蛋白 表達(dá)水平的影響；應(yīng)用激酶反應(yīng)檢測(cè)曲美替尼對(duì)P-gp的ATP酶活性的影響；應(yīng)用體外移植 瘤實(shí)驗(yàn)探究曲美替尼體內(nèi)逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的耐藥細(xì)胞的耐藥性。
[0020] 本發(fā)明的應(yīng)用具有如下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
[0021] (1)曲美替尼能夠顯著逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞的多藥耐藥性，顯著恢復(fù)耐藥細(xì)胞對(duì)抗癌藥 物的敏感性；
[0022] (2)曲美替尼與抗癌藥物合用可以誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞的G2/M期阻滯進(jìn)而引起顯著的 耐藥細(xì)胞凋亡；
[0023] (3)在體內(nèi)試驗(yàn)中，曲美替尼可以顯著增加抗癌藥物對(duì)耐藥細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)抑 制作用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1?2分別為曲美替尼配合抗癌藥物長(zhǎng)春新堿對(duì)KB和KBv2tltl細(xì)胞生存率影響曲 線.
[0025] 圖3為曲美替尼對(duì)KB和KBv2c?細(xì)胞生存率影響曲線；
[0026] 圖4?5分別為曲美替尼配合抗癌藥物長(zhǎng)春新堿相比單獨(dú)情況下和空白對(duì)照組， KB和KBv2tltl細(xì)胞的周期分布情況和細(xì)胞周期分布情況柱狀圖；
[0027] 圖6?8分別為曲美替尼配合抗癌藥物長(zhǎng)春新堿相比單獨(dú)情況下和空白對(duì)照組， KB和KBv2tltl細(xì)胞的早期和晚期凋亡情況、早期和晚期細(xì)胞凋亡情況柱狀圖和相關(guān)蛋白表達(dá) 情況；
[0028] 圖9?11分別為曲美替尼配合抗癌藥物長(zhǎng)春新堿相比單獨(dú)情況下和空白對(duì)照組， 實(shí)驗(yàn)小鼠腫瘤大小對(duì)照?qǐng)D、腫瘤體積變化圖和瘤重對(duì)比圖；
[0029] 圖12為曲美替尼配合抗癌藥物長(zhǎng)春新堿相比單獨(dú)情況下和空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)小 鼠體重變化圖；
[0030] 圖13?14分別為曲美替尼配合抗癌藥物阿霉素對(duì)KB和KBv2tltl細(xì)胞生存率影響曲 線.
[0031] 圖15為曲美替尼對(duì)P-gp的ATP酶活性影響曲線；
[0032] 圖16為不同時(shí)間下曲美替尼對(duì)KB和KBv2qq細(xì)胞中P-gp表達(dá)情況的影響。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0034] 以下實(shí)施例中所用親本細(xì)胞（KB)為人口腔表皮樣癌細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞資源 中心，3111C0001CCC000163) ;P-gp高表達(dá)細(xì)胞（KBv2J是以KB細(xì)胞為親本，通過(guò)誘變劑甲 基磺酸乙酯刺激，然后在培養(yǎng)液中加入濃度遞增的長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)而得，在長(zhǎng)春新堿濃度為 200nM時(shí)生長(zhǎng)良好，較KB細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿耐藥約100倍。
[0035] 實(shí)施例1
[0036] (a)曲美替尼能夠顯著恢復(fù)耐藥細(xì)胞對(duì)抗癌藥物長(zhǎng)春新堿的敏感性
[0037] 分別將親本細(xì)胞（KB)和P-gp高表達(dá)細(xì)胞（KBv2J種于96孔板中（5000個(gè)/孔）， 4小時(shí)細(xì)胞貼壁完全以后，將長(zhǎng)春新堿分濃度梯度加入相應(yīng)孔中，加藥體積差異用磷酸鹽緩 沖液（PBS)補(bǔ)齊，72小時(shí)后，每孔加入0. 5mg/ml的噻唑藍(lán)（MTT) 10 μ L，37°C孵育4小時(shí)后， 吸去培養(yǎng)液，晾干后每孔加入50 μ L的二甲基亞砜（DMSO)溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀570nm處測(cè)量 OD值；將不同濃度（1 μ Μ、3μ M和1〇μ Μ)的曲美替尼與梯度濃度的長(zhǎng)春新堿組合后，重復(fù) 上述過(guò)程，并設(shè)置10 μ M維拉帕米與長(zhǎng)春新堿組合的對(duì)照，計(jì)算各組IC50,結(jié)果如表1所示。 由表1結(jié)果可以看出，曲美替尼可以顯著逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的多藥耐藥性，在IOyM 的濃度下，曲美替尼的逆轉(zhuǎn)效果接近傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米的2倍。
[0038] 記錄以上各組細(xì)胞的生存率，研究各組條件對(duì)KB和KBv2c?細(xì)胞生存率影響，結(jié)果分 別如圖1和圖2所示。單獨(dú)的曲美替尼在不同濃度下對(duì)KB和KB v2tltl細(xì)胞生存率影響如圖3 所示。由圖中結(jié)果可以看出，曲美替尼與長(zhǎng)春新堿的組合相比空白組和對(duì)照組對(duì)親本細(xì)胞 的生存率影響并不明顯，但耐藥細(xì)胞的生存率在加入曲美替尼或逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米后顯著降 低，而單獨(dú)使用曲美替尼時(shí)，其對(duì)KB和KB v2qq細(xì)胞生存率影響并無(wú)明顯差別，這說(shuō)明曲美替 尼顯著提高了耐藥細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿抗癌藥物的敏感性，從而顯著提高了長(zhǎng)春新堿對(duì)耐藥細(xì) 胞的殺滅效果。
[0039] 表1曲美替尼逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的多藥耐藥性效果比較
[0040]

【權(quán)利要求】
1. 曲美替尼在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的曲美替尼在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物中的應(yīng)用，其特征 在于：所述的逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物包含抗癌藥物成分。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的曲美替尼在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物中的應(yīng)用，其特征 在于：所述的逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物還包括載體和助劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的曲美替尼在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物中的應(yīng)用，其特征 在于：所述的逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物的劑型為片劑、顆粒、膠囊、口服液或注射液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的曲美替尼在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物中的應(yīng)用，其特征 在于：所述的抗癌藥物是指含有長(zhǎng)春堿類、蒽環(huán)類、紫杉醇類、喜樹堿類、鬼白毒素類藥物中 的一種或兩種以上的藥物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的曲美替尼在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物中的應(yīng)用，其特征 在于：所述的長(zhǎng)春堿類藥物是指硫酸長(zhǎng)春地辛、硫酸長(zhǎng)春新堿或長(zhǎng)春新堿；所述的蒽環(huán)類 藥物是指米托蒽醌或阿霉素；所述的紫杉醇類藥物是指紫杉醇或多西他賽；所述的喜樹堿 類藥物是指拓?fù)涮婵担凰龅墓戆锥舅仡愃幬锸侵敢劳胁窜栈蛱婺岵窜铡?br> 7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的曲美替尼在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物中的應(yīng)用，其特征 在于：所述的載體是指乳糖、淀粉、明膠、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮和 水中的一種或兩種以上。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的曲美替尼在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物中的應(yīng)用，其特征 在于：所述的助劑包括崩解劑、潤(rùn)滑劑和助溶劑中的一種或兩種以上。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的曲美替尼在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性藥物中的應(yīng)用，其特 征在于：所述的崩解劑是指微晶纖維素；所述的潤(rùn)滑劑是指滑石粉、膠體硅膠、硬脂酸甘油 酯、硬脂酸鈣或鎂粉；所述的助溶劑是指甲磺酸、富馬酸、甘露醇、山梨醇單月桂酸酯、單硬 脂酸酯或單油酸酯。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104434924SQ201410628593
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月10日
【發(fā)明者】石智, 邱建閣, 梅曉龍, 張文姬, 覃武明 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)