漢防己甲素作為制備白血病多藥耐藥逆轉劑的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及漢防己甲素作為制備白血病多藥耐藥逆轉劑的應用。本發(fā)明將漢防己甲素配合蒽環(huán)類化療藥物治療耐藥白血病，漢防己甲素在低濃度（0.5mg/L-2.0mg/L）范圍內，可以增加柔紅霉素對耐藥細胞的抑制作用，而對敏感細胞抑制作用變化不大，其機制涉及漢防己甲素抑制多藥耐藥基因mdr-1的擴增，從而抑制細胞表面多藥耐藥蛋白P-糖蛋白合成有關。小劑量漢防己甲素通過增強蒽環(huán)類化療藥物對耐藥白血病的抑制作用，避免單用化療藥物所導致的嚴重毒副作用，擴大漢防己甲素的應用范圍。
【專利說明】漢防己甲素作為制備白血病多藥耐藥逆轉劑的應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術領域】，涉及漢防己甲素作為白血病耐藥逆轉劑的應用。

【背景技術】
[0002] 近年來，急性白血病的誘導緩解率日益提高，但仍有20%?40%的患者不能達到完 全緩解，而多數(shù)緩解的患者又相繼出現(xiàn)了復發(fā)，多藥耐藥的發(fā)生是白血病患者復發(fā)的主要 原因。因而對臨床多藥耐藥發(fā)生的預防與逆轉已成為癌癥治療需要迫切解決的問題，也是 人們研究的熱點與難點領域。
[0003] 多藥耐藥性（multidrugresistance,MDR)是指抗某細胞毒藥物的耐藥細胞系接 觸了一種或幾種藥物后，不但對此藥產(chǎn)生耐藥性，而且對許多結構上無關的和作用機制不 同的其它抗癌藥物產(chǎn)生交叉耐藥性。目前認為MDR是腫瘤細胞對化療藥物毒性損傷的最重 要的自我保護防御機制，是腫瘤細胞耐藥的常見形式，也是白血病化療失敗和復發(fā)的主要 原因。MDR作用機制多樣并互相影響，越來越多的證據(jù)表明，過表達腫瘤細胞膜表面ATP-依賴的藥物外排泵P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp)是多藥耐藥產(chǎn)生的主要機制之一。 很多化療藥物，如蒽環(huán)類抗生素、紫杉醇等都能夠通過過度表達多藥耐藥基因Kmultidrug resistance1，mdrl)/P-gp途徑誘導腫瘤細胞耐藥。因而，有效的P-gp抑制劑可以抑制 P-gp對腫瘤藥物的外排作用，逆轉腫瘤多藥耐藥，提高化療效果。
[0004] P-gp抑制劑的研究發(fā)展迅速，第一代MDR逆轉劑主要包括鈣離子通道阻滯劑、蛋 白激酶C抑制劑、免疫抑制藥物及表面活化劑等，它們在體外試驗中，可以部分甚至完全逆 轉MDR。但是，它們無特異性作用靶點，而且主要是通過競爭性作用來抑制細胞毒藥物的泵 出，這樣就必然要增加這些逆轉劑的藥物濃度，而這些劑量往往是已經(jīng)超出了其在體內產(chǎn) 生毒性作用的最小劑量。第二代逆轉劑主要包括右旋維拉帕米（dexverapamil)、右旋尼 古地平（dexniguldipine)、環(huán)孢菌素類似物伐司樸達（valspodar, PSC833)和比立考達 (biricodar，VX2710)等，較第一代具有較低的毒副作用，而逆轉MDR的活性卻明顯增強，但 它們對化療藥物藥代動力學的影響成為臨床應用的一個主要障礙。對部分病人來說，化療 藥物的量可能是不足的，但對另外一部分病人來說，就可能已超過了最大耐受量。到目前為 止，MDR逆轉劑經(jīng)歷了第一、二代，目前已發(fā)展到第三代。其中環(huán)孢菌素D衍生物（PSC-833) 由瑞士諾華公司研制，是迄今為止國際上第一個進入到臨床隨機試驗的P-gp抑制劑，但由 于PSC-833臨床試驗未見明顯耐藥逆轉作用，目前其上市進程已被全面叫停，意味著目前 臨床上MDR面臨著無藥可用的境地。因此，繼續(xù)尋找新型低毒高效的MDR逆轉劑依然是目 前研發(fā)相關藥物的主要方向。
[0005] 從傳統(tǒng)中藥中開發(fā)耐藥逆轉劑是我們的一大優(yōu)勢，由于其低毒且源自天然植物 的特性，逐漸成為MDR抑制劑的研發(fā)重點。但目前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)中藥逆轉劑療效均較弱。 本課題組前期已進行大量實驗對多種多藥耐藥逆轉劑的不斷篩選，我們認為漢防己甲素 (tetrandrine，簡寫Tet,分子式C38H42N2O6，分子量 622. 75，CAS號 518-34-3)具有廣闊的 實際應用前景。它是從千金藤屬防己科植物粉防己的根中的提取的一種生物堿，屬雙芐基 異喹啉類化合物，能有效逆轉P-gp介導的多藥耐藥，且Tet屬于低毒類藥物，它們既無異 搏定等藥的嚴重心血管毒性反應，也無環(huán)孢霉素的嚴重毒性、免疫抑制及過敏反應，與抗腫 瘤藥物合用也不影響它們的藥代動力學，因此是非常具有開發(fā)前景的第三代MDR逆轉劑。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明所解決的技術問題是：提供了漢防己甲素在逆轉多藥耐藥白血病細胞上的 應用，通過抑制腫瘤細胞膜表面ATP-依賴的藥物外排泵P-糖蛋白以及多藥耐藥基因1 mdrl的表達，抑制P-gp對腫瘤藥物的外排作用，逆轉腫瘤多藥耐藥，提高化療效果。
[0007] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案是： 提供一種漢防己甲素作為制備白血病多藥耐藥逆轉劑的應用，所述白血病治療藥物為 蒽環(huán)類化療藥物，其中漢防己甲素的工作濃度為〇. 5mg/L至2.Omg/L之間。
[0008] 本發(fā)明的有益效果是：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點如下：采用中藥漢防己甲 素作為白血病耐藥逆轉劑，利用漢防己甲素在逆轉多藥耐藥白血病細胞上的應用，漢防己 甲素在低濃度（0. 5mg/L-2.Omg/L)范圍內，可以增加蒽環(huán)類化療藥物對耐藥細胞的抑制作 用，而對敏感細胞抑制作用變化不大，其機制涉及漢防己甲素抑制多藥耐藥基因mdr-Ι的 擴增，從而抑制細胞表面多藥耐藥蛋白P-糖蛋白合成，最終有效的逆轉腫瘤多藥耐藥，提 高化療效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1左為不同濃度漢防己甲素聯(lián)合柔紅霉素在體外作用K562白血病細胞48小時 后細胞增殖情況變化，右為不同濃度漢防己甲素聯(lián)合柔紅霉素在體外作用K562/A02白血 病耐藥細胞48小時后細胞增殖情況變化。
[0010] 圖2為漢防己甲素在體外作用白血病耐藥細胞48小時后細胞表面P-糖蛋白 (P-gp)表達變化。
[0011] 圖3為漢防己甲素在體外作用白血病細胞與耐藥細胞48小時后細胞p-gp編碼基 因mdrl變化。

【具體實施方式】
[0012] 下面將結合說明書附圖，對本發(fā)明作進一步的說明。
[0013] 實施例I:Tet聯(lián)合柔紅霉素（DNR)體外對人慢性粒細胞白血病急性紅白血病變細 胞株K562及其耐藥株K562/A02增殖影響。
[0014] 所用漢防己甲素為商品化純品（純度>98%)。
[0015] 取對數(shù)生長期細胞，接種于96孔板，每孔含2 X IO4個細胞懸液160uL，每張板加入 不同濃度漢防己甲素（〇mg/L、0. 5mg/L、l. 0mg/L、2. Omg/L)作用1小時，再按所設梯度加入 不同濃度柔紅霉素（終濃度50mg/L、25mg/L、12. 5mg/L、6. 25mg/L、3. 125mg/L、l. 5625mg/L 和0. 78125mg/L)，每個柔紅霉素濃度設5個復孔。另設不加逆轉劑、不加柔紅霉素、不加細 胞的對照組，調整每孔體積均為200uL。置于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱孵育48小時后取出， 加5mg/ml的四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)20ul，繼續(xù)培養(yǎng)4小 時時后，于平板離心機上離心10分鐘，棄上清，每孔加IOOuL二甲基亞砜溶解，微量振蕩器 混勻，酶標儀上測定570nm處吸光度（A)(圖1)。
[0016] 計算細胞的生長抑制率：生長抑制率（％ ) = (1-試驗孔A/對照孔A)X100 %。根 據(jù)回歸方程求出IC50 (DNR的半數(shù)抑制量），并計算逆轉倍數(shù)：逆轉倍數(shù)=不加逆轉劑時的 IC50/加逆轉劑后的IC50。
[0017] 結果顯不，漢防己甲素（0mg/L、0. 5mg/L、I. 0mg/L、2.Omg/L)聯(lián)合柔紅霉素對K562 細胞無明顯的增效作用，對K562/A02細胞有明顯的逆轉耐藥作用，且這種作用具有濃度依 賴性。不同濃度漢防己甲素對白血病細胞K562和耐藥細胞K562/A02處理，低濃度漢防己 甲素（< 2mg/L)可增強蒽環(huán)類化療藥物對白血病耐藥細胞的抑制作用；而單用化療藥物， 若要達到相同抑制作用，則需要很高藥物濃度，這樣會增加毒副作用。
[0018] 實施例2流式細胞術檢測白血病耐藥細胞K562/A02表面P-糖蛋白 (P-glycoprotein，Ρ-gp)表達 細胞分組加入所設濃度漢防己甲素（〇mg/L、0. 5mg/L、l. 0mg/L、2.Omg/L)，于37°C、 5%C02培養(yǎng)箱孵育48小時，收集細胞。離心濃縮各實驗組細胞（每組細胞數(shù)為IXIO6個）， 冷PBS液洗3次，1500轉/分鐘離心5分鐘，棄上清，加入P-gp單抗5μ1(標有熒光素PE)。 避光、常溫保存20分鐘后加生理鹽水洗1次，1500轉/分鐘離心5分鐘，棄上清，加0. 5ml 生理鹽水，上流式細胞儀檢測。
[0019] 結果顯示，漢防己甲素（0mg/L、0. 5mg/L、l. 0mg/L、2.Omg/L)作用白血病耐藥細胞 株K562/A02后，流式細胞儀分析結果顯示隨著漢防己甲素濃度增大，細胞表面P-gp表達逐 漸下降，表明漢防己甲素能夠抑制耐藥蛋白P-gp的表達。
[0020] 實施例3半定量逆轉錄聚合酶鏈反應（reversetranscriptpolymasechain reaction，RT-PCR)方法檢測多藥耐藥基因I(multidrugresistance1，mdrl)mRNA表達 水平 取K562/A02細胞（終濃度2X 104mL，每組4mL)，分組加入所設終濃度漢防己甲素(0mg/L、0. 5mg/L、I. 0mg/L、2. 0mg/L)，于37 °C、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48小時后收集 細胞。采用TRIzol (invitrogen)-步法提取總RNA，按RT-PCR試劑盒（大連寶生物工 程有限公司）說明書進行操作擴增mdrl基因片段（436bp)以及β-actin基因片段（270 bp)，mdrl上游引物（SEQ ID N0:l)5'-TGGTTTGATGTGCACGATGTTGGG-3'；mdrl下游引物 (SEQ ID NO: 2)5，-AGATCAGCAGGAAAGCAGCACCTA-3' ；β -actin上游引物（SEQ ID NO: 3) 5' -ACACTGTGCCCATCTACGAGGGG-3'；P-actin下游引物（SEQ ID N0:4)5, -ATGATGAGTTGAA GGTAGTTTCGTGGAT-3'；逆轉錄反應條件：42°C 30分鐘，99°C 5分鐘，5°C 5分鐘；PCR 反應條件為：變性95秒，退火55秒，延伸72秒，循環(huán)35次。取擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電 泳，掃描定量，用凝膠分析軟件得出mdrl/β -actin比值（圖3)。
[0021] 結果顯示，漢防己甲素（0mg/L、0. 5mg/L、L0mg/L、2. 0mg/L)作用白血病耐藥細胞 株K562/A02后，RT-PCR結果顯示隨著漢防己甲素濃度的增加，mdrl基因表達逐漸下降。表 明漢防己甲素可以從基因水平抑制耐藥基因mdrl的表達。
[0022] 以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術 人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變 化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其 等效物界定。
【權利要求】
1. 一種漢防己甲素作為制備白血病多藥耐藥逆轉劑的應用。
2. 根據(jù)權利要求1所述一種漢防己甲素作為制備白血病耐藥逆轉劑的應用，其特征在 于，所述白血病治療藥物為蒽環(huán)類化療藥物。
3. 根據(jù)權利要求1所述漢防己甲素作為制備白血病多藥耐藥逆轉劑的應用，其特征在 于，所述漢防己甲素的工作濃度為〇. 5mg/L至2. Omg/L之間。
【文檔編號】A61K31/4748GK104398515SQ201410626423
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月7日 優(yōu)先權日:2014年11月7日
【發(fā)明者】陳寶安, 王飛, 程堅, 李靜 申請人:東南大學