Sns-032在制備治療彌漫性大b淋巴瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了SNS-032在制備治療彌漫性大B淋巴瘤藥物中的應(yīng)用，SNS-032能抑制NF-κB蛋白的表達(dá)，并下調(diào)其磷酸化蛋白表達(dá)；SNS-032能明顯抑制彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，本發(fā)明的SNS-032是可用于開(kāi)發(fā)治療彌漫性大B淋巴瘤等疾病的藥物，將為患者帶來(lái)新的希望。
【專(zhuān)利說(shuō)明】SNS-032在制備治療彌漫性大B淋巴瘤藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，具體涉及SNS-032在制備治療彌漫性大B淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin, s lymphoma, NHL)是目前發(fā)病率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤，其中彌漫性大B淋巴瘤(diffuse large b-cell lymphoma, DLBCL)是最常見(jiàn)的NHL。DLBCL是大B型淋巴細(xì)胞彌漫性惡性增生性疾病，在最近的10-20年間發(fā)病率逐漸增力口。DLBCL在西方國(guó)家占成人非霍奇金淋巴瘤30-40%，在發(fā)展中國(guó)家高達(dá)60%。按照腫瘤細(xì)胞來(lái)源和臨床表現(xiàn)DLBCL分為生發(fā)中心B細(xì)胞樣的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(GCB-DLBCL);活化性B細(xì)胞樣彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(ABC-DLBCL);原發(fā)性縱膈B細(xì)胞淋巴瘤(PMBL)三型。迄今，R-CHOP (Rituximab，聯(lián)合環(huán)磷酰胺，阿霉素度，長(zhǎng)春新堿，強(qiáng)的松)被國(guó)際上公認(rèn)為治療侵襲性NHL的經(jīng)典療法，在治療低度惡性NHL特別是GCB型DLBCL取得了良好的效果。然而在用藥過(guò)程中產(chǎn)生了極大的耐藥復(fù)發(fā)問(wèn)題及并發(fā)癥(支氣管痙攣、心律失常、肝功能衰竭、呼吸困難等)，嚴(yán)重影響了治療效果，迫切需要篩選出作用機(jī)制各異的有效化合物能夠有效治療DLBCL。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B (nuclear transcript1n factor κ B, NF- κ B)是廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白，具有重要的生理功能:與免疫細(xì)胞活化，Τ、B淋巴細(xì)胞發(fā)育、增殖、凋亡等細(xì)胞生理發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)。可調(diào)控多種編碼細(xì)胞因子、粘附分子、趨化因子、免疫因子、氧化應(yīng)激相關(guān)酶及轉(zhuǎn)錄因子等基因，從而發(fā)揮包括調(diào)控炎癥免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、自身轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、腫瘤發(fā)生及耐藥等作用。目前已發(fā)現(xiàn)NF- κ B在多發(fā)性骨髓瘤、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、白血病、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等中異?；罨蔀槟[瘤預(yù)后不良的分子指標(biāo)之一。多項(xiàng)研究表明抑制NF- κ B信號(hào)傳導(dǎo)通路可導(dǎo)致DLBCL細(xì)胞株增殖抑制發(fā)生凋亡，因此，NF- κ B信號(hào)通路逐漸成為治療DLBCL，克服DLBCL對(duì)傳統(tǒng)化療藥物耐受的新靶點(diǎn)。
[0003]SNS-032 (BMS-387032)是一種新型的氨噻唑化合物，因其對(duì)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, Q)K)的活性具有抑制作用,最先被定義為Q)K2, 7,9的激酶抑制劑。已有報(bào)道證明SNS-032可用于多種腫瘤，如急性粒細(xì)胞性白血病(AML)Vg性淋巴性白血病(CLL)、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、腸癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)等的治療，但目前SNS-032只處于CLL、麗及其轉(zhuǎn)移性難治性實(shí)體瘤的I期臨床試驗(yàn)階段。我們的研究表明，SNS-032的抗腫瘤作用可以通過(guò)下調(diào)NF-κ B的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
[0004]我們進(jìn)一步研究化療藥物SNS-032促進(jìn)對(duì)彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制目的在于如何提高化療藥物的療效，制定新的治療策略，擴(kuò)大藥物的應(yīng)用范圍。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供SNS-032 (BMS-387032)的一種新用途，具體是SNS-032在制備治療彌漫性大B淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小分子化合物SNS-032能抑制NF- κ B蛋白的表達(dá)，并下調(diào)其磷酸化蛋白表達(dá)；SNS-032能明顯抑制彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，本發(fā)明的SNS-032是可用于開(kāi)發(fā)治療彌漫性大B淋巴瘤等疾病的藥物，將為患者帶來(lái)新的希望。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0007]圖1為SNS-032在彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞對(duì)NF-κ B表達(dá)的Western blot檢測(cè)圖，圖中“GAPDH”為蛋白定量的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)；
圖2為SNS-032對(duì)彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞的劑量-細(xì)胞活力曲線和半數(shù)抑制率的示意圖；
圖3為SNS-032誘導(dǎo)彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定圖，該圖表明SNS-032誘導(dǎo)彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞凋亡。
[0008]【具體實(shí)施方式】:
以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0009]實(shí)施例一:SNS_032在彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞對(duì)NF- κ B表達(dá)的影響
采用彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞系SU-DHL-4 and SU-DHL-2細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)在SU-DHL-4 and SU-DHL-2細(xì)胞的培養(yǎng)體系中分別加入不同濃度的SNS-032，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。對(duì)照組細(xì)胞或經(jīng)不同濃度藥物處理后的細(xì)胞，離心去除上清，用PBS洗2次。細(xì)胞加入RIPA緩沖液，冰上孵育30 min，超聲粉碎，4°C、14000 rpm離心10 min，取上清。用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。取20 μ g蛋白經(jīng)12% SDS-聚丙稀酰胺電泳(SDS-PAGE)分離。電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上。5%脫脂牛奶封閉I h，加一抗，40C搖床過(guò)夜，PBST洗3次，用HRP標(biāo)記的抗鼠或抗兔二抗反應(yīng)I h，PBST緩沖液洗2次，PBS緩沖液洗I次。ECL顯影暗室曝光。
[0010]蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，SNS-032在SU-DHL-4 and SU-DHL-2細(xì)胞呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性下調(diào)NF- κ B水平，說(shuō)明SNS-032對(duì)彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞有效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.5 μ M的SNS-032能顯著抑制彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞的表達(dá)，相應(yīng)的磷酸化形式的蛋白水平也受到抑制。
[0011]結(jié)論:SNS_032誘導(dǎo)彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞NF- κ B蛋白的表達(dá)。
[0012]實(shí)施例二:MTS法測(cè)定SNS-032對(duì)彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞增殖的影響
用MTS法檢測(cè)了 SNS-032是否對(duì)彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞增殖有抑制作用。我們用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SU-DHL-4和SU-DHL-2細(xì)胞分別接種于96孔板，每孔20000個(gè)細(xì)胞。設(shè)空白組(僅加培養(yǎng)液)對(duì)照組和藥物系列倍比稀釋組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。每孔容積為100 μ?。加不同濃度的SNS-032，培養(yǎng)48小時(shí)終止。在終止培養(yǎng)前4 h，加MTS 20 μ?/孔。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀讀取吸光度值(A值)。按公式計(jì)算細(xì)胞活力(Cell Viability)，細(xì)胞活力=(藥物處理組A值-空白組A值)/ (對(duì)照組A值-空白組A值)X100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。繪制細(xì)胞活力(Cell Viability) vs藥物濃度曲線。
[0013]如圖2所示，SU-DHL-4和SU-DHL-2細(xì)胞的IC50分別是0.16和0.26 μ Μ，提示SNS-032對(duì)彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞的高效性。
[0014]結(jié)論:SNS_032在低濃度水平顯著抑制彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞株的增殖。
[0015]實(shí)施例三:Annexin V/PI雙標(biāo)記法流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡采用Annexin V-FITC/PI標(biāo)記法用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡。對(duì)照組細(xì)胞或經(jīng)不同濃度藥物處理后的細(xì)胞，在不同時(shí)間收取，離心去除上清，用I結(jié)合緩沖液洗滌一次，將細(xì)胞懸液和FTIC-Annexin V混合，室溫孵育15 min,PI (碘化丙啶)染色細(xì)胞，迅速用流式細(xì)胞儀分析。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。
[0016]結(jié)果如圖3 所示，0.5 μ M SNS-032 處理 SU-DHL-4 and SU-DHL-2 細(xì)胞 36 小時(shí)后，凋亡細(xì)胞分別達(dá)73%和38%。
[0017]結(jié)論:SNS_032可誘導(dǎo)彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞株凋亡。
[0018]基于上述實(shí)施例一至三的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，3吧-032通過(guò)抑制細(xì)胞即-1^8蛋白的表達(dá)，從而明顯抑制彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為臨床上彌漫性大B淋巴瘤的藥物治療提供了新的備選小分子化合物與新的思路。
【權(quán)利要求】
1.SNS-032在制備治療彌漫性大B淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/454GK104382903SQ201410595734
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】師憲平 申請(qǐng)人:師憲平