一種治療肉雞腹水征合癥的rna干擾藥物的制備方法和用途及其藥效驗證方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的制備方法和用途及其藥效驗證方法，首先構(gòu)建慢病毒表達載體-HIF-1α-shRNAi，然后將HIF-1α-shRNAi重組質(zhì)包裝成藥劑，再注射粒肉雞體內(nèi)，沉默HIF-1α基因，抑制下游基因血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、體內(nèi)內(nèi)皮素-1(ET-1)、胰島素樣生長因子II(IGF-II)等表達，控制肺血管重構(gòu)(PVR)現(xiàn)象，減少心肺功能損傷與腹水形成，最終實現(xiàn)臨床肉雞腹水征合癥治療。本發(fā)明具有特異性、高效性及多能性等治療方面的優(yōu)點。
【專利說明】一種治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的制備方法和用途及其藥效驗證方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因治療【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的研制方法。

【背景技術(shù)】
[0002]肉雞腹水綜合征(ascites syndrome,AS)又稱肉雞肺動脈高壓綜合征(pulmonaryhypertens1n syndrome, PHS),是在各種因素作用下造成肉雞相對缺氧或肉雞生長過快，肺的容積與體重的增加不成正比，在此情況下，由于氧無法滿足機體的正常需要，致使其呈現(xiàn)血液黏稠、血容量增加、肝腫大、肺瘀血水腫及肺動脈高壓等病理現(xiàn)象，這種在臨床上以腹腔積液和右心室肥大、擴張等為主要特征，被視為一種營養(yǎng)代謝病，也是公認的嚴重危害肉雞養(yǎng)殖業(yè)的疾病之一。該病以肉雞多發(fā)，冬季和早春易發(fā)，且分布范圍廣。北美、玻利維亞、秘魯、墨西哥、南非、英國、美國、澳大利亞、德國、加拿大、意大利、日本等國家。近年來全球?qū)S調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病率達10%?40%，呈上升趨勢，平均發(fā)病率為4.2%，年死亡率超過25%，每年約有70億只肉雞受到腹水綜合征的侵害，經(jīng)濟損失高達100億美元。顯然該病業(yè)已成為嚴重危害肉雞養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的全球性問題。
[0003]自從肉雞AS報道以來，不斷有國內(nèi)外學(xué)者對其病因進行了大量的研究，他們認為大多數(shù)肉雞AS的誘發(fā)原因主要源于生長過快、組織缺氧、飼養(yǎng)密度過高、海拔過高、溫度過低、高鈉日糧及低硒日糧、低磷、低VC、VE等因素。其原因是這些誘因均可引起機體相對性缺氧，而對氧的消耗量已超過其心肺功能供氧的極限臨界點，以致于機體處于缺氧狀態(tài)，最終導(dǎo)致肺動脈高壓而形成腹水。
[0004]近年來，有關(guān)HIF-1 α與肉雞AS的研究也有些許報道，曾秋鳳等采用RT-PCR技術(shù)檢測正常肉雞和AS患雞肺臟HIF-1 a mRNA,結(jié)果表明，AS患雞肺臟HIF-1 a mRNA表達豐度極顯著高于正常肉雞(P < 0.01)，揭示了 HIF-1 α與腹水綜合征高度相關(guān)性。Zhang等證明了肉雞食用高鹽的飲水可以增加HIF-1a mRNA表達，引起肉雞腹水發(fā)生。Toshiyuki等對雞胚心室肌細胞中HIF-1 α基因進行了 cDNA克隆，得到了 HIF-1 α基因全長cDNA序列等。但是利用阻斷HIF-1 α基因在肉雞AS治療上還未見相關(guān)研究，因此，抑制HIF-1 α的活性為治療肉雞AS提供了新靶點。目前，RNA干擾HIF-1 α基因的國內(nèi)外研究主要在哺乳動物和人的研究較多，在腫瘤疾病中治療，如Wang等通過HIF-1 a -shRNAi轉(zhuǎn)染到人乳腺癌細胞中，發(fā)現(xiàn)HIF-1a與VEGF基因表達量分別下降了 91.63%、66.8%，從而抑制乳腺癌細胞的生長。Zhou等應(yīng)用RNA干擾HIF-1 α將有效地抑制口腔鱗狀細胞癌的發(fā)展，特別是抑制和預(yù)防癌癥細胞的血管生成和生存，因此，它可以作為一種強有力的和特定的治療口腔癌。Chen等利用RNA干擾HIF-1 α在小鼠腫瘤研究中，發(fā)現(xiàn)HIF-1 α和血管內(nèi)皮生長因子的表達明顯減少，抑制腫瘤血管生成和減毒轉(zhuǎn)移，顯著抑制腫瘤的生長。Min等在人肺腺癌多藥耐藥細胞的RNA干擾HIF-1 α實驗中發(fā)現(xiàn)多藥耐藥基因及蛋白顯著減少。此外，RNA干擾還在肝、呼吸系統(tǒng)及眼科等疾病中也得到廣泛應(yīng)用。以上RNA干擾HIF-1 α基因的研究成果為本發(fā)明探索RNA干擾HIF-1 α基因?qū)θ怆u腹水的形成機理提供了非常重要的思路。
[0005]綜上所述，肺動脈高壓是對適應(yīng)缺氧反應(yīng)時機體的一種表現(xiàn)，同時在許多疾病中也是一種重要的病理生理癥狀。目前的研究發(fā)現(xiàn)，HIF-Ια是調(diào)控肺動脈高壓的中心環(huán)節(jié)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的研制方法，本發(fā)明利用RNA干擾技術(shù)來阻斷HIF-1 α基因在肉雞PAEC/肉雞AS中有效作用。主要通過檢測HIF-1 a ,ET-UVEGF基因表達及生理生化指標情況，進一步研究參與低氧環(huán)境中PAEC增殖與凋亡的作用機制等，并更深入地從分子水平上闡明RNA干擾HIF-1 α在肉雞AS發(fā)生作用機制，將可能為臨床肉雞AS的預(yù)防和治療提供一種新的途徑和方法。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0008]一種治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的制備方法，首先構(gòu)建慢病毒表達載體-HIF-1 a -shRNAi，然后將HIF_1 a -shRNAi重組質(zhì)粒包裝成藥劑，即為治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物。
[0009]作為本發(fā)明進一步的方案:HIF-1 a -shRNAi的慢病毒表達載體的構(gòu)建:采用DNA重組技術(shù)將HIF-1 a -RNAi雙鏈定向亞克隆入PU6啟動子即可。
[0010]作為本發(fā)明進一步的方案:所述HIF-1 a -shRNAi的慢病毒表達載體的構(gòu)建:采用pGCSIL-GFP載體，轉(zhuǎn)染細胞為293T細胞。
[0011]所述的制備方法制備的治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的應(yīng)用，將治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物注射到粒肉雞體內(nèi)，沉默HIF-1 α基因，抑制下游基因血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、體內(nèi)內(nèi)皮素-1 (ET-1)、胰島素樣生長因子II(IGF-1I)的表達。
[0012]作為本發(fā)明進一步的方案:所述的應(yīng)用的藥效驗證方法，包括:(1)RNA干擾HIF-1 α基因?qū)θ怆uPAEC生長實驗和(2) RNA干擾HIF-1 α基因在肉雞體內(nèi)對腹水形成實驗;
[0013]步驟(I) RNA干擾HIF-1 α基因?qū)θ怆uPAEC生長實驗，具體包括:(1.1)鑒定RNA干擾靶點是否成功連接到慢病毒載體；(1.2) HIF-1 a -shRNAi細胞轉(zhuǎn)染；(1.3)模擬缺氧實驗；(1.4)細胞的爬片與DAPI染色；(1.5) HIF-la, VEGF、ET-1基因表達量的檢測；
[0014]步驟(2)RNA干擾HIF-1a基因在肉雞體內(nèi)對腹水形成實驗，具體包括:(2.1)人工誘導(dǎo)肉雞腹水征合癥試驗；(2.2)動物分組；(2.3)動物接種；(2.4)檢測。
[0015]作為本發(fā)明進一步的方案:步驟(1.2) HIF-1 a -shRNAi細胞轉(zhuǎn)染是借助Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染細胞，篩選出最佳的干擾祀點。
[0016]作為本發(fā)明進一步的方案:步驟(2.1)人工誘導(dǎo)肉雞腹水征合癥試驗是采用三利用環(huán)境低溫、飼料添碘甲狀腺原氨酸(T3)誘發(fā)肉雞腹水征合癥。
[0017]作為本發(fā)明進一步的方案:步驟⑴RNA干擾HIF-1 α基因?qū)θ怆uPAEC生長實驗:通過RNA干擾技術(shù)、細胞轉(zhuǎn)染進行分組實驗，利用RT-PCR、熒光定量PCR、Western Blot流式細胞儀檢測方法對HIF-1 a、VEGF、ET-1基因表達進行檢測以驗證RNA干擾HIF-1 α基因在肉雞PAEC中的效果。
[0018]作為本發(fā)明進一步的方案:步驟⑵RNA干擾HIF-1a基因在肉雞體內(nèi)對腹水形成實驗:擇用正常肉雞和人工誘導(dǎo)的腹水征合癥肉雞為實驗對象，采用RNA干擾技術(shù)進行肉雞體內(nèi)實驗，以測定肉雞中右心室重與全心室重的比值(RV/TV)、紅細胞總數(shù)(PCV)、紅細胞壓積(HCT)、血紅蛋白含量(Hb)、血清中丙二醛(MDA)、胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、乳酸脫氫酶(LDH)指標，從而分析RNA干擾HIF-Ια對肉雞腹水發(fā)病過程中生理生化指標的變化；與此同時，再通過RT-PCR、實時熒光定量PCR、Western Blot、免疫組化方法檢測各組織中的HIF-1 a、VEGF、ET-1基因mRNA的表達情況；最終結(jié)合以上實驗結(jié)果，驗證肉雞體內(nèi)RAN干擾HIF-1 α對肉雞腹水形成的影響
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0020]本發(fā)明采用RNA干擾技術(shù)，將對肉雞體內(nèi)的缺氧誘導(dǎo)因子-1 a (HIF_1 α )進行沉默，達到治愈肉雞腹水綜合征效果；通過RNA干擾技術(shù)、細胞轉(zhuǎn)染等進行分組實驗，利用RT-PCR、熒光定量PCR、Western Blot流式細胞儀等檢測方法對HIF-1 α、VEGF, ET-1基因表達進行檢測以驗證RNA干擾HIF-1 α基因在肉雞中的治療效果；證實了該RNA干擾藥物可應(yīng)用于肉雞腹水征合癥治療，且具有特導(dǎo)、高效性、多能性及治療效果好等方面的優(yōu)點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的研制方法的技術(shù)路線圖。

【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合【具體實施方式】對本專利的技術(shù)方案作進一步詳細地說明。
[0023]請參閱圖1，一種治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的制備方法，首先構(gòu)建慢病毒表達載體-HIF-1 a -shRNAi，然后將HIF_1 a -shRNAi重組質(zhì)粒包裝成藥劑，即為治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物。
[0024]其中，構(gòu)建慢病毒表達載體-HIF-1 a -shRNAi的步驟為:根據(jù)Genbank中報道的HIF-1 α基因寡核苷酸序列設(shè)計并合成引物，通過寡核苷酸序列正、反義鏈經(jīng)過變性、復(fù)性后形成雙鏈HIF-1 a -RNAi。采用DNA重組技術(shù)，將HIF_1 a -RNAi雙鏈定向亞克隆入PU6啟動子，得到慢病毒表達載體pGCSIL-GFP的-HIF-1 a -shRNAi。
[0025]所述治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物在治療肉雞腹水征合癥中的應(yīng)用，將治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物注射到粒肉雞體內(nèi)，沉默HIF-1 α基因，抑制下游基因血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、體內(nèi)內(nèi)皮素-1 (ET-1)、胰島素樣生長因子II(IGF-1I)等表達，控制肺血管重構(gòu)(PVR)現(xiàn)象，減少心肺功能損傷與腹水形成，最終實現(xiàn)臨床肉雞腹水征合癥治療。
[0026]所述治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的藥效驗證方法，包括以下步驟
[0027](I)RNA干擾HIF-1a基因?qū)θ怆uPAEC生長實驗
[0028](1.1)鑒定RNA干擾靶點是否成功連接到慢病毒載體:將HIF-1 a -shRNAi重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，選擇陽性菌落進行PCR擴增和基因測序鑒定RNA干擾靶點是否成功連接到慢病毒載體。采用同樣的方法，構(gòu)建無效干擾序列-HIF-1 a -shRNA重組質(zhì)粒。
[0029](1.2) HIF-1 a -shRNAi 細胞轉(zhuǎn)染
[0030](1.2.1)肉雞PAEC的分離及培養(yǎng):取2周齡的肉雞肺動脈，用0.25%的胰酶灌注，消化肉雞肺動脈內(nèi)皮細胞，經(jīng)多次沖洗，收集消化的細胞懸液進行培養(yǎng)，在37°C、5% C02條件下培養(yǎng)3代后的細胞用于實驗。
[0031](1.2.2)病毒的包裝、濃縮及病毒滴度測定:質(zhì)粒中抽提試劑盒提取
[0032]HIF-1 a -shRNAi/HIF-1 a -shRNA中質(zhì)粒DNA，以紫外光吸收法測定其濃度及純度,保證所提質(zhì)粒DNA的A260/A280在1.8?2.0之間。用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染293T細胞，收獲重組慢病毒并以0.45 μ m濾器過濾上清液后超速離心法濃縮。同時，利用ELISA測定病毒滴度，使病毒滴度達到lX108cfu/mL以上可用于轉(zhuǎn)染。
[0033](1.2.3)轉(zhuǎn)染:于第3代PAEC生長至約70%?80%融合時準備轉(zhuǎn)染，采用脂質(zhì)體(Lipofectamin 2000)法轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染后24h在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，篩選出轉(zhuǎn)染效果達75%的細胞，備用于模擬缺氧實驗。
[0034](1.3)模擬缺氧實驗
[0035]設(shè)常氧為對照組，用CoCl2制造細胞缺氧環(huán)境為實驗組，各組設(shè)為3小組:空白組(未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒)、陰性組(轉(zhuǎn)染HIF-1a-shRNA重組質(zhì)粒)、干擾組(轉(zhuǎn)染HIF-1 a -shRNAi重組質(zhì)粒)。各小組6次重復(fù)，實驗3次。分別在常氧和缺氧環(huán)境下培養(yǎng)，間隔3h收集培養(yǎng)上清液，共收集8次，檢測收集各組培養(yǎng)上清液及細胞用于HIF-1 a、VEGF、ET-1mRNA基因的表達量。
[0036](1.4)細胞的爬片與DAPI染色
[0037]轉(zhuǎn)染成功的細胞進行細胞爬片、固定、DAPI染色、封片與觀察等方法，并在熒光顯微鏡下計數(shù)并了解轉(zhuǎn)染效率。
[0038](1.5) HIF-la, VEGF, ET-1 基因表達量的檢測
[0039](L 5.1) RT-PCR檢測:收集細胞提取細胞總RNA，進行HIF-1 α、VEGF、ET-1基因RT-PCR擴增，將其反應(yīng)物進行凝膠電泳檢測。
[0040](1.5.2)熒光定量PCR檢測:提取的細胞中總RNA通過熒光PCR溶解曲線判斷擴增特異性、擴增曲線計算目的基因相對表達量，比較各組之間差異。
[0041](1.5.3)Western Blot檢測:收集細胞提取總蛋白后,進行Western Blot檢測細胞內(nèi)HIF-1a及VEGF基因的蛋白水平。并以穩(wěn)定表達的基因β-actin為內(nèi)參照。
[0042](1.5.4) ELASA檢測:取細胞培養(yǎng)上清液作為檢測定樣本，取等體積樣本及檢測試劑加入酶標板孔中，TMBE溶液顯色，酶標儀650nm波長下讀取數(shù)值，測出ET-1表達量。
[0043](1.5.5)流式細胞儀檢測:將各組細胞培養(yǎng)72小時后，用0.25%胰酶消化，收集細胞，進行流式細胞儀檢測各組細胞周期和凋亡情況。
[0044](1.6)統(tǒng)計學(xué)處理
[0045]實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0軟件處理，計量資料以均數(shù)土標準差(M±SD)表示，方差分析進行組間比較，P < 0.05表示差異顯著性。
[0046](2) RNA干擾HIF-1 α基因在肉雞體內(nèi)對腹水形成實驗
[0047](2.1)人工誘導(dǎo)肉雞AS試驗
[0048]取2周齡肉雞利用環(huán)境低溫、飼料添加三碘甲狀腺原氨酸(Τ3)誘發(fā)肉雞AS ;從2周齡開始試驗，隨后進行的臨床病理學(xué)變化規(guī)律觀察，統(tǒng)計腹水發(fā)病率，選出腹水發(fā)病肉雞用于干擾實驗。
[0049](2.2)動物分組
[0050]選擇2周齡的正常肉雞/人工誘導(dǎo)AS的肉雞將隨機分別分為空白組、陰性組、干擾組。每小組10只，各小組重復(fù)6次，實驗3批。
[0051](2.3)動物接種
[0052]采用肉雞翼下靜脈注射法，干擾組將注射HIF-1 a -shRNAi重組質(zhì)粒懸液，空白組和陰性組分別注射等量的生理鹽水和無效干擾HIF-1 a -shRNA重組質(zhì)粒懸液。在常氧/缺氧環(huán)境下飼喂數(shù)天后，采血樣進行生化指標檢測，同時從各組中抽取雞樣進行處死，取組織進行檢測。
[0053](2.4)檢測
[0054](2.4.1)生化指標檢測:用稱量法測定各組雞的右心室與全心室的比值(RV/TV)，血液分析儀法測定PCV、HCT、Hb，用生化試劑盒測定血清中MDA、GSH-Px、LDH生化指標，監(jiān)測肉雞腹水發(fā)病過程中生理生化指標的變化情況。
[0055](2.4.2) RT-PCR檢測:分批處死各實驗組肉雞，取組織樣本(肺、肺動脈、心臟、肝器官)提取組織中總RNA，進行HIF-1 α、VEGF, ET-1基因RT-PCR擴增，將其反應(yīng)物進行凝膠電泳檢測比較各組之間差異。
[0056](2.4.3)熒光定量PCR檢測:提取的組織中總RNA通過熒光定量PCR溶解曲線判斷擴增特異性、擴增曲線計算目的基因相對表達量，比較各組之間差異。
[0057](2.4.4) Western Blot檢測:取各實驗組肉雞內(nèi)臟器官(肺、肺動脈、心臟、肝)提取組織中總蛋白并做B1frad法定量，進行Western Blot檢測細胞內(nèi)HIF-1 a、VEGF、ET_1基因的蛋白水平。并以穩(wěn)定表達的基因β-actin為內(nèi)參照。
[0058](2.4.5)免疫組織化學(xué)染色:取各實驗組肉雞的內(nèi)臟器官(肺、肺動脈、心臟、肝)，用常規(guī)石蠟切片制片，3，3' - 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片，各組均設(shè)陰性對照。采用MS細胞圖像分析系統(tǒng)進行分析。
[0059]上面對本專利的較佳實施方式作了詳細說明，但是本專利并不限于上述實施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本專利宗旨的前提下做出各種變化。
【權(quán)利要求】
1.一種治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的制備方法，其特征在于，首先構(gòu)建慢病毒表達載體-HIF-1 a -shRNAi，然后將HIF_1 a -shRNAi重組質(zhì)粒包裝成藥劑，即為治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的制備方法，其特征在于，HIF-1 a -shRNAi的慢病毒表達載體的構(gòu)建:采用DNA重組技術(shù)將HIF-1 a -RNAi雙鏈定向亞克隆入PU6啟動子即可。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的制備方法，其特征在于，所述HIF-1 a -shRNAi的慢病毒表達載體的構(gòu)建:采用pGCSIL_GFP載體，轉(zhuǎn)染細胞為293T細胞。
4.一種如權(quán)利要求1或2所述的制備方法制備的治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的應(yīng)用，其特征在于，將治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物注射到粒肉雞體內(nèi)，沉默HIF-1a基因，抑制下游基因血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、體內(nèi)內(nèi)皮素-1 (ET-1)、胰島素樣生長因子II(IGF-1I)的表達。
5.一種如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用的藥效驗證方法，其特征在于，包括:(I) RNA干擾HIF-1a基因?qū)θ怆uPAEC生長實驗和(2) RNA干擾HIF_1 a基因在肉雞體內(nèi)對腹水形成實驗; 步驟(I) RNA干擾HIF-1 a基因?qū)θ怆uPAEC生長實驗，具體包括:(1.1)鑒定RNA干擾靶點是否成功連接到慢病毒載體；(1.2) HIF-1 a -shRNAi細胞轉(zhuǎn)染；(1.3)模擬缺氧實驗；(1.4)細胞的爬片與DAPI染色；(1.5)HIF-la、VEGF、ET-l基因表達量的檢測； 步驟(2)RNA干擾HIF-1a基因在肉雞體內(nèi)對腹水形成實驗，具體包括:(2.1)人工誘導(dǎo)肉雞腹水征合癥試驗；(2.2)動物分組；(2.3)動物接種；(2.4)檢測。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥效驗證方法，其特征在于，步驟(1.2) HIF-1 a -shRNAi細胞轉(zhuǎn)染是借助Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染細胞,篩選出最佳的干擾祀點。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥效驗證方法，其特征在于，步驟(2.1)人工誘導(dǎo)肉雞腹水征合癥試驗是采用三利用環(huán)境低溫、飼料添碘甲狀腺原氨酸(T3)誘發(fā)肉雞腹水征合癥。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7之一所述的藥效驗證方法，其特征在于，步驟(I)RNA干擾HIF-1 α基因?qū)θ怆uPAEC生長實驗:通過RNA干擾技術(shù)、細胞轉(zhuǎn)染進行分組實驗，利用RT-PCR、熒光定量PCR、Western Blot流式細胞儀檢測方法對HIF-1 a、VEGF, ET-1基因表達進行檢測以驗證RNA干擾HIF-1 α基因在肉雞PAEC中的效果。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-7之一所述的藥效驗證方法，其特征在于，步驟(2)RNA干擾HIF-1 α基因在肉雞體內(nèi)對腹水形成實驗:擇用正常肉雞和人工誘導(dǎo)的腹水征合癥肉雞為實驗對象，采用RNA干擾技術(shù)進行肉雞體內(nèi)實驗，以測定肉雞中右心室重與全心室重的比值(RV/TV)、紅細胞總數(shù)(PCV)、紅細胞壓積(HCT)、血紅蛋白含量(Hb)、血清中丙二醛(MDA)、胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、乳酸脫氫酶(LDH)指標，從而分析RNA干擾HIF-1 α對肉雞腹水發(fā)病過程中生理生化指標的變化；與此同時，再通過RT-PCR、實時熒光定量PCR、Western Blot、免疫組化方法檢測各組織中的HIF-1 a , VEGF, ET-1基因mRNA的表達情況；最終結(jié)合以上實驗結(jié)果，驗證肉雞體內(nèi)RAN干擾HIF-1a對肉雞腹水形成的影響。
【文檔編號】A61K48/00GK104383557SQ201410573326
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月16日
【發(fā)明者】劉平, 胡國良, 郭小權(quán), 曹華斌, 張彩英, 劉佩, 侯小露, 黃云飛 申請人:江西農(nóng)業(yè)大學(xué)