胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5在促進(jìn)牙周組織再生中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了IGFBP5在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的牙周組織再生中的應(yīng)用。
【專利說明】胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5在促進(jìn)牙周組織再生中的應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細(xì)胞【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5在促進(jìn)牙周 組織再生中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 牙周炎是一種多因素相關(guān)慢性炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為牙周支持組織的喪失，包 括牙周韌帶、牙骨質(zhì)、牙槽骨的喪失，隨著對牙周病發(fā)病機制的深入了解，發(fā)現(xiàn)宿主免疫反 應(yīng)、環(huán)境因素和細(xì)菌微生物因素間相互作用在牙周炎的發(fā)生、發(fā)展及牙周組織的愈合中至 關(guān)重要。由牙周炎造成的牙槽骨喪失、牙周組織破壞是成年人牙齒脫落的首要原因，嚴(yán)重影 響患者的咀嚼功能、美觀及身心健康。傳統(tǒng)牙周治療方法主要包括機械的清除方法包括齦 上潔治、齦下刮治術(shù)清除牙菌斑及牙石是牙周炎的基礎(chǔ)治療方法，但傳統(tǒng)牙周治療方法尚 不能使喪失的牙周組織獲得理想的再生。因此牙周組織缺損修復(fù)是口腔領(lǐng)域的重點研究內(nèi) 容之一。近年來，牙周骨移植術(shù)、引導(dǎo)組織再生、引導(dǎo)骨再生及生長因子局部緩釋技術(shù)的臨 床應(yīng)用在一定程度上提高牙槽骨及牙周再生能力，但這些骨引導(dǎo)和骨誘導(dǎo)方式也需依賴于 剩余間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量及功能。對于慢性牙周炎患者，長期的慢性炎癥使宿主自身間充 質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量減少，功能受損，很難滿足骨再生手術(shù)的要求。隨著干細(xì)胞、組織工程技術(shù)的 發(fā)展及應(yīng)用為牙周炎的治療、牙周組織的生物性再生提供了更為有效的手段。組織工程技 術(shù)是利用可降解生物材料、各種類型的種子細(xì)胞及細(xì)胞因子相互復(fù)合，移植后可在宿主體 內(nèi)的重建具有正常結(jié)構(gòu)及功能的組織器官。
[0003] 目前在牙周組織再生種子細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新、多向 分化等能力，可以分化為組織修復(fù)所需的各種組織如骨組織，軟骨組織，牙本質(zhì)，牙周組織 等，與生物材料復(fù)合應(yīng)用具有良好的修復(fù)自身缺損和改建周圍組織的功能。近年來越來越 多的研究報道表明，間充質(zhì)干細(xì)胞除免疫原性低、具備再生和修復(fù)功能外，還有較強的免疫 抑制及調(diào)節(jié)作用，并已安全和成功地用于臨床，或結(jié)合組織工程技術(shù)進(jìn)行組織再生，或直 接應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞對自身免疫疾病進(jìn)行細(xì)胞治療 [#9_2°]。近年來越來越多的研究報道表 明，間充質(zhì)干細(xì)胞除免疫原性低、具備再生和修復(fù)功能外，還有較強的免疫調(diào)節(jié)、抗炎等作 用，并已安全和成功地用于臨床，是牙周組織再生的良好的種子細(xì)胞。已有研究表明，成年 牙的牙髓中，脫落乳牙及正常牙周組織中存在干細(xì)胞，這些干細(xì)胞首先具有向牙齒各種組 織分化的能力，如牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體、牙骨質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等。在特殊的誘導(dǎo)條件下還 可以向脂肪、神經(jīng)等細(xì)胞分化 [#Η]。與牙齒有關(guān)的干細(xì)胞主要存在于牙髓和牙周膜等結(jié)締 組織中，這些組織都有修復(fù)自身缺損和改建周圍組織的功能。其中牙周膜干細(xì)胞于2004年 分離鑒定，可在體外分化成成牙骨質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞和膠原形成細(xì)胞，并能被礦化和成脂誘導(dǎo)， 將其與特定生物材料植入體內(nèi)6-8周可形成牙周膜牙骨質(zhì)復(fù)合樣結(jié)構(gòu)，這對牙周組織再生 具有重要的意義。Kato T通過對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、牙周膜間充質(zhì)干細(xì) 胞的比較，發(fā)現(xiàn)牙周膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有最高水平的骨分化的標(biāo)記物，表明牙周膜干細(xì)胞 是最理想的牙槽骨再生的細(xì)胞。同時，牙周膜干細(xì)胞也具有合成膠原的能力，并且其膠原形 成能力比脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞較強。在此基礎(chǔ)上，Liu等在小型豬建立了牙周炎的動物模型， 進(jìn)行了基于自體牙周干細(xì)胞為基礎(chǔ)的牙周組織再生研究，發(fā)現(xiàn)將小型豬的自體牙周膜干細(xì) 胞與生物材料HA/TCP混合后，回植到牙周缺損部位，可以良好地形成骨組織、牙骨質(zhì)以及 牙周韌帶，成功地再生了牙周炎導(dǎo)致的牙周組織缺損。隨后Ding等又利用異體牙周膜干細(xì) 胞與生物材料HA/TCP混合后回植到牙周炎導(dǎo)致的牙周缺損部位，發(fā)現(xiàn)異體移植的牙周膜 干細(xì)胞具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，異體牙周膜干細(xì)胞復(fù)合生物支架材料也能夠成功修復(fù)再 生牙周炎導(dǎo)致的牙周組織缺損。Wei等用維生素 C刺激牙周膜干細(xì)胞使細(xì)胞基質(zhì)增高，從 而形成細(xì)胞膜片，能夠明顯改善牙周組織再生。國外學(xué)者也利用多層的牙周干細(xì)胞膜片技 術(shù)成功再生了牙周組織 [#22]。有研究發(fā)現(xiàn)還發(fā)現(xiàn)牙周膜干細(xì)胞在牙周組織再生中與骨形 成蛋白的有相互促進(jìn)作用從而促進(jìn)組織再生。據(jù)此，Chen等將甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋 糖酐/明膠混合凝膠作為支架材料復(fù)合，然后將材料與牙周膜干細(xì)胞混合后進(jìn)行牙周組織 再生研究，發(fā)現(xiàn)復(fù)合骨形成蛋白的牙周膜干細(xì)胞組有更明顯的新骨形成和牙周韌帶再生能 力。
[0004] 除了牙周膜干細(xì)胞外，其他牙源性及非牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞也可以作為牙周組織 再生的種子細(xì)胞。牙囊細(xì)胞可以從阻生智齒分離、培養(yǎng)獲得。研究表明牙囊細(xì)胞混合生物 陶瓷材料能夠再生出牙周膜牙骨質(zhì)復(fù)合體，可以作為牙周組織再生的良好的種子細(xì)胞。也 有學(xué)者將骨髓間充質(zhì)細(xì)胞與纖維蛋白凝膠混合后回植到創(chuàng)傷性牙槽骨缺損的部位，發(fā)現(xiàn)骨 髓間充質(zhì)細(xì)胞具有良好的牙周骨組織修復(fù)功能。另外Xie等將牙周膜干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì) 細(xì)胞混合，以陶瓷和牛骨粉末混合形成膜片誘導(dǎo)成骨。該種細(xì)胞混合物可以使堿性磷酸酶 增強，同時膠原酶、骨鈣素、血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)增高。體內(nèi)實驗表明這種混合細(xì)胞膜片 可以形成牙骨質(zhì)/含有新生血管的牙周膜樣組織，表明牙周膜干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)細(xì)胞可 以模仿牙周膜的微環(huán)境，增強牙骨質(zhì)/牙周膜復(fù)合體生理結(jié)構(gòu)的重建修復(fù)功能。
[0005] 除間充質(zhì)干細(xì)胞在牙周組織再生中起著重要的功能外，細(xì)胞因子例如生長因子等 也在組織工程化的牙周組織再生過程中發(fā)揮著重要的作用。生長因子可以復(fù)合到支架材料 內(nèi)以提高細(xì)胞的增殖或分化等某些反應(yīng)能力。這些生長因子可以作為信號分子對組織的形 成進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)。有研究表明，生長因子能夠刺激牙周缺損區(qū)細(xì)胞再聚集，這既能促進(jìn)組織 細(xì)胞生長發(fā)育的正向調(diào)節(jié)，又有抑制組織細(xì)胞生長的負(fù)向調(diào)節(jié)，共同參與組織細(xì)胞的增殖、 分化和基質(zhì)代謝，從而明顯促進(jìn)牙周組織的再生和修復(fù) [4]。目前研究表明與牙周組織再生 相關(guān)的單一生長因子有：堿性成纖維細(xì)胞生長因子，轉(zhuǎn)化生長因子β，釉基質(zhì)蛋白衍生物 等以及復(fù)合生長因子：富血小板血漿。
[0006] 堿性成纖維細(xì)胞生長因子是一種肝素聯(lián)合多肽類生長因子，有促進(jìn)血管生成、創(chuàng) 傷愈合、骨骼修復(fù)、胚胎的發(fā)育與分化有著重要的生物學(xué)作用。堿性成纖維細(xì)胞生長因子能 夠促進(jìn)細(xì)胞在生物材料和細(xì)胞外基質(zhì)的粘附，提高牙周膜成纖維細(xì)胞活力，從而有效修復(fù) 牙周組織缺損。另外有研究表明，堿性成纖維細(xì)胞生長因子能夠促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞增殖，刺 激牙周膜細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)，并且能通過促進(jìn)牙周膜血管的生成，為新生的牙周組織創(chuàng)造 良好的條件。有學(xué)者將堿性成纖維細(xì)胞生長因子與多聚三磷酸鈣膜混合，回植到缺損部位， 發(fā)現(xiàn)有大量的新生骨組織形成，并且引起的炎性浸潤反應(yīng)非常微弱。
[0007] 轉(zhuǎn)化生長因子β是一類多肽生長因子。以往的研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子在牙齒 早期發(fā)育以及牙周軟硬組織的再生有著重要的調(diào)節(jié)作用[8]。轉(zhuǎn)化生長因子β對細(xì)胞增殖 活性的影響依賴于細(xì)胞的類型、組織的來源、以及與其他生長因子的互相影響。Fujii使用 外源性的轉(zhuǎn)化生長因子β刺激人牙周膜干細(xì)胞以及人牙周膜祖細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)人牙周膜祖 細(xì)胞系中a平滑肌肌動蛋白、I型膠原蛋白，以及原纖維蛋白1在mRNA水平表達(dá)增高，但增 殖減弱；而牙周膜干細(xì)胞則表現(xiàn)出了相反的情況：細(xì)胞大量增殖，而a平滑肌肌動蛋白、I型 膠原蛋白、原纖維蛋白1表達(dá)降低；說明了轉(zhuǎn)化生長因子β能夠誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞系的成 纖維化并能保持牙周膜干細(xì)胞的干細(xì)胞活性。也有研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β的作用有雙 向性：低劑量刺激成骨細(xì)胞增殖，高劑量抑制骨組織形成
[0008] 釉基質(zhì)蛋白及其衍生物衍生物是釉質(zhì)發(fā)育過程中未礦化釉質(zhì)中含有的蛋白成分， 可以刺激牙囊細(xì)胞產(chǎn)生成牙骨質(zhì)細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)釉基質(zhì)蛋白能夠促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的增殖以 及蛋白合成，提高牙周膜細(xì)胞的堿性磷酸酶活性。另有研究發(fā)現(xiàn)釉基質(zhì)蛋白衍生物能夠刺 激根面牙周組織的再生，并且促進(jìn)了無細(xì)胞牙骨質(zhì)以及新牙槽骨的形成 [13]。同時還發(fā)現(xiàn)釉 基質(zhì)蛋白有可能作為一種關(guān)鍵的上游細(xì)胞因子啟動牙周組織細(xì)胞分泌各種下游因子，從而 調(diào)控牙周組織按牙周組織胚胎發(fā)育的進(jìn)程推進(jìn)，例如國內(nèi)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)釉基質(zhì)蛋白成濃度和 時間依賴性的誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長因子β。因此認(rèn)為利用釉基質(zhì)蛋白衍生物進(jìn)行 牙周組織的再生重建，將完全重復(fù)了牙齒發(fā)育每個階段，可以在牙根表面形成基質(zhì)以促進(jìn) 牙骨質(zhì)、牙周膜以及牙槽骨的生長，是最接近牙周組織生物學(xué)發(fā)育過程的一種修復(fù)再生方 式。
[0009] 盡管采用單一生長因子的組織工程方法進(jìn)行牙周組織再生取得了一些成果，但在 多年的不斷探索中，科研人員發(fā)現(xiàn)在功能、結(jié)構(gòu)上還是難以實現(xiàn)完善的牙周組織再生，主要 原因是牙周組織局部環(huán)境中缺乏足量的、相互協(xié)調(diào)的細(xì)胞因子。因此將一種或幾種外源性 多肽生長因子用于牙周組織再生的研究，盡管取得了一定療效，但效果并不十分理想。因此 有學(xué)者提出了使用復(fù)合生長因子，例如富血小板血漿。富血小板血漿中的血小板可以釋放 豐富的生長因子，因此可能會對牙周組織再生有重要的影響作用。以往研究表明牙周外科 手術(shù)后，首先是血凝塊充滿傷口區(qū)，并啟動各種軟硬組織的修復(fù)和再生。正常的血凝塊有大 約5%的血小板，然而正是這些少量的血小板通過血凝塊的回縮、生長因子的釋放，從而在 傷口愈合中起了主要的作用。同時國內(nèi)學(xué)者研究報道，在體外富血小板血漿可以成劑量依 賴性刺激牙周成纖維細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞的細(xì)胞增殖。目前已經(jīng)有學(xué)者將富血小板血漿應(yīng)用 于牙周骨缺損修復(fù)的治療，發(fā)現(xiàn)將羥基磷灰石與富血小板血漿混合回植到牙周骨缺損的部 位，并使用患者自身骨膜細(xì)胞膜片覆蓋混合體，通過臨床及影像學(xué)檢查，可以看到骨缺損部 位有良好的骨組織再生。另外富血小板血漿還可以做為內(nèi)源性材料，構(gòu)成有利于牙周骨組 織修復(fù)再生的微環(huán)境。
[0010] 雖然上述研究表明這些生長因子可以調(diào)節(jié)牙周組織缺損的局部細(xì)胞應(yīng)答，促進(jìn)牙 周組織的缺損修復(fù)，但由于生長因子具有雙向性，其效應(yīng)與生長因子的來源、濃度、劑量和 及有無其他生長因子參與等多種因素有關(guān)。因此尋找到上游調(diào)控以及下游應(yīng)答的生長因 子，以期發(fā)揮生長因子最佳作用，從而獲得形態(tài)、功能均滿意的骨組織和理想的牙周附著是 未來牙周組織再生的研究方向。
[0011] 盡管干細(xì)胞結(jié)合組織工程修復(fù)再生牙周組織取得了一些研究成果，但還需要進(jìn)行 深入研究，為臨床上治療牙周炎，進(jìn)行牙周軟硬組織的組織再生和功能重建尋找更多、更理 想的種子細(xì)胞和細(xì)胞因子；同時研究如何將間充質(zhì)干細(xì)胞、生長因子與生物材料有機地結(jié) 合在一起復(fù)合應(yīng)用，形成改性的生物活性材料，使其具有更好的調(diào)控機體免疫、再生、防御 功能的能力，從而更好地修復(fù)再生牙周炎導(dǎo)致的牙周組織缺損。
[0012] 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白作為胰島素樣生長因子軸的重要組成，共有6條單鏈 多肽，在組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，參與機體諸多病生理過程。IGFBP5 (胰島素樣生長因子結(jié) 合蛋白5)在骨組織中大量存在，有研究表明注射rhIGFBP5刺激成骨細(xì)胞活性可顯著提高 卵巢切除小鼠骨組織重建，同時發(fā)現(xiàn)血清中骨鈣素和堿性磷酸酶水平升高。IGFBP5可通過 MPK途徑促進(jìn)單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的遷移，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。且相對 于成牙骨質(zhì)細(xì)胞，IGFBP5在牙槽骨成骨細(xì)胞中高表達(dá)。但I(xiàn)GFBP5對間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨/ 成牙分化及介導(dǎo)的牙周組織再生作用及機制不清楚。因此本發(fā)明欲通過研究IGFBP5是否 具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨/成牙分化及再生牙周組織的作用和機制，進(jìn)而利用IGFBP5增 強間充質(zhì)干細(xì)胞再生牙周組織的能力，并應(yīng)用于治療牙周炎。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 針對現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明所要解決的問題是提出一種治療牙周炎的新方法，為 了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬進(jìn)行如下技術(shù)方案：
[0014] 本發(fā)明涉及IGFBP5在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的牙周組織再生中的應(yīng)用。
[0015] 在本發(fā)明的另一方面，涉及IGFBP5在制備促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的牙周組織再 生的藥物中的應(yīng)用。
[0016] 在本發(fā)明的另一方面，涉及IGFBP5過表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療牙周組織 再生的藥物中的應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1與健康者相比，IGFBP5在牙周炎患者齦溝液中的表達(dá)降低。ELISA結(jié)果顯示 與健康者比較，IGFBP5在牙周炎患者齦溝液中表達(dá)降低。
[0018] 圖2建立IGFBP5基因敲除的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用IGFBP5 shRNA轉(zhuǎn)染牙周膜干細(xì)胞， 對照使用Scramble shRNA，轉(zhuǎn)染48小時后，用噪呤霉素篩選得到IGFBP5和對照Scramble 基因敲除的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在mRNA(A)和蛋白水平（B)檢測shRNA的敲除效果。結(jié)果顯示 在牙周膜干細(xì)胞IGFBP5 shRNA可以將IGFBP5基因有效的敲除。
[0019] 圖3建立IGFBP5過表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。Flag-IGFBP5和對照質(zhì)粒的病毒轉(zhuǎn)染臍 帶干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時后，用G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在mRNA㈧和蛋白水平⑶檢 測外源性IGFBP5的表達(dá)。結(jié)果表明IGFBP5可以在臍帶干細(xì)胞有效的過表達(dá)。
[0020] 圖4IGFBP5過表達(dá)促進(jìn)臍帶干細(xì)胞體外成骨/成牙分化。用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液將臍 帶干細(xì)胞在體外向成骨/成牙本質(zhì)分化誘導(dǎo)。發(fā)現(xiàn)與對照組相比，過表達(dá)IGFBP5的臍帶干 細(xì)胞成骨/成牙分化早期指標(biāo)-堿性磷酸酶活性明顯升高（A)。鉛素紅染色（B)及鈣離子 定量分析結(jié)果（C)顯示過表達(dá)IGFBP5臍帶干細(xì)胞體外礦化能力增強。定量聚合酶聯(lián)反應(yīng) 結(jié)果顯示過表達(dá)IGFBP5促進(jìn)臍帶干細(xì)胞成骨/成牙本質(zhì)分化指標(biāo)-骨粘連蛋白ON(D)、I 型膠原蛋白C0L1A2 (E)、骨橋蛋白OPN(F)、牙本質(zhì)涎蛋白DSP(G)、牙本質(zhì)基質(zhì)酸性磷酸化蛋 白IDMPl (H)、成骨相關(guān)核心轉(zhuǎn)錄因子OSX(I)的表達(dá)。
[0021] 圖5基因敲除IGFBP5抑制牙周膜干細(xì)胞體外成骨/成牙分化。用成骨誘導(dǎo)培 養(yǎng)液將牙周膜干細(xì)胞在體外向成骨/成牙本質(zhì)分化誘導(dǎo)。發(fā)現(xiàn)與對照組相比，基因敲除 IGFBP5抑制牙周膜干細(xì)胞堿性磷酸酶活性（A)。鉛素紅染色（B)及測定鈣離子定量分析結(jié) 果（C)顯示基因敲除IGFBP5抑制牙周膜干細(xì)胞體外礦化能力。定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)結(jié)果顯 示基因敲除IGFBP5抑制牙周膜干細(xì)胞成骨/成牙本質(zhì)分化指標(biāo)-骨粘連蛋白ON(D)、I型 膠原蛋白C0L1A2 (E)、骨橋蛋白OPN(F)、牙本質(zhì)涎蛋白DSP(G)、牙本質(zhì)基質(zhì)酸性磷酸化蛋白 IDMPl (H)、成骨相關(guān)核心轉(zhuǎn)錄因子OSX(I)的表達(dá)。
[0022] 圖6IGFBP5在干細(xì)胞抑制炎癥因子的表達(dá)。（A)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測結(jié)果顯示 與正常牙周膜干細(xì)胞相比，IGFBP5在炎癥牙周膜干細(xì)胞中表達(dá)降低。定量聚合酶鏈反應(yīng)結(jié) 果顯示基因敲除IGFBP5促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞炎性因子白介素6(IL 6)(B)和白介素8(IL 8) (C)的表達(dá)。定量聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果顯示過表達(dá)IGFBP5能夠重新抑制基因敲除IGFBP5后 牙周膜干細(xì)胞白介素6(D)和白介素8(E)的表達(dá)。
[0023] 圖7小型豬牙周炎骨缺損模型的建立模型及干細(xì)胞治療后的CT影像學(xué)結(jié)果。采用 制造骨缺損、結(jié)扎絲線的方法建立小型豬實驗性牙周炎模型，在下頜第一恒磨牙近中鄰面 形成3_X5_X7mm缺損。手術(shù)后4周可成功形成牙周炎骨缺損模型（圖7ABC);干細(xì)胞治 療后3個月（12w)的CT影像學(xué)檢查（圖7CDE);圖7AD為對照組；圖7BE為Vector組；圖 7CF為Flag-IGFBP5組；圖7G為Geomagic Studio 12三維計算新生骨量的統(tǒng)計結(jié)果。觀察 IGFBP5對干細(xì)胞介導(dǎo)的小型豬牙周炎缺損組織再生修復(fù)能力的影響，CT結(jié)果表明IGFBP5 促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的小型豬牙周組織再生。
[0024] 圖8小型豬牙周炎骨缺損模型，臍帶干細(xì)胞回植后的臨床檢查結(jié)果。臍帶干細(xì)胞 回植前4周和0周，探診深度、齦退縮、附著喪失在兩組之間沒有差異；在回植后12周，齦退 縮指標(biāo)無明顯差異，探診深度、附著喪失兩個檢測指標(biāo)在Flag-IGFBP5干細(xì)胞回植組明顯 改善。結(jié)果表明IGFBP5基因修飾的臍帶干細(xì)胞能夠促進(jìn)牙周組織再生。
[0025] 圖9小型豬牙周炎模型，干細(xì)胞再生后的組織病理結(jié)果。臍帶干細(xì)胞回植后12周 的HE染色組織病理結(jié)果圖；圖9A為對照組；圖9B為Vector組；圖9C為Flag-IGFBP5組； 觀察IGFBP5對干細(xì)胞介導(dǎo)的小型豬牙周炎缺損組織再生修復(fù)能力的影響，組織病理結(jié)果 表明IGFBP5促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的小型豬牙周組織再生，并具有抑制局部炎癥的 作用。深色箭頭代表釉牙骨質(zhì)界，淺色箭頭代表新生牙槽骨高度；標(biāo)尺為1mm。
[0026] 圖10酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測局部炎性因子。干細(xì)胞回植后12周，收集小型豬 下頜第一恒磨牙齦溝液，酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測炎性因子白介素8 (IL8)，腫瘤壞死因子 a (TNFa)，白介素 lb (ILlb)，干擾素 r (IFNr)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)炎性因子干擾素 r (A)、腫瘤壞死因 子a(B)、白介素 Ib(C)、白介素8(D)在IGFBP5基因修飾臍帶干細(xì)胞組齦溝液中表達(dá)降低。 結(jié)果表明IGFBP5能夠有效控制牙周炎癥反應(yīng)。
[0027] 圖11小型豬血常規(guī)檢測指標(biāo)。結(jié)果表明IGFBP5對全身血常規(guī)指標(biāo)白細(xì)胞（圖 11A)、血紅蛋白（圖11B)、血小板（圖11C)和紅細(xì)胞（圖11D)無影響。 具體實施方案
[0028] 下面結(jié)合實例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但是此說明不會構(gòu)成對本發(fā)明的限 制。
[0029] 實施例I
[0030] (I) IGFBP5在牙周炎患者齦溝液中表達(dá)降低
[0031] 臨床收集正常及牙周炎患者齦溝液，酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測IGFBP5的表達(dá)，發(fā) 現(xiàn)IGFBP5在牙周炎患者齦溝液中表達(dá)降低。
[0032] 慢性牙周炎組納入標(biāo)準(zhǔn)為①診斷為慢性牙周炎的患者探診深度> 4mm，附著喪失 > Imm ;②體重指數(shù)18. 5 <體重指數(shù)< 24的正常范圍。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有相關(guān)系統(tǒng)疾病， 包括高血壓、糖尿病、心血管疾病及其他免疫疾病；②吸煙者；③六個月內(nèi)有牙周系統(tǒng)治療 史，包括齦上潔治術(shù)、根面平整術(shù)、牙周手術(shù)等；④妊娠期婦女、已絕經(jīng)婦女及服用避孕藥 者；⑤三個月內(nèi)曾使用抗生素者；⑥錯頜畸形或正畸后1年以內(nèi)。
[0033] 正常對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①牙齦色形質(zhì)正常，菌斑指數(shù)=0,牙齦指數(shù)=0,出血指數(shù) =0?1，探診深度彡3mm，附著喪失=Omm ;②體重指數(shù)在18. 5彡體重指數(shù)彡24的正常范 圍。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有相關(guān)系統(tǒng)疾病，包括高血壓、糖尿病、心血管疾病及其他免疫疾?。虎?吸煙者；③六個月內(nèi)未行牙周系統(tǒng)治療，包括齦上潔治術(shù)、根面平整術(shù)、牙周手術(shù)等；④妊 娠期婦女、已絕經(jīng)婦女及服用避孕藥者；⑤三個月內(nèi)曾使用抗生素者；⑥錯頜畸形或正畸 后1年以內(nèi)。
[0034] 齦溝液采集：從左右上頜第一磨牙的頰側(cè)齦溝的近頰，頰側(cè)，遠(yuǎn)頰，舌側(cè)齦溝四個 位點采取齦溝液。去除齦溝液收集部位的齦上菌斑，棉球格式并吹干待測牙面，Imin后將濾 紙條（2mmX8mm)插入齦溝，遇阻力時停止，停留30s取出。取出后，8張濾紙條合并用電子天 平稱重，減去原重量，即為齦溝液重量，按比重（約lmg/ul)換算成體積。樣本保存于-80°C 冰箱，待測。實驗結(jié)果表明IGFBP5在牙周炎患者齦溝液中表達(dá)降低（圖1)。
[0035] 酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測齦溝液中IGFBP5的含量
[0036] a.試劑平衡至室溫（18°C _25°C )。
[0037] b.加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測品孔、空白孔。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)液或 代測樣品IOOuL,輕輕混勻。酶標(biāo)板加上蓋,室溫下放置lh。
[0038] c.棄去溶液，使用洗滌緩沖液（300 μ L)洗板5次。
[0039] d.每孔加入100 μ L抗體，室溫?fù)u床下lh。
[0040] e.棄去溶液，重復(fù)步驟c。
[0041] f.每孔加入100 μ L鏈霉親和素溶液,室溫?fù)u床下lmin。
[0042] g.棄去溶液，重復(fù)步驟c。
[0043] h.每孔加入100 μ L底物液，室溫下放置30min。
[0044] i.每孔加入100 μ L終止溶液，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
[0045] J.用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測量各孔的吸光度值，在加終止液后立即進(jìn)行檢 測。
[0046] 以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)、吸光度值為橫坐標(biāo)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值制作標(biāo)準(zhǔn)曲 線。計算出相應(yīng)的待測樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
[0047] (2)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
[0048] 人體組織的利用得到首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，志愿者均知情同意術(shù)前簽 訂知情同意書。獲取了人恒牙牙周組織和恒牙炎性牙周組織，按照以往文獻(xiàn)報道的方法分 離和培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞，簡述如下：將拔除的牙齒立即放入無菌裝有預(yù)冷磷酸鹽緩沖液的 離心管，移送進(jìn)細(xì)胞室，在24h內(nèi)分離培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞。輕輕剝離牙齒周圍的牙周組織， 取中段的牙周組織，用磷酸鹽緩沖液反復(fù)清洗，剪碎，置于含I型膠原酶（3g/L)和分離酶 (4g/L)的消化液，37°C下消化1小時，過70μπι細(xì)胞篩收集細(xì)胞，IOOOrpm離心lOmin，用培 養(yǎng)液重新懸浮成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在α-ΜΕΜ培養(yǎng)基（含 15%胎牛血清、2111111〇1/1谷氨酰胺、10(^/1111青霉素和10(^8/1111鏈霉素）中371：、5%0)2 培養(yǎng)，每2?3天換液1次。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。當(dāng)細(xì)胞生長至80% 匯合狀態(tài)時，用0.25%胰蛋白酶按1 : 2消化傳代。通過檢測間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物 ⑶44、⑶90、⑶146、STR0-1和干細(xì)胞的多向分化能力、克隆形成能力等方法鑒定間充質(zhì)干細(xì) 胞。購買臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0049] (3)構(gòu)建病毒質(zhì)粒
[0050] 通過NCBI數(shù)據(jù)庫查詢IGFBP5的基因序列，應(yīng)用Whitehead提供的程序設(shè)計 IGFBP5的SiRNA，將其插入慢病毒的shRNA載體上，測序鑒定，最終構(gòu)建成IGFBP5shRNA的 質(zhì)粒。設(shè)計IGFBP5基因全長的聚合酶鏈反應(yīng)引物，用聚合酶鏈反應(yīng)的方法得到IGFBP5的 全長并加表面標(biāo)記Flag Tag，將其連接到逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)載體上，測序鑒定，最終構(gòu)建成 Flag-IGFBP5的質(zhì)粒。然后進(jìn)行病毒包裝、收集，病毒滴度鑒定，分裝后保存在-80度冰箱。
[0051] (4)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立
[0052] 對照Scramble的shRNA，IGFBP5的shRNA轉(zhuǎn)染牙周膜干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時后，用 嘌呤霉素篩選7天后得到對照Scramble和IGFBP5基因敲除的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染牙周膜干細(xì)胞，提 取細(xì)胞的mRNA和蛋白，在mRNA水平（圖2A)和蛋白水平（圖2B)檢測shRNA的敲除效果。 對照質(zhì)粒及Flag-IGFBP5的病毒轉(zhuǎn)染臍帶干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時后，用G418篩選10天得到 IGFBP5過表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染臍帶干細(xì)胞，在mRNA (圖3A)和蛋白水平（圖3B)檢測Flag的表 達(dá)鑒定外源性IGFBP5的表達(dá)。結(jié)果表明IGFBP5基因敲除及過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的建立。
[0053] 實時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)：
[0054] 1.弓丨物設(shè)計，Primer 3及oligo 6等生物軟件。
[0055] 2.反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物序列：
[0056] IGFBP5-F ：GCACCTGAGATGAGACAGGA
[0057] IGFBP5-R ：TGTAGAATCCTTTGCGGTCA
[0058] 3 · RNA 提取
[0059] 1)培養(yǎng)皿細(xì)胞棄上清，PBS沖洗2遍，加700ul Trizol，吹打混勻，收于印管，室 溫孵育5min，加 HOul氯仿，強力震蕩混勻15s，室溫孵育3min，4°C 12000g離心15min，收 上清于新EP管；
[0060] 2)取700ul樣本至微型柱子，4°C 8000g離心15s，棄下層液體；
[0061] 3)加700ul RWT緩沖液至微型柱子，4°C 8000g離心15s，棄下層液體；
[0062] 4)加 500ul RPE緩沖液至微型柱子，4°C 8000g離心15s，棄下層液體；
[0063] 5)重復(fù)步驟4
[0064] 6)轉(zhuǎn)移微型柱子至一新2ml收集管，4°C IOOOg離心Imin,棄下層液體；
[0065] 7)轉(zhuǎn)移微型柱子至一新2ml收集管，加30-50ul無 RNA酶水，4°C 8000g離心15s， 收集下層液體于新EP管，測RNA濃度，-80°C保存；
[0066] 4.反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)
[0067] 1)微型管中配制下列模板RNA/引物混合液；

【權(quán)利要求】
1. IGFBP5在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的牙周組織再生中的應(yīng)用。 2. IGFBP5在制備促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的牙周組織再生的藥物中的應(yīng)用。 3. IGFBP5過表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療牙周組織再生的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P1/02GK104306958SQ201410550442
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】范志朋, 王松靈, 王月君, 劉大勇 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院