一種阿里紅咳喘片的制備方法及其在抑制小鼠胃癌細(xì)胞mfc細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種阿里紅咳喘片的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的阿里紅咳喘片的制備方法，由阿里紅20g、洋李100g、蘆根80g、甘草60g、麻黃50g、木香30g、洋茴香120g、香附30g、豆蔻20g作為原料藥制成，采用超臨界萃取和微波萃取制備而成，使得甘草酸含量有很大提高。本發(fā)明還提供了阿里紅咳喘片在制備抑制小鼠胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種阿里紅咳喘片的制備方法及其在抑制小鼠胃癌細(xì)胞 MFC細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種阿里紅咳喘片的制備方法及其在抑制小 鼠胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 阿里紅咳喘口服液標(biāo)準(zhǔn)號(hào)WS-10245 (ZD-0245) -2002,記載于國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編 內(nèi)科肺系分冊(cè)。由阿里紅20g、洋李100g、蘆根80g、甘草60g、麻黃50g、木香30g、洋茴香 120g、香附30g、豆蘧20g作為原料藥制成，具有止咳，平喘，祛痰的功效。用于寒性咳嗽，咯 痰不爽，急慢性支氣管炎、哮喘。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有阿里紅咳喘口服液在提取制備方面采用超臨界萃取和微波提 取技術(shù)的報(bào)道，而揮發(fā)油提取，水加熱提取的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量 很大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種阿里紅咳喘片的制備方法。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種阿里紅咳喘片在制備抑制小鼠胃癌細(xì)胞MFC 細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過(guò)如下的方案實(shí)現(xiàn)的： 一種阿里紅咳喘片的制備方法，由阿里紅20g、洋李100g、蘆根80g、甘草60g、麻黃50g、 木香30g、洋茴香120g、香附30g、豆蘧20g作為原料藥制成，所述的制備方法由下列步驟組 成：取洋茴香、麻黃、木香、香附、豆蘧，加入到〇) 2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑 占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C，CO 2流量l-3ml/ g生藥· min，萃取時(shí)間150-200min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入3L的 70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分 鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫 液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混 合，加入淀粉，70 %乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0. 3g。
[0007] 優(yōu)選的，上述的阿里紅咳喘片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑占總萃 取溶劑的體積百分比為5%。
[0008] 優(yōu)選的，上述的阿里紅咳喘片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為 25MPa〇
[0009] 優(yōu)選的，上述的阿里紅咳喘片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為 40。。。
[0010] 優(yōu)選的，上述的阿里紅咳喘片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中CO2流量2!111/ g生藥· min。
[0011] 優(yōu)選的，上述的阿里紅咳喘片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取時(shí)間為 180min〇
[0012] 優(yōu)選的，上述的阿里紅咳喘片的制備方法中，所述微波萃取功率為700W。
[0013] 優(yōu)選的，上述的阿里紅咳喘片的制備方法中，所述微波萃取每次萃取時(shí)間為8分 鐘。
[0014] 上述的阿里紅咳喘片在制備抑制小鼠胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0015] 現(xiàn)有技術(shù)中，阿里紅咳喘口服液每次10ml，一日3次。阿里紅咳喘口服液因其是 口服液，味道較苦，不適宜小兒服用，另外，如果調(diào)味需要加糖比較多，不適糖尿病人服用， 患者依從性差。采用本發(fā)明方法制備成的阿里紅咳喘片每片重0. 3g，每次僅需2片，一日 服用3次。在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過(guò)下述試驗(yàn)證 明。且制備成片劑，患者隨水吞下即可，服藥量小且無(wú)苦味，患者易于接受。
[0016] 試驗(yàn)一、不同方法制備的阿里紅咳喘片中甘草酸含量的比較 1、儀器及試藥本發(fā)明阿里紅咳喘片：按實(shí)施例1方法制備，使用560g原料藥，經(jīng)提取制 成200片，每片重0. 3g。原阿里紅咳喘口服液，按照WS-10245 (ZD-0245) -2002標(biāo)準(zhǔn)方法制 備。Agilentl200高效液相色譜儀；METTLER AE240電子分析天平；甘草酸對(duì)照品（中國(guó)藥 品生物制品檢定所）。
[0017] 2、方法 照高效液相色譜法（中國(guó)藥典2010年版一部附錄VI D)測(cè)定。
[0018] 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0. 2mol/L醋酸 銨溶液-冰醋酸（67 : 33 : 1)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm。理論板數(shù)按甘草酸單銨鹽 峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。
[0019] 對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取甘草酸單銨鹽對(duì)照品l〇mg，置50ml量瓶中，用流動(dòng) 相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每Iml含甘草酸單銨鹽對(duì)照品0. 2mg，折合甘草酸為 0· 1959mg)。
[0020] 本發(fā)明阿里紅咳喘片供試品溶液的制備取本發(fā)明的阿里紅咳喘片，研細(xì)，取0. 6g， 精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加水IOml使溶解，溶液濾過(guò)，精密量取2ml濾液，移至蒸發(fā)皿 中，蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相使溶解，移至IOml量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，即得。
[0021] 對(duì)照產(chǎn)品供試品溶液的制備取對(duì)照的阿里紅咳喘口服液，精密量取2ml，移至蒸發(fā) 皿中，蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相使溶解，移至IOml量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，即得。
[0022] 測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μ 1，注入液相色譜儀，測(cè)定， 搖勻，即得。
[0023] 3、結(jié)果 結(jié)果表明，本發(fā)明阿里紅咳喘片中甘草酸的含量為3. 6-7. 2mg/片；而原阿里紅咳喘口 服液中甘草酸的含量為〇. 36mg/ml，每次服用量2片的甘草酸含量為原口服液劑含量的2-4 倍，在服用量減少的情況下，甘草酸含量有很大提高。
[0024] 上述研究表明，采用本發(fā)明制備方法制備的阿里紅咳喘片，有效成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高 于WS-10245 (ZD-0245)-2002標(biāo)準(zhǔn)記載的方法制備的阿里紅咳喘口服液。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說(shuō)明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解 本發(fā)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述 內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0026] 實(shí)施例1 取阿里紅20g、洋李100g、蘆根80g、甘草60g、麻黃50g、木香30g、洋茴香120g、香附 30g、豆蘧20g，將透骨草、五氣朝陽(yáng)草、姜黃加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑， 夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，CCV流量2ml/g生 藥·π?η，萃取時(shí)間180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入3L的70%乙醇， 投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃 縮，加到DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇， 濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70 % 乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0. 3g。
[0027] 經(jīng)檢測(cè)，成品中甘草酸的含量為7. 25mg/片。
[0028] 實(shí)施例2 取阿里紅20g、洋李100g、蘆根80g、甘草60g、麻黃50g、木香30g、洋茴香120g、香附 30g、豆蘧20g，將透骨草、五氣朝陽(yáng)草、姜黃加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑， 夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，CO 2流量31111/^生 藥·π?η，萃取時(shí)間150min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入3L的70%乙醇， 投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次5分鐘，合并萃取液，濃 縮，加到DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇， 濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70 % 乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0. 3g。
[0029] 經(jīng)檢測(cè)，成品中甘草酸的含量為4. 52mg/片。
[0030] 實(shí)施例3 取阿里紅20g、洋李100g、蘆根80g、甘草60g、麻黃50g、木香30g、洋茴香120g、香附 30g、豆蘧20g，將透骨草、五氣朝陽(yáng)草、姜黃加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑， 夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，CO 2流量11111/^生 藥·π?η，萃取時(shí)間200min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入3L的70%乙醇， 投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分鐘，合并萃取液，濃 縮，加到DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇， 濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70 % 乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0. 3g。
[0031] 經(jīng)檢測(cè)，成品中甘草酸的含量為3. 68mg/片。
[0032] 實(shí)施例4 :阿里紅咳喘片抑制小鼠胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究資料 1.實(shí)驗(yàn)材料 1. 1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株 小鼠胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)，DMEM+10% FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0033] 1.2實(shí)驗(yàn)藥物 研究藥物：本發(fā)明阿里紅咳喘片：按實(shí)施例1方法制備。
[0034] 藥液儲(chǔ)液：稱(chēng)取IOOmg阿里紅咳喘片，溶于5ml無(wú)水乙醇中，0. 2μπι濾器過(guò)濾， 500 μ Idoff管分裝，-20°c存儲(chǔ)，同時(shí)0. 2 μ m濾器過(guò)濾無(wú)水乙醇以備對(duì)照組之用。
[0035] 1. 3實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM(GIBC0 公司 Cat. No. 12100-061 Lot. No. 758137);胎牛血清（浙江天杭生物科 技有限公司Lot. No. 100419) ;NaHC03(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat. No. 11810-033 Lot. No. 1088387) ;Trypsin(AMRESC0 公司）；EDTA(AMRESC0 公司）！Penicillin G Sodium Salt (AMRESC0公司I) !Streptomycin Sulfate(AMRESCO);無(wú)水乙醇（溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限 公司）；MTT(Biosharp批號(hào)：0793) :PBS(實(shí)驗(yàn)室自配）； 1.4實(shí)驗(yàn)器材 萊卡倒置顯微鏡（德國(guó)Leica型號(hào)：DMIL);可見(jiàn)-紫外光微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)MD公 司型號(hào)：SPECTRAMAX 190) ;C02培養(yǎng)箱（FORMA型號(hào)：3111);超凈臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司制 造型號(hào)=SW-CJ-ZFD);純水儀（美國(guó)Spring公司型號(hào)：S/N 020579);精密移液器（法國(guó)吉 爾森公司型號(hào)：P2);電子天平（德國(guó)賽多利斯有限公司型號(hào)：BT323S);全自動(dòng)高壓滅菌鍋 (日本SANK)公司型號(hào)：MLS-3020);臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號(hào)： DHG9123A);冰箱（西門(mén)子公司型號(hào)：KG18V21TI);液氮罐（CBS型號(hào)：2001);低速離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠型號(hào)：KA-1000) ;0· 2 μ m濾器（MILLIP0RE型號(hào)：SLGP033RB) ;lcm培 養(yǎng)皿（NEST公司）、96孔培養(yǎng)板（NEST公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0036] 2.實(shí)驗(yàn)方法 1)MFC細(xì)胞用DMEM+10% FBS于37°C、5% CO2進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)（10cm培養(yǎng)皿），當(dāng)細(xì)胞生 長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0. 25 %胰蛋白酶-0. 04% EDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管 中，IOOOrpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3 X IO4個(gè)/ml。
[0037] 2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180 μ 1，培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱 中（37°C，5% CO2)常規(guī)培養(yǎng)。
[0038] 3)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般長(zhǎng)至50% -70%，加入阿里紅咳喘片溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 24h。
[0039] 4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液（5mg/ml，即 0· 5% MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0040] 5)4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔如入200 μ 1二甲基亞砜，置搖 床上低速振蕩l〇min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。
[0041] 6)同時(shí)設(shè)置本底（不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解 介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。
[0042] 7)結(jié)果以藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率表示：細(xì)胞增值抑制率（％) = (對(duì)照孔OD值-給 藥孔OD值）、對(duì)照孔OD值X 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0043] 3.統(tǒng)計(jì)處理 采用Microsoft Excel 2007軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以mean土S. D.表不。
[0044] 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時(shí)，對(duì)MFC細(xì)胞增殖抑 制有差異（P〈〇. 05)，劑量在10mg/ml時(shí)該差異具有顯著性（P〈0. 01)，當(dāng)劑量達(dá)到15-20mg/ ml時(shí)有極顯著性差異（P〈0. 001)。
[0045] 表1阿里紅咳喘片對(duì)MFC細(xì)胞增殖抑制影響研究（X土 SD)

【權(quán)利要求】
1. 一種阿里紅咳喘片的制備方法，由阿里紅20g、洋李100g、蘆根80g、甘草60g、麻黃 50g、木香30g、洋茴香120g、香附30g、豆蘧20g作為原料藥制成，其特征在于，所述的制備方 法由下列步驟組成：取洋茴香、麻黃、木香、香附、豆蘧，加入到〇)2超臨界萃取器中，乙醇作 為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C， C02流量l_3ml/g生藥^化，萃取時(shí)間150-200min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉 碎，加入3L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次， 每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到D101大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量 柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微 波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0. 3g。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿里紅咳喘片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取 中夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿里紅咳喘片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取 中萃取壓力為25 MPa。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿里紅咳喘片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取 中萃取溫度為40 °C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿里紅咳喘片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取 中C02流量2ml/g生藥? min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿里紅咳喘片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取 中萃取時(shí)間為180min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿里紅咳喘片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取功率 為 7001
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿里紅咳喘片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取每次 萃取時(shí)間為8分鐘。
9. 權(quán)利要求1所述的阿里紅咳喘片在制備抑制小鼠胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】A61K9/20GK104352928SQ201410548759
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月16日
【發(fā)明者】孫波 申請(qǐng)人:濟(jì)南新起點(diǎn)醫(yī)藥科技有限公司