蠶蟲(chóng)草在抗呼吸道合胞病毒的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，公開(kāi)了蠶蟲(chóng)草在制備抗呼吸道合胞病毒藥物中的應(yīng)用。經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，蠶蟲(chóng)草對(duì)呼吸道合胞病毒RSV有顯著的抑制作用，本發(fā)明為蠶蟲(chóng)草臨床用于治療呼吸道合胞病毒RSV感染性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)研制抗呼吸道合胞病毒RSV的藥物提供一定的指導(dǎo)意義，具有重要的參考價(jià)值。
【專利說(shuō)明】蠶蟲(chóng)草在抗呼吸道合胞病毒的藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，涉及蠶蟲(chóng)草在制備抗呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus, RSV)的藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)前呼吸道感染的治療分別施用用于治療、預(yù)防或改善病毒性、細(xì)菌性和真菌性 呼吸道感染的抗病毒劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑。呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV)主要引起呼吸系統(tǒng)感染，在嬰幼兒、老年以及免疫缺陷人群引起嚴(yán)重肺炎，是人 類上呼吸道感染的重要病原之一。但在抗病毒治療中，由于病毒的細(xì)胞寄生性及細(xì)胞內(nèi)繁 殖等特點(diǎn)，其治療具有一定難度。三氮唑核苷（Ribavirin，又名病毒唑）是目前治療RSV感 染唯一有效的化學(xué)藥物，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，若以氣霧形式給予適當(dāng)?shù)膭┝?，可使肺和鼻?的RSV滴度減少，藥物能直接到達(dá)細(xì)小支氣管，而其他方式給藥則很難獲得治療濃度。中藥 由于其直接及間接的抗病毒作用特點(diǎn)，使其在治療病毒類疾病具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其能在抗病 毒同時(shí)兼有解熱、抗炎等作用，還能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞組織，同時(shí)很少 傷害正常組織細(xì)胞，毒副作用較小，故其臨床使用前景廣闊。
[0003] 北冬蟲(chóng)夏草[Cordyc epsmilitaris(Fr. )Link]又名蛹蟲(chóng)草，屬于子囊菌綱、肉座 菌目、麥角菌科、蟲(chóng)草屬真菌，是蟲(chóng)草屬的模式種。以家蠶幼蟲(chóng)為寄主栽培北蟲(chóng)草，也簡(jiǎn)稱為 蠶蟲(chóng)草，其蟲(chóng)草形態(tài)更接近天然蟲(chóng)草?！缎氯A本草綱目》稱其"味甘，性平"，具有"益肺腎、補(bǔ) 精髓、止血化痰"的功效?，F(xiàn)代研究表明北蟲(chóng)草有增強(qiáng)人體免疫力及抗腫瘤的作用，在治療 肺虛咳嗽、支氣管炎、哮喘方面以及抗菌、抗血栓、抗氧化等方面也具有顯著作用。但關(guān)于蠶 蟲(chóng)草在呼吸系統(tǒng)的作用未見(jiàn)報(bào)道，其對(duì)于呼吸道合胞病毒（RSV)抑制活性也沒(méi)有任何啟示 的可能。
[0004] 為了尋求新的治療藥物，需要開(kāi)發(fā)能夠從根本上治療病因并有效地改善疾病癥狀 的天然藥物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供蠶蟲(chóng)草在制藥中的新用途：
[0006] 蠶蟲(chóng)草在制備抗RSV藥物中的應(yīng)用。
[0007] 經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，蠶蟲(chóng)草對(duì)RSV有顯著的抑制作用：抑制RSV在HEK293細(xì)胞出現(xiàn)CPE 效應(yīng)（Cytopathic Effect，CPE)，其對(duì)呼吸道合胞病毒A亞型的抑制率為108. 62%，對(duì)呼吸 道合胞病毒B亞型的抑制率為103. 13% ;通過(guò)肺部病變?cè)u(píng)分可見(jiàn)其能有效改善RSV肺炎幼 大鼠的癥狀，治療效果良好。
[0008] 本發(fā)明涉及的蠶蟲(chóng)草在制備治療呼吸道合胞病毒（RSV)藥物中的用途屬于首次 公開(kāi)，而且其對(duì)于呼吸道合胞病毒（RSV)抑制活性強(qiáng)的意想不到。

【具體實(shí)施方式】
[0009] 以下將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明目的，而不 用于限制本發(fā)明范圍。
[0010] 實(shí)施例1
[0011] 蠶蟲(chóng)草制備：采用5齡家蠶，北蟲(chóng)草菌注射接種，正常飼養(yǎng)，將硬化蠶培養(yǎng)至子實(shí) 體長(zhǎng)出。冷凍干燥后，粉碎至120目，備用。
[0012] 實(shí)施例2蠶蟲(chóng)草對(duì)呼吸道合胞病毒（RSV)的作用研究
[0013] 試樣配制：自制蠶蟲(chóng)草（方法如實(shí)施例1)、蛹蟲(chóng)草（購(gòu)買）、蟲(chóng)草花（購(gòu)買）、冬蟲(chóng) 夏草（購(gòu)買）粉碎后，溶解于DMEM液（含2%小牛血清）中備用，配制濃度為100 μ g/mL。
[0014] 利巴韋林注射液（湖北潛江制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)081004,國(guó)藥準(zhǔn)字 !119993455)，規(guī)格 ：10011^/11^(支），用含2%小牛血清的01^培養(yǎng)基配制濃度為20(^8/ mL〇
[0015] 細(xì)胞株與病毒株：人胚腎細(xì)胞（HEK293，RSV病毒敏感細(xì)胞）購(gòu)自美國(guó)Clontech公 司；呼吸道合胞病毒（RSV)A亞型（Long株）、B亞型（R6株），由中國(guó)科學(xué)院武漢分院病毒 所提供。
[0016] 細(xì)胞的培養(yǎng)及RSV擴(kuò)增：人胚腎細(xì)胞（HEK293)，鏡下觀察細(xì)胞呈三角形或多角形， 生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞每2-3天傳代，0.25 %胰酶消化l-2min，鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓時(shí)停 止消化，每次分3-4瓶，于37°C、5% C02培養(yǎng)箱飽和濕度下培養(yǎng)。HEK293細(xì)胞以l*105/mL 接種24孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層時(shí)棄培養(yǎng)液，接種病毒液200 μ L/孔，置37°C、5% C02培養(yǎng)箱 中吸附1. 5h后，補(bǔ)充含2%胎牛血清的維持液至lmL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)3-5d。逐日觀察細(xì)胞病 變（cytopathic effect，CPE)，典型病變是融合的大泡，病變達(dá)75%以上時(shí)，置_70°C (至 少2h)和37°C反復(fù)凍融3次。收集病毒液，2500r/min離心lOmin。棄沉淀，收集病毒上清 液，分裝后于_70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0017] 細(xì)胞最大無(wú)毒濃度的測(cè)定：參照文獻(xiàn)（汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血 清對(duì)呼吸道合胞病毒抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008 ;24(1) :25-27)的 方法，將蟲(chóng)草樣品和利巴韋林接種于96孔板中的HEK293上，每孔100 μ L，并設(shè)正常細(xì)胞對(duì) 照組。置37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變至72h。棄去上清液，用移液器每孔加 入奶7(111^/1^)10(^1^。置培養(yǎng)箱中孵育411。吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入10(^1^1^0，振 蕩，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長(zhǎng)，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔光吸收值。確定藥物 的最大無(wú)毒濃度。結(jié)果可見(jiàn)在HEK293細(xì)胞中，蠶蟲(chóng)草、蛹蟲(chóng)草、蟲(chóng)草花和利巴韋林的最大無(wú) 毒濃度為500 μ g/mL。
[0018] 呼吸道合胞病毒A、B亞型組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（50percent Tissue Culture Infective Dose，TClD5(l)的測(cè)定：HEK293細(xì)胞接種96孔細(xì)胞板，每孔100yL。病毒懸液用 不完全培養(yǎng)基（不含新生牛血清的培養(yǎng)基）10倍稀釋8個(gè)濃度。接種細(xì)胞，長(zhǎng)成單層時(shí)吸 棄培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞面，接種各稀釋度的病毒液。并設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組。置37°C、5%C0 2 培養(yǎng)箱中吸附2h。吸棄病毒液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察病變程度并記錄。以最高稀釋度不 再出現(xiàn)新病變時(shí)為終點(diǎn)，細(xì)胞病變程度用-?++++表示：無(wú)細(xì)胞病變時(shí)為25%以下細(xì) 胞出現(xiàn)病變?yōu)?" + "，25%?50%為 "++"，50%?75%為 "+++"，75%?100%為 "++++"。用 Reed-Muench 公式計(jì)算 TCID5Q。結(jié)果可見(jiàn)在 HEK293 中，RsvA 亞型 TCID5Q 為 ΚΓ3·98, RSVB 亞 型 TCID5Q 為 ΚΓ3·64。
[0019] 不同蟲(chóng)草樣品對(duì)RSV的抑制作用：將1*105濃度的HEK293細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板 上，置37°C、5% C02箱培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)成單層，在18?36h內(nèi)，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞面， 每孔接種l〇〇TCID 5(lRSVA或B亞型，置37°C、5% C02培養(yǎng)箱吸附2h。吸棄病毒液，分別加入 不同蟲(chóng)草樣品，并設(shè)利巴韋林藥物對(duì)照、病毒對(duì)照、空白對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照，每組5個(gè)復(fù) 孔，每孔100 μ L。利巴韋林用維持液稀釋成200 μ g/mL，正常細(xì)胞和病毒對(duì)照只加維持液， 置37°C、5%C02培養(yǎng)箱。每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變。72h后加入MTT(lmg/mL)，每 孔1〇〇μ L，置37°C、5%% C02培養(yǎng)箱，4h后，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入100μ LDMS0， 振蕩，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長(zhǎng)，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔光吸收值。
[0020]

【權(quán)利要求】
1.蠶蟲(chóng)草在制備抗呼吸道合胞病毒的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK104208105SQ201410489659
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月19日
【發(fā)明者】韋敏, 呂曄, 鄭生智, 蔣翠平, 劉菲 申請(qǐng)人:江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所, 江蘇富柏傳媒有限公司