一種高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體及其凍干粉針的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種高三尖杉酯堿的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體及其凍干粉針的制備方法，這種高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體含高三尖杉酯堿2～8重量份、磷脂10～100重量份、膽固醇1～10重量份、聚乙二醇化脂質(zhì)2-100重量份。其制備方法為將上述組份溶于有機(jī)溶劑中，混合均勻，除去有機(jī)溶劑，加入適量?jī)龈杀Ｗo(hù)劑，凍干即得高三尖杉酯堿的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉針。這種高三尖杉酯堿的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉針既能顯著提高貯存穩(wěn)定性，又能使高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉針能便于稀釋給藥，使脂質(zhì)體中的藥物持續(xù)釋放，延長(zhǎng)在血液中的循環(huán)時(shí)間，以提高藥物有效成份的利用率，降低毒副作用。
【專利說明】一種高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體及其凍干粉針的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體及其凍干粉針制備方法，具體涉及一種高三尖杉酯堿的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體及其凍干粉針制備方法，屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]高三尖杉酯堿(HHT)是從我國(guó)特有植物海南粗榧中分離出來的一種有效抗白血病藥物，在世界上也是我國(guó)首先用于急性髓細(xì)胞白血病(AML)的治療，并獲得顯著療效。三尖杉酯堿類可抑制真核細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的起始階段，可使核糖核蛋白體分解，釋放出新生肽鏈，干擾核糖核蛋白體功能。藥理研究發(fā)現(xiàn)，三尖杉酯堿類主要?dú)鸖期細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞從G1 — S、G2 — Μ期移行均有阻斷作用，可抑制細(xì)胞的DNA及蛋白質(zhì)的合成，從而抑制細(xì)胞的有絲分裂。ΗΗΤ的作用機(jī)制涉及抑制蛋白合成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化等，其中以誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡最為重要。
[0003]長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(long circulating liposomes, LCL)遞藥系統(tǒng),可逃避單核巨卩遼細(xì)胞系統(tǒng)的識(shí)別及捕獲，長(zhǎng)時(shí)間停留在循環(huán)系統(tǒng)，能提聞藥物的療效和減少不良應(yīng)，而且能選擇性地趨向腫瘤組織并保持較高的藥物濃度。
[0004]循環(huán)的白血病細(xì)胞可以侵入至骨髓系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中引起相應(yīng)病變。
[0005]研究開發(fā)具有白血病治療功效的聞二尖杉酷喊長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，可以提聞其在血內(nèi)循環(huán)時(shí)間、增加藥物在侵襲病變區(qū)的滯留時(shí)間、提高靶區(qū)藥物濃度，有利于提高白血病的治療效果，降低毒副作用，改善病人生存狀況。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]技術(shù)問題:本發(fā)明公開了一種臨床適用的高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體及其凍干粉針的制備方法，既能顯著提高貯存穩(wěn)定性，又能使高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉針能便于稀釋給藥，使脂質(zhì)體中的藥物持續(xù)釋放，延長(zhǎng)在血液中的循環(huán)時(shí)間，以提高藥物有效成份的利用率，降低毒副作用。
[0007]技術(shù)方案:本發(fā)明提供了一種高三尖杉酯堿的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，該高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的重量份組成為:高三尖杉酯堿2?8重量份、磷脂10?100重量份、膽固醇1?10重量份、聚乙二醇化脂質(zhì)2-100重量份。
[0008]所述磷脂為大豆磷脂、卵磷脂、合成磷脂或氫化磷脂的一種或幾種。
[0009]所述聚乙二醇化脂質(zhì)為聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-聚己內(nèi)酯、聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯、泊洛沙姆188、聚氧乙烯脂肪酸酯類、聚氧乙烯脂肪酸醚或聚氧乙烯甲基蓖麻油醚中的一種或幾種。
[0010]本發(fā)明的高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的凍干粉針的制備方法包括以下步驟:
[0011]1)分別稱取高三尖杉酯堿2?8重量份、磷脂10?100重量份、膽固醇1?10重量份、聚乙二醇化脂質(zhì)2-100重量份，溶于2-10重量份有機(jī)溶劑中；
[0012]2)減壓蒸去步驟I)溶液中有機(jī)溶劑，加入2-10重量份純化水形成混懸液，勻化，超聲，即得高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體；
[0013]3)將凍干保護(hù)劑溶解在步驟2)得到的高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體中，凍干保護(hù)劑與高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體中磷脂重量比為0.2?4:1，無菌過濾；
[0014]4)將步驟3)溶液檢驗(yàn)合格，裝瓶，凍干，即得高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉針。
[0015]所述步驟2)還可以為:直接將步驟I)所得到的最終溶液加入2-10重量份純化水后，減壓蒸去有機(jī)溶劑形成混懸液，勻化，超聲，即得高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體。
[0016]所述有機(jī)溶劑為氯仿、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮或石油醚中的一種或幾種。
[0017]所述凍干保護(hù)劑為葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖或海藻糖中的一種或幾種。
[0018]所述凍干保護(hù)劑與高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體中磷脂重量比為0.5?1:1。
[0019]有益效果:研究發(fā)現(xiàn)，高三尖杉酯堿與磷脂的用量比例不同，導(dǎo)致制備的脂質(zhì)體的質(zhì)量也不同，另外，膽固醇的添加使脂質(zhì)體制劑包封率顯著提高，超聲使粒徑顯著降低，聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺的添加使脂質(zhì)體制劑為長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，能增加血液循環(huán)時(shí)間，選擇性地趨向病變侵襲的組織，并延長(zhǎng)釋藥時(shí)間，維持有效的藥物濃度。
[0020]本發(fā)明高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體制劑配方與工藝可使脂質(zhì)體達(dá)到較高的包封率，且有穩(wěn)定的載藥量。本發(fā)明的脂質(zhì)體中藥物持續(xù)釋放，延長(zhǎng)藥物的在血液中的循環(huán)時(shí)間。本發(fā)明臨床適用的高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體注射用凍干粉針，既能顯著提高貯存穩(wěn)定性，又能使高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉在加入注射用水重新分散后，能以適當(dāng)比例與等滲輸液稀釋給藥，保存及用藥方便，且提高病人順應(yīng)性。

【具體實(shí)施方式】
[0021]以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0022]實(shí)施例1:高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉針制備
[0023]稱取高三尖杉酯堿8mg、磷脂40mg，膽固醇2.3mg，聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)8mg溶于乙醇中，混合均勻。將脂質(zhì)溶液于40°C水浴中、減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，減壓除去有機(jī)溶劑。將形成的脂膜中加入純化水，混勻，孵育，得脂質(zhì)體混懸液。將所得脂質(zhì)體混懸液進(jìn)行探針超聲減少粒徑即得。將20mg甘露醇溶解在脂質(zhì)體中，無菌過濾后(膜濾器孔徑0.22 μ m)，將最終分散物分裝在西林瓶中，封蓋，凍干，即得成品。
[0024]實(shí)施例2:高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉針包封率與釋藥測(cè)定
[0025]將凍干粉用滅菌注射用水溶解，然后按葡聚糖凝膠色譜法測(cè)定藥物包封率，柱內(nèi)徑為1.5cm,柱高15cm。精密移取脂質(zhì)體2mL上柱，以pH6.8PBS洗脫，收集前15mL的流份，精密移取ImL流份樣品，至1mL容量瓶中，以甲醇定容，HPLC分析，計(jì)算其含量，按以下公式計(jì)算包封率:
[0026]包封率=Cm/Ct X 100%，其中Cm為包入脂質(zhì)體中的高三尖杉酯堿的量，Ct為高三尖杉酯堿總量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該制劑藥物包封率為(90.84±2.23)%
[0027]取分離得到高三尖杉酯堿脂質(zhì)體混懸液和等濃度的高三尖杉酯堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別裝入已經(jīng)處理好的透析袋中，以透析袋夾夾緊，置于PH6.8的緩沖液20mL中恒溫(37 ± I) °C，恒速 50rpm 攪拌，分別于 10、30、60、120min 和 4、6、8、12、24h 取釋放液 0.5mL，同時(shí)補(bǔ)加等體積同溫度的釋藥介質(zhì)，將藥液以0.22 μ m的微孔濾膜過濾，進(jìn)樣10 μ L，計(jì)算累積釋藥百分?jǐn)?shù)。以累積釋藥百分率對(duì)時(shí)間(t，h)作圖，結(jié)果，游離的高三尖杉酯堿在4h內(nèi)釋放的較快，大于80%，而高三尖杉酯堿脂質(zhì)體則在12h內(nèi)穩(wěn)定釋放，與前者相比，脂質(zhì)體具有一定的緩釋效果。
[0028]實(shí)施例3:高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉針的貯存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
[0029]以凍干前的高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體溶液為對(duì)照，以形態(tài)變化、粒徑變化、包封率變化、藥物含量變化為指標(biāo)，比較凍干后放置3個(gè)月的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明凍干后放置3個(gè)月粒徑?jīng)]有明顯變化(p〈0.05)，粒徑分布均勻，多分散系數(shù)為0.181 ;外觀形態(tài)沒有明顯變化，均勻圓整，呈現(xiàn)球形或類球形；藥物包封率和藥物的含量差異均為沒有明顯變化(p〈0.05)，表現(xiàn)出高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉的貯存穩(wěn)定性。
[0030]實(shí)施例4:高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用
[0031]將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人白血病細(xì)胞K562按每孔lOOyL(約lX104/mL)接種在96孔板中，置于37°C，含5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。樣品分三組:①生理鹽水對(duì)照組，②市售高三尖杉酯堿注射液組和③高三尖杉酯堿脂質(zhì)體的凍干粉溶液組，每組分別用培養(yǎng)液稀釋至低、中、高三種濃度，向每孔加100 μ L樣品，使各組中藥物濃度分別一致；將96孔板在37°C，含5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h。向各孔中加入cck_8溶液10 μ L。37°C下孵育4h。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光度(0D)，計(jì)算細(xì)胞的存活率。
[0032]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞活力均隨著制劑中藥物濃度的增加明顯降低，說明藥物濃度越大，對(duì)K562細(xì)胞的毒性越大；當(dāng)②和③中藥物濃度相同時(shí)，③組的細(xì)胞活力最小，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)。
[0033]實(shí)施例5:高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體對(duì)白血病小鼠模型的治療作用
[0034]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，去上清，用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，充分去除胎牛血清，再用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細(xì)胞配成1 X 106個(gè)/mL濃度的細(xì)胞懸液。隨后向N0D/SCID小鼠尾靜脈注射lmL的上述細(xì)胞懸液。接種后用流式技術(shù)檢測(cè)外周血中⑶13表達(dá)，以鑒定造模成功。待模型建立成功后，將小鼠隨機(jī)分為①生理鹽水組、②市售第高三尖杉酯堿組和③高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體組，分別在0、3、6、9天尾靜脈注射給藥，②③組藥物濃度一致。過程中觀察小鼠體重變化、生存時(shí)間，14天后處死小鼠，檢測(cè)外周血中白細(xì)胞數(shù)量和CD13的陽性表達(dá)率。
[0035]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比較②組，第③小鼠體重變化較小，沒有明顯體重下降；生存率提高。外周血中白細(xì)胞數(shù)量和⑶13的陽性表達(dá)率，均為①最高，其次為②組，第③組最小。
【權(quán)利要求】
1.一種高三尖杉酯堿的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，其特征在于該高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的重量份組成為:高三尖杉酯堿2?8重量份、磷脂10?100重量份、膽固醇I?10重量份、聚乙二醇化脂質(zhì)2-100重量份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，其特征在于所述磷脂為大豆磷脂、卵磷脂、合成磷脂或氫化磷脂的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，其特征在于所述聚乙二醇化脂質(zhì)為聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-聚己內(nèi)酯、聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯、泊洛沙姆188、聚氧乙烯脂肪酸酯類、聚氧乙烯脂肪酸醚或聚氧乙烯甲基蓖麻油醚中的一種或幾種。
4.一種如權(quán)利要求1所述的高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的凍干粉針的制備方法，其特征在于該制備方法包括以下步驟: 1)分別稱取高三尖杉酯堿2?8重量份、磷脂10?100重量份、膽固醇I?10重量份、聚乙二醇化脂質(zhì)2-100重量份,溶于2-10重量份有機(jī)溶劑中； 2)減壓蒸去步驟I)溶液中有機(jī)溶劑，加入2-10重量份純化水形成混懸液，勻化，超聲，即得高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體； 3)將凍干保護(hù)劑溶解在步驟2)得到的高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體中，凍干保護(hù)劑與高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體中磷脂重量比為0.2?4:1，無菌過濾； 4)將步驟3)溶液檢驗(yàn)合格，裝瓶，凍干，即得高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉針。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的凍干粉針的制備方法，其特征在于所述步驟2)為:直接將步驟I)所得到的最終溶液加入2-10重量份純化水后，減壓蒸去有機(jī)溶劑形成混懸液，勻化，超聲，即得高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉針的制備方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑為氯仿、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮或石油醚中的一種或幾種。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉針的制備方法，其特征在于所述凍干保護(hù)劑為葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖或海藻糖中的一種或幾種。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉針的制備方法，其特征在于所述凍干保護(hù)劑與高三尖杉酯堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體中磷脂重量比為0.5?1:1。
【文檔編號(hào)】A61P35/02GK104257609SQ201410447264
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月3日
【發(fā)明者】熊非, 田吉來, 顧寧, 吉民 申請(qǐng)人:東南大學(xué)