特異性細(xì)胞粘附的殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種特異性細(xì)胞粘附的殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料及其制備方法，本發(fā)明將高相對(duì)分子質(zhì)量(10萬(wàn)以上)的殼聚糖接枝具有細(xì)胞特異性粘附的多肽RGD(精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸序列),并在分子量調(diào)節(jié)劑的作用下通過(guò)γ射線輻照降解工藝制備得到一種特異性細(xì)胞粘附的低分子量殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料。本發(fā)明用于臨床上傷口殺菌、止血止痛、止癢、促進(jìn)愈合。本發(fā)明具有細(xì)胞特異性識(shí)別粘附，避免異體排斥反應(yīng)、生物相容性良好，應(yīng)用范圍廣泛，制備工藝簡(jiǎn)單可控，重復(fù)性好的特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】特異性細(xì)胞粘附的殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)用液體敷料【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 殼聚糖是一種天然多糖，已經(jīng)在醫(yī)學(xué)臨床上獲得了大量的研究與應(yīng)用。殼聚糖酶 解后可以被人體組織吸收，對(duì)人體具有良好的生物相容性和良好的降解性，對(duì)人體無(wú)毒無(wú) 積累。殼聚糖的性能與其相對(duì)分子質(zhì)量的大小關(guān)系密切，例如對(duì)于革蘭氏陰性菌，隨著相對(duì) 分子質(zhì)量的減小，殼聚糖的抗菌性能逐漸增強(qiáng)，對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌，隨著相對(duì)分子質(zhì)量的減 小，殼聚糖的抗菌性能逐漸減弱。研究表明相對(duì)分子質(zhì)量10萬(wàn)以上的殼聚糖具有良好的成 膜性和止血、止疼、抗菌性能，相對(duì)分子質(zhì)量低于1萬(wàn)的殼聚糖，具有很多高相對(duì)分子質(zhì)量 殼聚糖所不具有的功能，如保濕性、免疫調(diào)節(jié)、防癌、排除體內(nèi)有毒害的物質(zhì)、抗菌、防止傷 口感染，促進(jìn)肉芽生長(zhǎng)和皮膚再生等許多作用。調(diào)節(jié)胃腸道微循環(huán)的功能等等。
[0003] 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly_Asp，RGD)三肽是一種重要的細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn) 與信號(hào)啟動(dòng)分子，存在于多種生物細(xì)胞外基質(zhì)和血漿蛋白結(jié)構(gòu)中，同時(shí)也是細(xì)胞間識(shí)別系 統(tǒng)的基本單位。RGD作為一種重要的細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)與信號(hào)啟動(dòng)分子，在許多生命活動(dòng)中發(fā) 揮著重要的調(diào)節(jié)功能，具有重要的醫(yī)療價(jià)值，包括在腫瘤診治方面的作用、治療急性腎衰抗 炎、誘導(dǎo)組織再生、治療骨質(zhì)疏松以及皮膚再生、傷口愈合等。
[0004] 殼聚糖是自然中唯一含有氨基的活性多糖，通過(guò)氨基、羧基的催化反應(yīng)，將含RGD 序列多肽小分子接枝于殼聚糖分子，能夠有效提高殼聚糖與細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)的粘附、相容 性能，促進(jìn)殼聚糖與機(jī)體的特異性結(jié)合，更好的發(fā)揮殼聚糖和RGD序列對(duì)創(chuàng)面愈合的積極 作用。
[0005] 然而天然殼聚糖粗產(chǎn)品中殼聚糖相對(duì)分子質(zhì)量一般都在10萬(wàn)以上，水溶性差，應(yīng) 用上受到限制。因此選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)殼聚糖進(jìn)行降解，可以提高殼聚糖的性能應(yīng)用。殼 聚糖的降解方法主要有化學(xué)法、酶法、物理方法。其中化學(xué)法降解分子量分布寬，但是工藝 條件差，降解過(guò)程難以控制，重復(fù)性差；酶降解反應(yīng)條件溫和，但是對(duì)殼聚糖的結(jié)構(gòu)具有選 擇性；物理方法降解具有反應(yīng)快，無(wú)污染，重復(fù)性好，但是反應(yīng)機(jī)理比較復(fù)雜。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種特異性細(xì)胞粘附的殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷 料及其制備方法。本發(fā)明的一種特異性細(xì)胞粘附的殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料具有良好的成膜性 和止血、止疼、抗菌、防止傷口感染、促進(jìn)肉芽生長(zhǎng)和皮膚再生等性能，減少形成瘢痕，對(duì)創(chuàng) 面愈合有很好的治療效果。本發(fā)明的一種特異性細(xì)胞粘附的殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料的制備方 法，具有反應(yīng)快，無(wú)污染，重復(fù)性好的特點(diǎn)。
[0007] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是： 本發(fā)明一種特異性細(xì)胞粘附的殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料及其制備方法，其特征在于，用純 水配制接枝小分子多肽RGD的殼聚糖和分子量調(diào)節(jié)劑溶液，將混合水溶液通過(guò)γ射線輻照 降解工藝制備得到。
[0008] 本發(fā)明所述的殼聚糖接枝多肽RGD的特征在于，將殼聚糖溶解在2-嗎啉乙磺 酸（MES，pH 4. 0-6.0緩沖溶液）中，加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC)， N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)和R⑶，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，透析3天，冷凍干燥，得到產(chǎn)物RGD接 枝的殼聚糖。其中殼聚糖(分子量10萬(wàn)及以上）濃度為〇. 1%_5%，殼聚糖與RGD摩爾比為 1:10-1:1，殼聚糖與EDC摩爾比為1:10-10:1，EDC與NHS摩爾比為1:1-10:1。透析液成分 選自乳酸、醋酸、富馬酸和鹽酸。上述所述組成、成分例子包括但不限于此。
[0009] 本發(fā)明所述的含RGD多肽為含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp)序列 的小分子多肽，具有細(xì)胞特意識(shí)別能力。
[0010] 本發(fā)明所述的殼聚糖接枝RGD接枝率為10%-60%，分子量調(diào)節(jié)劑的水溶液中殼聚 糖的質(zhì)量濃度為〇. 2-3%，分子量調(diào)節(jié)劑的質(zhì)量濃度為0. 04-0. 2%。
[0011] 本發(fā)明所述的Y射線輻照降解工藝為無(wú)氧條件下輻照強(qiáng)度l〇_25kGy的鈷-60 γ 射線輻照。
[0012] 本發(fā)明所述的分子量調(diào)節(jié)劑為碘、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)中的一種或多種。所述 組成成分的非限制性例子包括但不限于碘、谷氨酸、天冬氨酸賴氨酸、組氨酸、抗菌肽D、 α -乳清蛋白、卵清蛋白或血清清蛋白。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案，在分子量調(diào)節(jié)劑的作用下，抑制了殼聚 糖的快速輻照降解，比常規(guī)輻照降解產(chǎn)物中含有更多地中高相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖，殼聚 糖的脫乙酰度等結(jié)構(gòu)特征未發(fā)生變化。本發(fā)明提供的技術(shù)方案使得殼聚糖具有特異性細(xì) 胞、組織粘附作用，具有良好的生物相容性，降解產(chǎn)物具有很寬的分子量分布，兼具高相對(duì) 分子質(zhì)量殼聚糖、低相對(duì)分子質(zhì)量殼聚糖和殼寡糖多種組分，具有良好的成膜性和止血、止 疼、抗菌、防止傷口感染、促進(jìn)肉芽生長(zhǎng)和皮膚再生等性能。殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料噴涂于皮 膚表面，黏附性好，形成具有呼吸性能的抗菌薄膜，具有廣譜抗菌，減少瘢痕形成，促進(jìn)創(chuàng)面 愈合。
[0014] 經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料對(duì)各種外傷性創(chuàng)面，體表潰瘍創(chuàng)面等都 具有顯著的療效。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不構(gòu)成對(duì) 本發(fā)明的任何限制，任何人在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的 權(quán)利要求保護(hù)范圍內(nèi)。
[0016] 實(shí)施例1 殼聚糖溶解在MES中，加入EDC，NHS和R⑶，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，透析3天，冷凍干燥。 其中殼聚糖濃度為1%，殼聚糖與RGD摩爾比為1:10,殼聚糖與EDC摩爾比為1:10, EDC與 NHS摩爾比為10:1。透析液成分為稀鹽酸。RGD接枝率為58%。
[0017] 室溫下，按照以下配方制備溶液： RGD-殼聚糖(重量百分比，相對(duì)分子質(zhì)量40萬(wàn)以上）1% ; 卵清蛋白（重量百分比）0. 2% ; 余量為純化水。
[0018] 將配置好的溶液靜置24小時(shí)，過(guò)濾去除不溶物，在無(wú)氧條件下，10kGy鈷-60 γ射 線輻照20分鐘，制得淡黃色澄清透明液體，即為產(chǎn)品。
[0019] 實(shí)施例2 殼聚糖溶解在MES中，加入EDC，NHS和R⑶，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，透析3天，冷凍干燥。 其中殼聚糖濃度為4%，殼聚糖與RGD摩爾比為1:10,殼聚糖與EDC摩爾比為1:5, EDC與NHS 摩爾比為5:1。透析液成分為乳酸。RGD接枝率為32%。
[0020] 室溫下，按照以下配方制備溶液： RGD-殼聚糖(重量百分比，相對(duì)分子質(zhì)量10萬(wàn)以上）3% ; 碘(重量百分比）0.05% ; 余量為純化水。
[0021] 將配置好的溶液靜置24小時(shí)，過(guò)濾去除不溶物，在無(wú)氧條件下，15kGy鈷-60 γ射 線輻照20分鐘，制得淡黃色澄清透明液體，即為產(chǎn)品。
[0022] 實(shí)施例3 殼聚糖溶解在MES中，加入EDC，NHS和R⑶，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，透析3天，冷凍干燥。 其中殼聚糖濃度為5%，殼聚糖與RGD摩爾比為1:10,殼聚糖與EDC摩爾比為1:10, EDC與 NHS摩爾比為5:1。透析液成分為富馬酸。RGD接枝率為40%。
[0023] 室溫下，按照以下配方制備溶液： RGD-殼聚糖(重量百分比，相對(duì)分子質(zhì)量40萬(wàn)以上）2% ; α -乳清蛋白（重量百分比）〇. 08% ; 余量為純化水。
[0024] 將配置好的溶液靜置24小時(shí)，過(guò)濾去除不溶物，在無(wú)氧條件下，25kGy鈷-60 γ射 線輻照20分鐘，制得淡黃色澄清透明液體，即為產(chǎn)品。
[0025] 實(shí)施例4 殼聚糖溶解在MES中，加入EDC，NHS和R⑶，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，透析3天，冷凍干燥。 其中殼聚糖濃度為〇. 5%，殼聚糖與RGD摩爾比為1:5,殼聚糖與EDC摩爾比為5: 1，EDC與 NHS摩爾比為10:1。透析液成分為檸檬酸。RGD接枝率為26%。
[0026] 室溫下，按照以下配方制備溶液： RGD-殼聚糖(重量百分比，相對(duì)分子質(zhì)量60萬(wàn)以上）0. 8% ; 組氨酸(重量百分比）〇. 05% ; 余量為純化水。
[0027] 將配置好的溶液靜置24小時(shí)，過(guò)濾去除不溶物，在無(wú)氧條件下，50kGy鈷-60 γ射 線輻照20分鐘，制得淡黃色澄清透明液體，即為產(chǎn)品。
[0028] 實(shí)施例5 殼聚糖溶解在MES中，加入EDC，NHS和R⑶，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，透析3天，冷凍干燥。 其中殼聚糖濃度為2. 5%，殼聚糖與RGD摩爾比為1:10,殼聚糖與EDC摩爾比為1:10, EDC與 NHS摩爾比為10:1。透析液成分為醋酸。RGD接枝率為60%。
[0029] 室溫下，按照以下配方制備溶液： RGD-殼聚糖(重量百分比，相對(duì)分子質(zhì)量10萬(wàn)以上）1% ; 天冬氨酸(重量百分比）〇. 04% ; 余量為純化水。
[0030] 將配置好的溶液靜置24小時(shí)，過(guò)濾去除不溶物，在無(wú)氧條件下，lOkGy鈷-60 γ射 線輻照20分鐘，制得淡黃色澄清透明液體，即為產(chǎn)品。
[0031] 實(shí)施例6 殼聚糖溶解在MES中，加入EDC，NHS和R⑶，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，透析3天，冷凍干燥。 其中殼聚糖濃度為〇. 1%，殼聚糖與RGD摩爾比為1:10,殼聚糖與EDC摩爾比為1:5, EDC與 NHS摩爾比為5:1。透析液成分為蘋(píng)果酸。RGD接枝率為37%。
[0032] 室溫下，按照以下配方制備溶液： RGD-殼聚糖(重量百分比，相對(duì)分子質(zhì)量40萬(wàn)以上）0. 3% ; 抗菌肽D (重量百分比）0.1% ; 余量為純化水。
[0033] 將配置好的溶液靜置24小時(shí)，過(guò)濾去除不溶物，在無(wú)氧條件下，15kGy鈷-60 γ射 線輻照20分鐘，制得淡黃色澄清透明液體，即為產(chǎn)品。
[0034] 實(shí)施例7 殼聚糖溶解在MES中，加入EDC，NHS和R⑶，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，透析3天，冷凍干燥。 其中殼聚糖濃度為1%，殼聚糖與RGD摩爾比為1:5,殼聚糖與EDC摩爾比為10:1，EDC與NHS 摩爾比為10:1。透析液成分為酒石酸。RGD接枝率為28%。
[0035] 室溫下，按照以下配方制備溶液： RGD-殼聚糖(重量百分比，相對(duì)分子質(zhì)量40萬(wàn)以上）0. 5% ; 組氨酸(重量百分比）〇. 2% ; 余量為純化水。
[0036] 將配置好的溶液靜置24小時(shí)，過(guò)濾去除不溶物，在無(wú)氧條件下，25kGy鈷-60 γ射 線輻照20分鐘，制得淡黃色澄清透明液體，即為產(chǎn)品。
[0037] 實(shí)施例8 殼聚糖溶解在MES中，加入EDC，NHS和R⑶，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，透析3天，冷凍干燥。 其中殼聚糖濃度為1%，殼聚糖與RGD摩爾比為1:5,殼聚糖與EDC摩爾比為1:5，EDC與NHS 摩爾比為10:1。透析液成分為鹽酸。RGD接枝率為34%。
[0038] 室溫下，按照以下配方制備溶液： RGD-殼聚糖(重量百分比，相對(duì)分子質(zhì)量60萬(wàn)以上）1. 2% ; 碘(重量百分比）0.06% ; 余量為純化水。
[0039] 將配置好的溶液靜置24小時(shí)，過(guò)濾去除不溶物，在無(wú)氧條件下，15kGy鈷-60 γ射 線輻照20分鐘，制得淡黃色澄清透明液體，即為產(chǎn)品。
[0040] 實(shí)施例9 殼聚糖溶解在MES中，加入EDC，NHS和R⑶，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，透析3天，冷凍干燥。 其中殼聚糖濃度為1%，殼聚糖與RGD摩爾比為1:1，殼聚糖與EDC摩爾比為1:1，EDC與NHS 摩爾比為10:1。透析液成分為稀鹽酸。RGD接枝率為10%。
[0041] 室溫下，按照以下配方制備溶液： RGD-殼聚糖(重量百分比，相對(duì)分子質(zhì)量40萬(wàn)以上）1. 5% ; 血清清蛋白（重量百分比）0.3% ; 余量為純化水。
[0042] 將配置好的溶液靜置24小時(shí)，過(guò)濾去除不溶物，在無(wú)氧條件下，25kGy鈷-60 γ射 線輻照20分鐘，制得淡黃色澄清透明液體，即為產(chǎn)品。
[0043] 實(shí)施例10 殼聚糖溶解在MES中，加入EDC，NHS和R⑶，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，透析3天，冷凍干燥。 其中殼聚糖濃度為〇. 1%，殼聚糖與RGD摩爾比為1:10,殼聚糖與EDC摩爾比為1:5, EDC與 NHS摩爾比為1:1。透析液成分為稀鹽酸。RGD接枝率為35%。
[0044] 室溫下，按照以下配方制備溶液： RGD-殼聚糖(重量百分比，相對(duì)分子質(zhì)量40萬(wàn)以上）0. 2% ; 賴氨酸(重量百分比）〇. 5% ; 余量為純化水。
[0045] 將配置好的溶液靜置24小時(shí)，過(guò)濾去除不溶物，在無(wú)氧條件下，15kGy鈷-60 γ射 線輻照20分鐘，制得淡黃色澄清透明液體，即為產(chǎn)品。
[0046] 體外抑菌實(shí)驗(yàn)及臨床效果 將實(shí)施例1-10所得到的殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料采用懸液法進(jìn)行抑菌效力檢查試驗(yàn)，試 驗(yàn)菌為白色念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，取其3-14代普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂新鮮培養(yǎng)物， 用含l〇g/L蛋白胨的PBS緩沖液制成含菌量為IX 106-2X 106cfu/mL的菌懸液。當(dāng)菌懸液 和殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料為2:1時(shí)，作用10分鐘，白色念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的 抑菌率均達(dá)到99. 99%，當(dāng)菌懸液和殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料為4:1時(shí)，作用10分鐘，白色念珠 菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率均達(dá)到98. 00%。當(dāng)菌懸液和殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料 為8:1時(shí)，作用10分鐘，白色念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率均達(dá)到95. 00%。 (見(jiàn)表1) 表1

【權(quán)利要求】
1. 一種特異性細(xì)胞粘附的殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料，其特征在于，用純水配制分子量調(diào)節(jié) 劑和接枝有含RGD序列的多肽的殼聚糖的溶液，其中所述殼聚糖的分子量為10萬(wàn)以上，通 過(guò)Y射線輻照降解工藝得到的殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料。
2. 權(quán)利要求1的特異性細(xì)胞粘附的殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料，其特征在于，所述殼聚糖接 枝有含RGD序列的多肽，接枝產(chǎn)物的RGD接枝率為10%-60%。
3. 權(quán)利要求1的特異性細(xì)胞粘附的殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料，其特征在于，在接枝的殼聚 糖和分子量調(diào)節(jié)劑的水溶液中所述的殼聚糖的質(zhì)量濃度為〇. 2-3%，所述分子量調(diào)節(jié)劑的質(zhì) 量濃度為〇. 04-0. 2%。
4. 權(quán)利要求1的特異性細(xì)胞粘附的殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料，其特征在于，所述Y射線輻 照降解工藝為無(wú)氧條件下輻照強(qiáng)度10_25kGy的鈷-60 γ射線輻照。
5. 權(quán)利要求1和2的特異性細(xì)胞粘附的殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料，其特征在于，所述的分子 量調(diào)節(jié)劑為碘，氨基酸或蛋白質(zhì)中的一種或多種。
6. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的特異性細(xì)胞粘附的殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料的制備方法：其特 征在于，用純水配制接枝小分子多肽RGD的殼聚糖和分子量調(diào)節(jié)劑的混合溶液，將混合水 溶液通過(guò)Y射線輻照降解工藝制備得到所述特異性細(xì)胞粘附的殼聚糖護(hù)創(chuàng)液體敷料。
7. 權(quán)利要求6的方法，其特征在于，將殼聚糖溶解在2-嗎啉乙磺酸中，加入1-(3-二 甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC)，N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)和R⑶，室溫?cái)嚢?2小 時(shí)，透析3天，透析液為乳酸、醋酸、富馬酸、鹽酸的稀水溶液，冷凍干燥，得到產(chǎn)物接枝有含 RGD序列多肽的殼聚糖。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中殼聚糖濃度為0. 1%-5%，殼聚糖與RGD摩爾比為1:10-1:1， 殼聚糖與EDC摩爾比為1:10-10:1，優(yōu)選1:5-5:1，EDC與NHS摩爾比為1:1-10:1。
9. 權(quán)利要求7的方法，其中2-嗎啉乙磺酸為pH 4. 0-6. 0緩沖溶液的形式。
10. 權(quán)利要求7的方法，其中透析液成分選自乳酸、醋酸、富馬酸和鹽酸。
【文檔編號(hào)】A61L15/46GK104147632SQ201410441042
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月2日
【發(fā)明者】甘少磊, 曹崢, 邵毅, 舒如明 申請(qǐng)人:廣西南寧博恩康生物科技有限公司