一種凹凸棒石摻雜的plga納米纖維氈及其制備和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈及其制備和應(yīng)用，將PLGA溶解在混合溶劑中，得到PLGA靜電紡絲溶液；在攪拌下，將ATT均勻分散在上述PLGA靜電紡絲溶液中，得PLGA/ATT靜電紡絲溶液；采用上述PLGA/ATT靜電紡絲溶液進行靜電紡絲，即得。納米纖維促進間充質(zhì)干細(xì)胞hMSC分化為成骨細(xì)胞。本發(fā)明工藝簡單，產(chǎn)品易得，所用PLGA和ATT成本較低；制備的凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維具有良好的機械性能、血液相容性和生物相容性，在藥物載體、組織工程支架材料等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】—種凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈及其制備和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米纖維氈材料及其制備和應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈及其制備和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]靜電紡絲技術(shù)作為一種新型納米材料的加工方法，具有加工工藝參數(shù)可調(diào)和可控、原料利用率高，纖維收集方式多樣化、實驗重復(fù)性高和易于產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點，制備的靜電紡聚合物納米纖維又具有纖維尺寸可控、極大的比表面積、高孔隙率和三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并可以很好的模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)等特點，使得靜電紡絲技術(shù)及其產(chǎn)品在很多領(lǐng)域內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用。尤其在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域內(nèi)，天然高分子和合成高分子均可作為紡絲原料，通過高分子的共聚、共混等方法及不同的收集方式，制備出性能和結(jié)構(gòu)多樣化的超細(xì)功能纖維，應(yīng)用于組織工程和藥物緩釋等方面，不僅是組織工程纖維材料功能化的一個發(fā)展方向，同時還具有重要科學(xué)價值和巨大的應(yīng)用前景。
[0003]PLGA是一種已經(jīng)被美國食品與藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)使用，具有良好的生物相容性和生物降解性的高分子聚合物。PLGA在人體內(nèi)可以降解，產(chǎn)物能通過人體正常新陳代謝排出體外，因此對人體無毒。而且，PLGA聚合物作為一種優(yōu)良的生物醫(yī)用材料，已被廣泛地應(yīng)用于可植入材料和組織工程用支架材料領(lǐng)域。
[0004]人間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells, hMSC)是一種具有免疫調(diào)控、自我復(fù)制和多向分化潛能的細(xì)胞。在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，hMSC可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞。在連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后，hMSC仍具有上述多向分化潛能，可作為一種修復(fù)損傷、衰老或病變組織的理想種子細(xì)胞。hMSC具有的這些優(yōu)良特性使其被廣泛用于骨組織損傷修復(fù)研究中。靜電紡納米纖維可以很好地模擬細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)ECM，為細(xì)胞的粘附和生長提供良好體外環(huán)境。構(gòu)建基于靜電紡納米纖維和hMSC的納米器件，并將之應(yīng)用于組織工程是當(dāng)前的一個研究熱點。
[0005]凹凸棒石((Attapulgite, ATT)是一種具纖維紋理層鏈狀過渡結(jié)構(gòu)的含水富鎂娃酸鹽粘土礦。凹凸棒石具備許多優(yōu)良的特征，如具有較好的吸附能力、獨特的分散性、耐高溫、抗鹽堿、有較高的可塑性及粘結(jié)力。礦物本身質(zhì)輕、性脆、吸水性強，干燥后收縮小，懸浮液遇電解質(zhì)不絮凝、不沉淀。在生理環(huán)境下，ATT可以被降解為無毒物。ATT在化工涂料、催化齊IJ、污水處理、化妝品、食品添加劑、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。
[0006]目前，埃洛石納米管(halloysite nanotubes)、LAP、輕基磷灰石(hydroxyapatite)、介孔二氧化娃(mesoporous silica)等無機納米粒子都通過靜電紡制備得到聚合物/無機粒子雜化納米纖維，它們具有增強的機械性能、良好的血液相容性和優(yōu)良的生物相容性。但是截止目前，尚沒有文獻報道通過靜電紡絲法制備PLGA/ATT復(fù)合納米纖維，并進一步評價該復(fù)合納米纖維的機械性能、生物活性和血液相容性及其促進間充質(zhì)干細(xì)胞分化的研究報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈及其制備和應(yīng)用，本發(fā)明工藝簡單，所用PLGA和ATTA成本低，原料易得，可用于工業(yè)化生產(chǎn)；PLGA/ATT復(fù)合納米纖維氈能夠在沒有任何其他誘導(dǎo)因子的情況下有效的促進hMSC的成骨分化。
[0008]本發(fā)明的一種凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈，所述納米纖維氈由凹凸棒石ATT分散在聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA溶液中，進行靜電紡絲制備得到，其中ATT與PLGA的質(zhì)量比為1-3:100。
[0009]本發(fā)明的一種凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈的制備方法，包括:
[0010](1)將PLGA溶解在溶劑中，攪拌使PLGA完全溶解，得到PLGA靜電紡絲溶液；其中PLGA和溶劑的質(zhì)量體積比為lg:4-5mL ；
[0011](2)攪拌條件下，將凹凸棒石ATT均勻分散在PLGA靜電紡絲溶液中，得到PLGA/ATT靜電紡絲溶液，然后進行靜電紡絲，干燥，即得。
[0012]所述步驟(1)中溶劑為THF/DMF混合溶劑，其中THF和DMF的體積比為3:1。
[0013]所述步驟(1)中攪拌時間為8_12h。
[0014]所述步驟(2)中攪拌為磁力攪拌，速率為200-300r/min，時間為20_30min。
[0015]所述步驟(2)中靜電紡絲工藝參數(shù)為電壓18-22kV、流速0.8-1.0mL/h、接收距離15_20cmo
[0016]所述步驟(2)中干燥為真空干燥，其中真空干燥的時間為24 - 48h。
[0017]本發(fā)明的一種凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈的應(yīng)用，所述凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈促進間充質(zhì)干細(xì)胞hMSC分化為成骨細(xì)胞。
[0018]所述間充質(zhì)干細(xì)胞hMSC為人臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。將凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈上利用生長或誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞hMSC 14或21天，然后取14或21天時的培養(yǎng)液并將hMSC細(xì)胞裂解，評估間充質(zhì)干細(xì)胞hMSC分化為成骨細(xì)胞的能力。
[0019]將PLGA和PLGA/ATT放入24孔培養(yǎng)板，用生長或誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)hMSC14天或21天，取14天或21天時的培養(yǎng)液并將hMSC細(xì)胞裂解；
[0020]取上述裂解液測定每孔hMSC的總蛋白含量；
[0021 ] 取上述裂解液測定hMSC的堿性磷酸酶ALP活性評估hMSC在不同情況下分化為成骨細(xì)胞的能力；
[0022]取上述14天或21天時的培養(yǎng)液測定hMSC分泌的骨鈣素的含量評估hMSC在不同情況下分化為成骨細(xì)胞的能力；
[0023]取上述裂解液測定hMSC的鈣離子的含量評估hMSC在不同情況下分化為成骨細(xì)胞的能力；
[0024]利用von-Kossa染色法定性的評估hMSC在不同情況下分化為成骨細(xì)胞的能力。
[0025]所述的取14天或21天培養(yǎng)液為在hMSC培養(yǎng)的第13天或20天棄掉原先的培養(yǎng)液，重新加入的不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，并培養(yǎng)24h。
[0026]所述生長培養(yǎng)基為純DMEM培養(yǎng)基，添加10%的FBS，1 %的青霉素/鏈霉素，1 %的5mg/mL的抗壞血酸溶液,1 %的Imol/mL的β -甘油磷酸酯溶液。
[0027]所述生長培養(yǎng)基為純DMEM培養(yǎng)基，添加10%的FBS，1 %的青霉素/鏈霉素，1 %的5mg/mL的抗壞血酸(溶于PBS溶液)，1 %的Imol/mL的β -甘油磷酸酯溶液(溶于PBS溶液)。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為純DMEM培養(yǎng)基，添加10%的FBS，1 %的青霉素/鏈霉素，1 %的5mg/mL的抗壞血酸(溶于PBS溶液)，1 %的Imol/mL的β -甘油磷酸酯溶液(溶于PBS溶液)，1 %的10_5Μ的地塞米松(誘導(dǎo)劑)。
[0028]本發(fā)明操作簡便易行，產(chǎn)品易得，原材料成本低，且均具有良好的生物相容性，制備的PLGA/ATT復(fù)合納米纖維氈在藥物載體、組織工程支架材料等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前旦-5^ ο
[0029]本發(fā)明使用掃描電子顯微鏡(SEM)、熱重分析法(TGA)、機械性能測試等表征手段驗證本發(fā)明方法的可行性。此外,本發(fā)明還對材料的親水性、生物相容性、血液相容性和促進人間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力等特性進行了評價。具體測試結(jié)果如下:
[0030](1)掃描電子顯微鏡(SEM)的測試結(jié)果
[0031]SEM觀察顯示(見附圖1所示)，本發(fā)明制備的PLGA、PLGA/1% ATT,PLGA/2% ATT和PLGA/3% ATT納米纖維形貌規(guī)則、表面規(guī)整，纖維直徑分別為1308±296nm、909± 185nm、560± 117nm和483± 133nm。很明顯，當(dāng)一定量的ATT納米粒子摻雜于PLGA紡絲液中時，在同樣的紡絲條件下，所得納米纖維的直徑有所降低，主要是因摻雜ATT納米粒子引起PLGA紡絲液性質(zhì)(如電導(dǎo)率、表面張力以及粘度等)變化而致。
[0032](2)TGA的測試結(jié)果
[0033]附圖2 所示為 PLGA、PLGA/1 % ATT、PLGA/2 % ATT 和 PLGA/3 % ATT 納米纖維氈的TGA曲線。從附圖2可以看出，很明顯，當(dāng)處理溫度達到600°C時，納米纖維中有機成分(PLGA)已被完全灼燒(殘留質(zhì)量為0);而ATT基本上沒有改變(殘留質(zhì)量為98.7wt.% )。PLGA/lwt.% LAP、PLGA/2wt.% LAP和PLGA/3wt.% LAP復(fù)合納米纖維的殘留質(zhì)量分別為0.98wt.%,1.87wt.3.17wt.%，這些殘留量和紡絲液中添加的ATT近似。
[0034](3)機械性能測試結(jié)果
[0035]附圖3 為 PLGA、PLGA/1 % ATT、PLGA/2 % ATT 和 PLGA/3 % ATT 納米纖維氈的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。從附圖3可以看出，復(fù)合納米纖維氈的斷裂強度隨著ATT含量的增加而提高，這說明摻雜的ATT可以提高纖維的斷裂強度。
[0036](4)接觸角測試結(jié)果
[0037]附圖4 為 PLGA、PLGA/1 % ATT、PLGA/2 % ATT 和 PLGA/3 % ATT 納米纖維氈的接觸角測試圖。由于ATT是一種親水性材料，因此，蒸餾水在PLGA/1 % ATT、PLGA/2 % ATT和PLGA/3 % ATT納米纖維氈表面的接觸角較PLGA納米纖維氈均有一定程度的降低，這說明ATT摻雜于PLGA纖維中能夠一定程度上提高PLGA納米纖維氈的親水性，因而，PLGA/ATT納米纖維氈在組織工程支架材料等領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用前景。
[0038](5)不同種類納米纖維氈溶血效果比較
[0039]本發(fā)明通過溶血和抗凝血實驗評價PLGA、PLGA/ATT納米纖維氈的血液相容性。附圖5為溶血試驗后PBS中血紅蛋白的含量。分析附圖5可知，人紅細(xì)胞與各實驗濃度下的材料共培養(yǎng)2h并經(jīng)離心后，上清液中血紅蛋白的含量與對照組(蒸餾水)相比均存在著顯著性差異(#ρ〈0.01)，表明 PLGA、PLGA/1% ATT、PLGA/2 % ATT、PLGA/3 % ATT 均未發(fā)生溶血現(xiàn)象。
[0040](6)不同種類納米纖維氈抗凝血效果比較
[0041]本發(fā)明制備的PLGA、PLGA/1 % ATT、PLGA/2 % ATT 和 PLGA/3% ATT 納米纖維氈除了具備不溶血性能之外，還可以在有促凝劑存在的情況下阻止血液的凝固。附圖6是對PLGA/1 % ATT,PLGA/2% ATT和PLGA/3 % ATT納米纖維氈抗凝血性能的評價結(jié)果，對照組為蓋玻片。附圖6給出了經(jīng)處理不同時間(5、10、20、40和6011^11)后的血液溶于蒸餾水后血紅蛋白的含量(用541nm處的0D值表示，此0D值與血紅蛋白含量正相關(guān))，血紅蛋白的含量越高說明血液凝固現(xiàn)象越不明顯，則材料阻止凝血凝固的能力越強。分析附圖6可知，在設(shè)定的時間段，實驗組血紅蛋白的含量均高于對照組，這說明PLGA、PLGA/1% ATT、PLGA/3 %ATT和PLGA/5% ATT納米纖維氈均可以在一定程度上抑制血液的凝固。
[0042](7)不同種類納米纖維氈的生物相容性評價
[0043]附圖7 和 8 為對 PLGA、PLGA/1 % ATT、PLGA/2 % ATT 和 PLGA/3 % ATT 納米纖維氈的生物相容性的評價結(jié)果。如附圖7所示，hMSC在PLGA、PLGA/1% ATT、PLGA/2 % ATT和PLGA/3 % ATT納米纖維氈表面具有良好的粘附和增殖活力，說明人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞可以在上述材料表面正常地粘附和分裂。通過第3天細(xì)胞的增殖可以發(fā)現(xiàn)，hMSC細(xì)胞在PLGA/ATT納米纖維表面的增殖情況與TCP相比具有顯著性差異(p〈0.05)，證明了 PLGA/1% ATT、PLGA/2 % ATT和PLGA/3% ATT納米纖維氈具有良好的生物相容性。
[0044]附圖8 為經(jīng) 2.5%戊二醛溶液固定 1-3 小時后(a)PLGA、(b)PLGA/1 % ATT, (c)PLGA/2 % ATT和(d) PLGA/3 % ATT納米纖維氈表面的hMSC細(xì)胞粘附的SEM圖，(e) PLGA、(f) PLGA/1% ATT、(g) PLGA/2 % ATT 和(h) PLGA/3 % ATT 納米纖維氈表面的 hMSC 細(xì)胞增值的SEM圖。從細(xì)胞的SEM圖片可以看出，hMSC細(xì)胞可以很好地在各組納米纖維表面粘附以及增殖，進一步證實本發(fā)明報道的納米纖維具有良好的細(xì)胞相容性。
[0045]⑶PLGA/ATT納米纖維氈促進人間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力的評價
[0046]本發(fā)明通過測定在生長或誘導(dǎo)培養(yǎng)基中hMSC分泌的ALP活性、hMSC分泌的骨鈣素和|丐離子的含量以及利用von-Kossa染色法和ALP染色法實驗綜合評估了 hMSC在不同情況下分化為成骨細(xì)胞的能力。附圖9、10、11、12為PLGA/ATT納米纖維氈促進hMSC分化能力的評價結(jié)果。
[0047]ALP是hMSC成骨分化的早期標(biāo)志，如附圖9所示，生長培養(yǎng)基中，在PLGA/ATT復(fù)合納米纖維氈上培養(yǎng)21天的hMSC的ALP活性明顯高于PLGA組和TCP組(P〈0.05)，接近于21天的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的TCP組，說明PLGA/ATT復(fù)合納米纖維氈在無任何其他誘導(dǎo)劑的情況下可以促進hMSC的成骨分化。
[0048]骨鈣素是hMSC成骨分化的后期分泌物，骨鈣素分泌物含量測試結(jié)果如附圖10所示，無論是生長培養(yǎng)基還是誘導(dǎo)培養(yǎng)基在第14天都表現(xiàn)出很低的骨鈣素分泌量，而在21天誘導(dǎo)培養(yǎng)基當(dāng)中，無論是TCP組、PLGA組還是PLGA/ATT組都呈現(xiàn)出很高的骨鈣素分泌量，而在生長培養(yǎng)基當(dāng)中，只有PLGA/ATT組表現(xiàn)出很高的骨鈣素分泌量，與TCP組和PLGA組均存在顯著性差異(P〈0.05)。骨鈣素分泌量的結(jié)果進一步確定了 PLGA/ATT可以促進hMSC的成骨分化。
[0049]鈣離子含量的高低是hMSC成骨分化程度的重要標(biāo)志。鈣離子含量檢測結(jié)果如附圖11所示，在第21天，誘導(dǎo)培養(yǎng)基當(dāng)中TCP組、PLGA組和PLGA/ATT組鈣離子含量均明顯高于同等條件下的第14天(p〈0.05)，而在生長培養(yǎng)基當(dāng)中從14到21天的鈣離子含量只有PLGA/ATT組有明顯增長(p〈0.01)，21天生長培養(yǎng)基PLGA/ATT組的鈣離子含量與TCP組和PLGA組均存在顯著性差異(p〈0.05)，鈣離子含量檢測結(jié)果也證明PLGA/ATT可以促進hMSC的成骨分化。
[0050]附圖12為Von Kossa染色的照片，結(jié)果表明生長培養(yǎng)基PLGA/ATT組產(chǎn)生大量的鈣的磷酸鹽，進一步定性的證明PLGA/ATT能夠促進hMSC的成骨分化。
[0051]有益效果
[0052](1)本發(fā)明工藝簡單，所用PLGA和ATT成本低，原料易得，可用于工業(yè)生產(chǎn)；
[0053](2)本發(fā)明方法制備的PLGA/ATT復(fù)合納米纖維氈能夠在沒有任何其他誘導(dǎo)因子的情況下有效的促進hMSC的成骨分化；
[0054](3)本發(fā)明方法制備的PLGA/ATT復(fù)合納米纖維氈具有良好的機械性能、血液相容性和生物相容性，因而在藥物載體、組織工程支架材料等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0055]圖1 為本發(fā)明涉及的(a)PLGA、(b) PLGA/1 % ATT, (c) PLGA/2 % ATT 和(d) PLGA/3 %ATT納米纖維氈的SEM圖及其對應(yīng)的納米纖維的直徑分布圖；
[0056]圖2 為本發(fā)明涉及的 PLGA、PLGA/1 % ATT、PLGA/2 % ATT 和 PLGA/3% ATT 納米纖維氈的TGA曲線；
[0057]圖3 為本發(fā)明涉及的 PLGA、PLGA/1 % ATT、PLGA/2 % ATT 和 PLGA/3% ATT 納米纖維氈的應(yīng)力應(yīng)變曲線；
[0058]圖4 為本發(fā)明涉及的 PLGA、PLGA/1 % ATT、PLGA/2 % ATT 和 PLGA/3% ATT 納米纖維氈的接觸角測試圖片；其中(a)、(b)、(c)、(d)分別為:PLGA,PLGA/1% ATT,PLGA/2 % ATT和PLGA/3 % ATT納米纖維氈的接觸角測試結(jié)果；
[0059]圖5 為本發(fā)明涉及的 PLGA、PLGA/1% ATT,PLGA/32% ATT 和 PLGA/3% ATT 納米纖維氈的溶血測試結(jié)果；其中插圖為人血紅細(xì)胞分別在H20、PBS、PLGA(1)、PLGA/1% ATT (2)、PLGA/2 % ATT (3)和PLGA/3 % ATT (4)溶液中孵育2h離心后的照片；
[0060]圖6 為本發(fā)明涉及的 PLGA、PLGA/1 % ATT,PLGA/32% ATT 和 PLGA/3% ATT 納米纖維氈的抗凝血測試結(jié)果；
[0061]圖7 為本發(fā)明涉及的 PLGA、PLGA/1% ATT, PLGA/2 % ATT 和 PLGA/3% ATT 納米纖維氈對hMSC細(xì)胞粘附活力和增殖活力影響的測試結(jié)果；
[0062]圖8 為 hMSC 細(xì)胞在(a) PLGA、(b) PLGA/1 % ATT、(c) PLGA/2 % ATT 和(d) PLGA/3 %ATT納米纖維氈表面培養(yǎng)8小時細(xì)胞粘附的形態(tài)；(e)PLGA、(f) PLGA/1 % ATT, (g) PLGA/2 %ATT和(h) PLGA/3 % ATT納米纖維氈表面培養(yǎng)3天細(xì)胞增殖的形態(tài)；
[0063]圖9為本發(fā)明涉及的PLGA和PLGA/3% ATT納米纖維氈影響hMSC分化的ALP活性測試結(jié)果；
[0064]圖10為本發(fā)明涉及的PLGA和PLGA/3% ATT納米纖維氈影響hMSC分化的骨鈣素分泌量測試結(jié)果；
[0065]圖11為本發(fā)明涉及的PLGA和PLGA/3% ATT納米纖維氈影響hMSC分化的鈣離子含量測試結(jié)果；
[0066]圖12為本發(fā)明涉及的PLGA和PLGA/3 % ATT納米纖維氈影響hMSC分化的VonKossa染色結(jié)果。

【具體實施方式】
[0067]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0068]實施例1
[0069]取4份各0.8g PLGA，分別與2.4mL THF和0.8mL DMF混合，室溫下攪拌8h，待PLGA完全溶解。分別向第2、3和4份PLGA溶液中加入8mg、16mg和24mg ATT粉末。使用磁力攪拌20min，攪拌速率為200r/min，得到PLGA及PLGA/ATT紡絲液。通過靜電紡絲法制備PLGA,PLGA/1% ATT,PLGA/2% ATT和PLGA/3 % ATT納米纖維氈。其中，接收距離為15cm電壓為20kV流速為0.8mL/h，制備的復(fù)合納米纖維氈在真空置干燥箱內(nèi)干燥48h以除去殘留的水分和溶劑。
[0070]SEM 觀察結(jié)果顯示，所得到的 PLGA、PLGA/1 % ATT、PLGA/2 % ATT 和 PLGA/3 % ATT納米纖維形貌規(guī)則、表面規(guī)整，纖維直徑分別為1308 ± 296nm、909 ± 185nm、560 ± 117nm和483±133nm(見附圖1)。比較四種不同纖維的直徑可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一定量的ATT納米粒子摻雜于PLGA紡絲液中時，在同樣的紡絲條件下，所得納米纖維的直徑有所降低，主要是因摻雜ATT納米粒子引起PLGA紡絲液性質(zhì)(如電導(dǎo)率、表面張力以及粘度等)變化而致。
[0071]實施例2
[0072]分別稱取一定質(zhì)量(5mg左右)的實施例1中制備的PLGA、PLGA/1% ATT、PLGA/2%ATT和PLGA/3% ATT納米纖維氈進行TGA測試，附圖2所示為PLGA、PLGA/1 % ATT、PLGA/2%ATT和PLGA/3% ATT納米纖維氈的TGA曲線。從圖2可以看出，很明顯，當(dāng)處理溫度達到600°C時，納米纖維中有機成分(PLGA)已被完全灼燒(殘留質(zhì)量為0);而ATT基本上沒有改變(殘留質(zhì)量為 98.7wt.% )。PLGA/lwt.% LAP、PLGA/2wt.% LAP 和 PLGA/3wt.% LAP復(fù)合納米纖維的殘留質(zhì)量分別為0.98wt.%, 1.87wt.%和3.17wt.這些殘留量和紡絲液中添加的ATT近似。
[0073]實施例3
[0074]將實施例1 中制備的 PLGA、PLGA/1 % ATT、PLGA/2 % ATT 和 PLGA/3 % ATT 納米纖維氈剪成lcmX5cm的長條，每個樣品取3個平行樣。用千分尺測量每條纖維氈的3個不同位置的厚度，求平均值做為每個樣品的厚度。用萬能材料測試機測試?yán)w維氈的機械性能，得出應(yīng)力-應(yīng)變曲線(見附圖3)。從應(yīng)力-應(yīng)變曲線可以看出，一定量的ATT摻雜于PLGA纖維后，可以明顯地提高PLGA納米纖維的斷裂強度。
[0075]實施例4
[0076]將實施例1 中制備的 PLGA、PLGA/1 % ATT、PLGA/2 % ATT 和 PLGA/3 % ATT 納米纖維氈剪成lcmXlcm的正方形小塊，每個樣品取3個平行樣。使用研究型接觸角測量儀DSA30測試不同納米纖維氈的水接觸角。很明顯，蒸餾水在PLGA/1% ATT、PLGA/2 % ATT和PLGA/3 % ATT納米纖維氈表面的接觸角較PLGA納米纖維氈均有一定程度的降低，這說明ATT摻雜于PLGA纖維中能夠一定程度上提高PLGA納米纖維氈的親水性(見附圖4)。
[0077]實施例5
[0078]取肝素鋰穩(wěn)定的健康成年人全血5mL,離心3min (轉(zhuǎn)速為3000r/min),用PBS洗漆沉淀3次，得血紅細(xì)胞。用PBS按照1:100的比例配置成人血紅細(xì)胞懸濁液，于4°C冰箱中備用。
[0079]分別稱取一定質(zhì)量(5mg左右)的實施例1中制備的PLGA、PLGA/1% ATT、PLGA/2%ATT和PLGA/3 % ATT納米纖維氈，每種材料取3個平行樣。然后，按照纖維氈質(zhì)量:人血紅細(xì)胞懸濁液體積之比為2mg: lmL將不同的纖維氈浸入人血紅細(xì)胞懸濁液(對照組設(shè)置0.3mL人血紅細(xì)胞懸濁液溶于1.2mLPBS中，以及0.3mL人血紅細(xì)胞懸濁液溶于1.2mL蒸餾水中)，并在37°C環(huán)境下孵育2h。然后，取出纖維氈，并將浸泡過纖維氈的人血紅細(xì)胞懸濁液離心lmin (lOOOrpm),取上清液并用Lambda 25型紫外分光光度計測試上清液在540nm處的吸光值，以評價材料的溶血性。實驗結(jié)果表明PLGA、PLGA/1% ATT, PLGA/2 % ATT, PLGA/3 % ATT均未發(fā)生溶血現(xiàn)象(見附圖5)。
[0080]實施例6
[0081]將實施例1 中制備的 PLGA、PLGA/1 % ATT、PLGA/2 % ATT 和 PLGA/3 % ATT 納米纖維氈剪成lcmX lcm的正方形小塊，每個樣品取3個平行樣(對照組為:直徑1.8mm的蓋玻片)。將試驗組和對照組置于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。然后，向每孔中纖維氈以及對照組蓋玻片上滴加20 μ L實施例6中準(zhǔn)備的健康成年人全血，同時加10 μ LCaCl2溶液(0.2mol/L)，置于37°C環(huán)境下孵育不同的時間。在每個培養(yǎng)時間結(jié)束后，向每孔加5mL蒸餾水并孵育5分鐘，然后用Lamada 25型紫外分光光度計測試溶液在540nm處的吸光值，以評價材料的抗凝血性。實驗結(jié)果表明PLGA、PLGA/1% ATT, PLGA/2 % ATT和PLGA/3% ATT納米纖維氈均可以在一定程度上抑制血液的凝固(見附圖6)。
[0082]實施例7
[0083]將實施例1 中制備的 PLGA、PLGA/1 % ATT、PLGA/2 % ATT 和 PLGA/3 % ATT 納米纖維氈剪成2cmX 2cm小塊，鋪展在直徑1.8cm的蓋玻片上并置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。對鋪在蓋玻片上的纖維進行紫外線殺菌并用DMEMa -12培養(yǎng)基浸泡12h，然后每孔補充400 μ L培養(yǎng)基并接種2Χ104個hMSC細(xì)胞。每塊培養(yǎng)板設(shè)置不同的培養(yǎng)時間(8h和3d)。在每個培養(yǎng)時間結(jié)束后，向培養(yǎng)孔中加入40 μ L ΜΤΤ，繼續(xù)培養(yǎng)4h，使活細(xì)胞與MTT完全作用生成MTT甲瓚晶體。棄去每孔中的培養(yǎng)基，補加400 μ L DMS0，將ΜΤΤ甲瓚晶體完全溶解并記錄570nm處的0D值，分析不同培養(yǎng)時間下，細(xì)胞在納米纖維表面的粘附或增殖情況，評價PLGA, PLGA/1 % ATT, PLGA/2 % ATT和PLGA/3 % ATT納米纖維氈對細(xì)胞粘附和增殖的影響。
[0084]hMSC 細(xì)胞在 PLGA、PLGA/1 % ATT、PLGA/2 % ATT 和 PLGA/3 % ATT 納米纖維氈表面的粘附和增殖活力，說明人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞可以在上述材料表面正常地粘附和分化。通過比較第3天細(xì)胞的增殖(見附圖7)可以發(fā)現(xiàn)，hMSC細(xì)胞在PLGA/ATT納米纖維表面的增殖情況與純TCP相比具有顯著性差異(p〈0.05)，進一步證明了 PLGA/1% ATT、PLGA/2 %ATT和PLGA/3% ATT納米纖維氈具有良好的細(xì)胞相容性。
[0085]實施例8
[0086]將實施例8中培養(yǎng)8小時和3天的hMSC細(xì)胞用PBS緩沖溶液洗滌3遍，并用2.5%的戊二醛溶液固定2h。然后，將上述固定的hMSC細(xì)胞用梯度酒精(30^^50^^70^^80?^90%、95%和100% )依次進行脫水處理，每次處理lOmin，酒精用量為lmL。將處理完畢的hMSC細(xì)胞自然干燥后，通過SEM觀察納米纖維表面的細(xì)胞形貌(見附圖8)。結(jié)果表明，hMSC細(xì)胞可以很好地在各組納米纖維表面粘附以及增殖，進一步證實本發(fā)明報道的納米纖維具有良好的生物相容性。
[0087]實施例9
[0088]將實施例1中制備的PLGA和PLGA/3% ATT納米纖維氈剪成2cmX 2cm小塊，鋪展在直徑1.8cm的蓋玻片上并置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。對鋪在蓋玻片上的纖維進行紫外線殺菌并用DMEMa -12培養(yǎng)基浸泡12h，然后吸去原來的培養(yǎng)基，每孔新加1000 μ L生長培養(yǎng)基(純DMEM培養(yǎng)基，添加10%的FBS，1 %的青霉素/鏈霉素，1 %的5mg/mL的抗壞血酸(溶于PBS溶液)，1 %的Imol/mL的β -甘油磷酸酯溶液(溶于PBS溶液))或誘導(dǎo)培養(yǎng)基(純DMEM培養(yǎng)基，添加10%的FBS，1 %的青霉素/鏈霉素，1 %的5mg/mL的抗壞血酸(溶于PBS溶液)，1 %的Imol/mL的β -甘油磷酸酯溶液(溶于PBS溶液)，1 %的10-5Μ的地塞米松(誘導(dǎo)劑))，并接種2 X 104個hMSC細(xì)胞。每三天更換一次相應(yīng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天或21天。
[0089]經(jīng)過14天或21天的培養(yǎng)后,將上述各孔中細(xì)胞用Reporter LysisBuffer細(xì)胞裂解液裂解，裂解方法按照Importer Lysis Buffer裂解液說明書方法進行。裂解完畢后，取裂解液按照ALKALINE PHOSPHATASE ACTIVITY說明書測試每孔ALP活性。
[0090]取上述裂解液按照BCA蛋白試劑盒說明書測試每孔中總蛋白的含量。因此可以計算單位蛋白的ALP活性。實驗結(jié)果表明PLGA/ATT能夠促進hMSC的成骨分化(見附圖9)。
[0091]實施例10
[0092]利用人骨1丐素試劑盒(Intact Human Osteocalcin EIA Kit)測定經(jīng)過14天和21天的培養(yǎng)后各孔中hMSC分泌骨鈣素的量。由于FBS會干擾骨鈣素含量的測定，故hMSC需要預(yù)先在不含F(xiàn)BS的生長或誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，分別將每孔中的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，根據(jù)人骨鈣素試劑盒說明書提供的操作步驟測試各組hMSC分泌的骨鈣素含量。實驗結(jié)果表明，無論是生長培養(yǎng)基還是誘導(dǎo)培養(yǎng)基在第14天都表現(xiàn)出很低的骨鈣素分泌量，而在21天誘導(dǎo)培養(yǎng)基當(dāng)中，無論是TCP組、PLGA組還是PLGA/ATT組都呈現(xiàn)出很高的骨鈣素分泌量，而在生長培養(yǎng)基當(dāng)中，只有PLGA/ATT組表現(xiàn)出很高的骨鈣素分泌量，與TCP組和PLGA組均存在顯著性差異(p〈0.05)。骨鈣素分泌量的結(jié)果進一步確定了PLGA/ATT可以促進hMSC的成骨分化(見附圖10)。
[0093]實施例11
[0094]取實施例9中細(xì)胞裂解液用QuantiChrom I丐離子濃度試劑盒測定了經(jīng)過14天或21天培養(yǎng)后hMSC的鈣離子濃度。測試方法按照說明書進行。實驗結(jié)果表明，在第21天，誘導(dǎo)培養(yǎng)基當(dāng)中TCP組、PLGA組和PLGA/ATT組鈣離子含量均明顯高于同等條件下的第14天(p〈0.05)，而在生長培養(yǎng)基當(dāng)中從14天到21天的鈣離子含量只有PLGA/ATT組有明顯增長(p〈0.01),21天生長培養(yǎng)基PLGA/ATT組的鈣離子含量與TCP組和PLGA組均存在顯著性差異(p〈0.05)(見附圖11)，鈣離子含量檢測結(jié)果也證明PLGA/ATT可以促進hMSC的成骨分化。
[0095]實施例12
[0096]將實施例9中培養(yǎng)21天的hMSC利用3.7%的甲醛(溶劑為PBS溶液)在4°C條件下固定2小時然后用PBS溶液清洗除去殘留的甲醛。通過von Kossa染色法觀察了鈣化情況，首先用2.5%硝酸銀處理(每孔300 μ L)，同時置于紫外光下60min，用去離子水潤洗3次，然后用5%的硫代硫酸鈉溶液(每孔300yL)繼續(xù)處理3min。最后，將硫代硫酸鈉洗滌干凈后，使用數(shù)碼相機對染色后的纖維樣品拍照。實驗結(jié)果(見附圖12)表明，生長培養(yǎng)基PLGA/ATT組產(chǎn)生大量的鈣的磷酸鹽，進一步定性的證明PLGA/ATT能夠促進hMSC的成骨分化。
【權(quán)利要求】
1.一種凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈，其特征在于:所述納米纖維氈由凹凸棒石ATT分散在聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA溶液中，進行靜電紡絲制備得到，其中ATT與PLGA的質(zhì)量比為1-3:100。
2.—種凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈的制備方法，包括: (1)將PLGA溶解在溶劑中，攪拌使PLGA完全溶解，得到PLGA靜電紡絲溶液；其中PLGA和溶劑的質(zhì)量體積比為lg:4-5mL ； (2)攪拌條件下，將凹凸棒石ATT均勻分散在PLGA靜電紡絲溶液中，得到PLGA/ATT靜電紡絲溶液，然后進行靜電紡絲，干燥，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈的制備方法，其特征在于:所述步驟⑴中溶劑為THF/DMF混合溶劑，其中THF和DMF的體積比為3:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中攪拌時間為8-12h。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中攪拌為磁力攪拌，速率為200-300r/min，時間為20_30min。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中靜電紡絲工藝參數(shù)為電壓18-22kV、流速0.8-1.0mL/h、接收距離15_20cmo
7.—種如權(quán)利要求1所述的凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈的應(yīng)用，其特征在于:所述凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈促進間充質(zhì)干細(xì)胞hMSC分化為成骨細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈的應(yīng)用，其特征在于:將凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈上利用生長或誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞hMSC 14或21天，然后取14或21天時的培養(yǎng)液并將hMSC細(xì)胞裂解，評估間充質(zhì)干細(xì)胞hMSC分化為成骨細(xì)胞的能力。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈的應(yīng)用，其特征在于:所述生長培養(yǎng)基為純DMEM培養(yǎng)基，添加10%的FBS，I %的青霉素/鏈霉素，I %的5mg/mL的抗壞血酸溶液，I %的Imol/mL的β -甘油磷酸酯溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種凹凸棒石摻雜的PLGA納米纖維氈的應(yīng)用，其特征在于:所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為純DMEM培養(yǎng)基，添加10 %的FBS，I %的青霉素/鏈霉素，I %的5mg/mL的抗壞血酸，I %的Imol/mL的β -甘油磷酸酯溶液，I %的1(Γ5Μ的地塞米松。
【文檔編號】A61L27/44GK104258464SQ201410432309
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月28日
【發(fā)明者】史向陽, 王哲, 趙毅麗 申請人:東華大學(xué)