一種用于活體光聲成像的核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種核酸納米結(jié)構(gòu)載體，包含其的核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物及它們的制備方法和應(yīng)用。所述核酸納米結(jié)構(gòu)是通過DNA折紙技術(shù)構(gòu)建的任意二維和/或三維納米結(jié)構(gòu)，所述貴金屬光敏成分為表面進行DNA修飾的金納米棒、金納米殼、表面包銀的金納米棒，金納米籠中的一種或至少兩種的混合物。所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物作為光聲成像探針不但能夠保證其偶聯(lián)的光聲學(xué)造影劑的吸收對比增強效果，而且能夠顯著增加其對于腫瘤的靶向性，使其偶聯(lián)的貴金屬光敏成分在腫瘤組織內(nèi)部富集，極大的改善普通光聲造影劑全身分布或僅停留在腫瘤表面的缺陷。其制備方法工藝簡單、成本低且方便易行。
【專利說明】一種用于活體光聲成像的核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于光聲成像領(lǐng)域，涉及一種核酸納米結(jié)構(gòu)載體，包含其的核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物及它們的制備方法和應(yīng)用，具體而言，本發(fā)明涉及一種用于活體光聲成像的核酸納米結(jié)構(gòu)載體，包含其的核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物及它們的制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤是一種嚴(yán)重危害人類健康的重要疾病。面對全球腫瘤發(fā)生率和死亡率的不斷攀升，以及目前診斷和治療方法的局限性，發(fā)展高效低毒的診療一體化方案已成為迫在眉睫的重大課題。如何有效的運輸分子影像試劑進行腫瘤的早期檢測和切除術(shù)中導(dǎo)航，如何實現(xiàn)檢測與治療一體化，是現(xiàn)今癌癥研究中的熱點問題。
[0003]物體在周期性變化的光照下，因受熱膨脹而產(chǎn)生超聲波的現(xiàn)象被稱作光聲效應(yīng)(Photoacoustic effect)。利用位于組織體表面的超聲探測元件接收該超聲信號，依據(jù)光聲信號重建組織內(nèi)二維或三維光吸收分布圖像，從而進行成像的方法被稱為光聲成像(Photoacoustic imaging)。光聲成像很好的結(jié)合了光學(xué)和超聲成像兩種技術(shù)的優(yōu)點，獲得了更好的成像深度及分辨率，同時更加安全。該技術(shù)將帶來更加早期和有效的腫瘤臨床檢測方法。
[0004]貴金屬納米材料(nobel metal nano-materials)是由其光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)而引起廣泛關(guān)注的一類光敏造影劑。如金納米棒(gold nanorods, GNRs)近紅外區(qū)域具有良好的等離子共振效應(yīng)(Surface Plasmon Resonance, SPR),而其縱向的等離子共振峰(LSPR)使得金納米棒很容易被與其LSPR峰波長相近的近紅外光誘導(dǎo)而產(chǎn)生熱量(Adv Mater, 2012，24 (36):4811-41.);利用其LSPR峰波長相近的雙光子激光進行激發(fā)則產(chǎn)生明顯的雙光子熒光(Proc Natl Acad Sci U S A, 2005，102 (44): 15752-6.)和光聲信號(Optics Express 2008,16(23):18605-18615 ；Journal of appliedphysics, 2007, 102(6):064701.)，可被用作活體成像的造影劑。
[0005]應(yīng)用納米技術(shù)發(fā)展針對惡性腫瘤的檢測系統(tǒng)是有效解決上述問題的關(guān)鍵。自上世紀(jì)開始，研究者利用納米技術(shù)對于惡性腫瘤的診斷和治療進行系統(tǒng)研究。目前已有大量納米載體成功用于藥物運輸和抗腫瘤研究與治療之中，如美國FDA批準(zhǔn)的脂質(zhì)體內(nèi)包阿霉素(Doxorubicin)和聚乙二醇(PEG)干擾素-a 2a (Pegasys) (Nature Reviews DrugDiscovery, 2010, 9, 615-627 ；Nature Reviews Drug Discovery, 2005, 4, 145 - 160 ；J.DrugTarget.2006，14，301 - 310 ；Nature Review Cancer 2006，6，688 - 701.)。同時利用納米顆粒裝載熒光試劑進行手術(shù)導(dǎo)航的臨床前研究也有較大進展。雖然基于納米技術(shù)，已有很多運載系統(tǒng)成功應(yīng)用的先例，但在多模態(tài)手術(shù)導(dǎo)航探針、集檢測和治療于一體的多功能抗腫瘤探針等研究領(lǐng)域仍然存在許多關(guān)鍵問題尚未解決。此外，當(dāng)今研究較為充分的納米粒子藥物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，如脂質(zhì)體和高分子材料，其形狀和粒徑分布范圍較寬，從而影響載體進入細(xì)胞的效率；或如金屬納米粒子，雖然粒徑和形狀容易控制，但在材料上存在潛在生物安全性隱患，妨礙臨床研究的進一步應(yīng)用。綜上所述，要更加有效的進行惡性腫瘤的診斷和治療，急需解決的核心問題之一是如何構(gòu)建一系列微納米結(jié)構(gòu)使其滿足高效、靶向可控、安全的需要，并以此作為分子影像試劑和藥物運輸?shù)妮d體；該載體系統(tǒng)需滿足形態(tài)和粒徑易精確控制、其構(gòu)成材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)易修飾進從而易于實現(xiàn)功能化、能夠同時裝載多種分子影像試劑從而實現(xiàn)多模態(tài)成像，能夠同時裝載治療藥物從而實現(xiàn)多功能、穩(wěn)定性和生物相容性較好等必要條件。
[0006]生物大分子脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)是自然界各種生命體的遺傳信息的載體。結(jié)構(gòu)DNA技術(shù)(structural DNA nanotechnology)中，DNA不再作為遺傳信息的載體，而是通過預(yù)先進行序列設(shè)計，作為進一步形成自組裝納米結(jié)構(gòu)的基元。DNA折紙技術(shù)(DNA origami)是一種新穎而獨特的DNA自組裝納米技術(shù)，即利用長的單鏈核苷酸序列與若干條短的寡核苷酸序列通過堿基互補配對進行雜交形成預(yù)先設(shè)計的結(jié)構(gòu)，現(xiàn)在被廣泛用來從DNA自下而上(Bottom-up)地制作各種納米尺度的二維和/或三維的DNA圖案和形狀(Nature, 2006, 440，297-302.)。利用DNA折紙技術(shù)構(gòu)造的納米結(jié)構(gòu)具有結(jié)構(gòu)可控、易于修飾的特點，利用DNA折紙技術(shù)構(gòu)建小分子抗腫瘤藥物載體可作為藥物運載領(lǐng)域的新發(fā)展方向，有非常廣闊的應(yīng)用前景。
[0007]基于核酸序列的特性進行分析，可發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物運輸載體相比，核酸納米結(jié)構(gòu)具有十分明顯的優(yōu)勢:1)自組裝核酸納米材料本身是由生物大分子而組成，能夠生物降解，具有其他載體不可比擬的良好的生物相容性，研究表明自組裝核酸納米材料沒有明顯的細(xì)胞毒性和免疫原性；2)DNA結(jié)構(gòu)本身依照堿基互補配對原則構(gòu)造，形成的組裝結(jié)構(gòu)具有高度可預(yù)測性，隨著DNA折紙術(shù)和其他自組裝技術(shù)的發(fā)展，通過DNA鏈的雜交折疊，可以構(gòu)造出所需要的圖形結(jié)構(gòu)，進一步構(gòu)建復(fù)雜可控的納米級圖案和形狀，可通過設(shè)計合理的DNA探針尺寸，在整體水平滿足對腫瘤被動靶向運輸；3)DNA納米結(jié)構(gòu)表面的短鏈可以用來組裝具有分子影像材料，如水溶性量子點、上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒、磁性納米顆粒、拉曼染料、金納米棒等，并且可以精確控制組裝材料的種類、數(shù)量和空間位置，實現(xiàn)成像試劑的有效運輸和多模態(tài)成像；4)DNA折紙?zhí)结樋梢酝ㄟ^設(shè)計出合理尺寸和形狀，用其負(fù)載分子影像試劑可以延長其在血液中滯留的半衰期，更好的實現(xiàn)腫瘤被動靶向運輸；5)DNA納米結(jié)構(gòu)的外表面可以使用短鏈DNA進行雜交，從而在選擇的部位進行靶向性功能基團的修飾，如修飾腫瘤細(xì)胞表面受體特異性的配體基團或腫瘤微環(huán)境靶向基團，增強DNA納米探針的主動靶向性，更好的實現(xiàn)腫瘤特異性成像；6)DNA載體運輸?shù)牧孔狱c、上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒、磁性納米顆粒、拉曼染料、金納米棒等可進行活細(xì)胞/活體的熒光成像、核磁共振成像、拉曼成像或光聲成像，可在細(xì)胞水平和活體水平觀測探針運載的分布和匯聚，并有望在臨床進行腫瘤的早期檢測和切除術(shù)中導(dǎo)航；7)DNA納米結(jié)構(gòu)內(nèi)部可以進行功能化修飾，能夠有效裝載具有活性的多種抗腫瘤功能成分，從而實現(xiàn)DNA納米探針的載藥功能，進而實現(xiàn)集腫瘤靶向、檢測和治療的多功能診療一體化納米平臺。
[0008]核酸納米結(jié)構(gòu)具有上述優(yōu)勢，同時已有將核酸納米結(jié)構(gòu)用于抗腫瘤藥物載體在細(xì)胞水平和動物水平進行腫瘤治療的報道，但是目前尚無將核酸納米結(jié)構(gòu)作為光敏劑載體應(yīng)用于人體或動物腫瘤檢測監(jiān)控治療的報道。主要是因為以核酸納米結(jié)構(gòu)作為光敏劑載體構(gòu)建的分子影像探針在動物水平上的生物分布還缺乏認(rèn)識。換句話說，目前還沒有研究能夠證明核酸納米結(jié)構(gòu)作為貴金屬光敏成分的載體是否能夠促進光敏成分在腫瘤組織中的富集從而更有效的進行活體光聲成像。
[0009]因此，核酸納米結(jié)構(gòu)作為光敏成分載體的相關(guān)研究可克服本領(lǐng)域的技術(shù)偏見，并揭示了核酸納米結(jié)構(gòu)-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物在腫瘤診斷領(lǐng)域的發(fā)展趨勢。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的在于提供一種核酸納米結(jié)構(gòu)載體，包含其的核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物及它們的制備方法和應(yīng)用，其能夠促進光敏成分在腫瘤組織中的富集從而更有效的進行活體光聲成像。
[0011]為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用以下技術(shù)方案:
[0012]本發(fā)明的第一方面在于提供一種核酸納米結(jié)構(gòu)載體，其具有通過DNA折紙技術(shù)(DNA origami)構(gòu)建的二維和/或三維納米結(jié)構(gòu),具體是通過腳手架鏈(scaffold chains)與輔助折疊的訂書釘鏈(staple strands)進行雜交而自組裝形成的核酸納米結(jié)構(gòu)，所述腳手架鏈與所述訂書釘鏈通過堿基互補配對原則進行雜交；
[0013]其中所述腳手架鏈可選自M13噬菌體基因組DNA、基于M13噬菌體基因組DNA進行改造的各種單鏈環(huán)狀DNA、Lambda噬菌體基因組DNA、利用點突變技術(shù)和位點-延伸非依賴克隆(SLIC)技術(shù)從給定質(zhì)粒大規(guī)模生產(chǎn)長度可調(diào)的單鏈環(huán)狀DNA鏈、通過PCR得到的M13噬菌體基因組DNA片段、Lambda噬菌體基因組DNA片段和利用體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA片段中的一種或至少兩種的混合物。除此之外，還可使用其它腳手架鏈，只要其能夠滿足特定位點上的堿基互補配對，使訂書釘鏈能夠輔助腳手架鏈進行折疊自組裝形成核酸納米結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，所述腳手架為M13噬菌體基因組DNA。
[0014]所述輔助折疊的訂書釘鏈為人工合成的寡核苷酸序列。其選取5-20個位點延伸出了捕獲序列，其捕獲序列與后續(xù)DNA修飾貴金屬納米光敏成分采用的序列互補。
[0015]由此可見，優(yōu)選的核酸納米結(jié)構(gòu)載體為M13噬菌體基因組DNA與人工合成的寡核苷酸序列通過堿基互補配對原則進行雜交自組裝而形成。
[0016]優(yōu)選地，使用DNA折紙技術(shù)將所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體構(gòu)建成三角形、長方形、納米管狀、四面體、巴基球形、納米片狀、帶狀或籠狀，優(yōu)選三角形。
[0017]本發(fā)明的第二方面在于提供本發(fā)明第一方面所述的核酸納米結(jié)構(gòu)載體的制備方法，其包括以下步驟:將所述訂書釘鏈混合溶液加入到所述腳手架鏈溶液中，所述腳手架鏈與所述訂書釘鏈的摩爾比為1:2-50，混勻；以90-1001:為起始溫度進行降溫退火至15-25 0C，整個過程持續(xù)8-28h，制得所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體。
[0018]其中所述腳手架鏈與所述訂書釘鏈的摩爾比可以是例如1:2、1:3、1:4、1:5、1:8、1:10、1:12、1:15、1:18、1:20、1:22、1:28、1:32、1:35、1:38、1:40、1:42、1:45、1:48 或 1:49，優(yōu)選1:5-30，更優(yōu)選1:10-25，特別優(yōu)選1:20 ；
[0019]其中所述降溫退火的起始溫度可以是例如90°C、91V、92 V、93 °C、94 V、95°C、96°C、97°C、98°C、99°C或 100°C，優(yōu)選 92_98°C，更優(yōu)選 95°C ；
[0020]其中所述降溫退火的終點溫度可以是例如15 °C、16 °C、17 °C、18 °C、19 °C、20 V、21°〇、221:、231:、241:或251:，優(yōu)選 18-22 °C，更優(yōu)選 20 °C ；
[0021]其中所述降溫退火過程的持續(xù)時間可以是9h、llh、13h、14h、15h、18h、20h、21h、22h、23h、25h 或 27h，優(yōu)選 10_26h，更優(yōu)選 12_24h。
[0022]本發(fā)明的第三方面在于提供一種核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物，所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物包括貴金屬光敏造影劑和如上所述的核酸納米結(jié)構(gòu)載體；所述貴金屬光敏造影劑為表面進行寡核苷酸序列修飾修飾的金納米棒、金納米殼、表面包銀的金納米棒,金納米籠中的一種或至少兩種的混合物；所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體與所述貴金屬光敏造影劑通過寡核苷酸序列雜交偶聯(lián)。
[0023]在本發(fā)明的一個【具體實施方式】中，通過電泳圖證實裝載金納米棒后的核酸納米結(jié)構(gòu)載體具有清晰的電泳條帶。再以電鏡照片檢測該載體的DNA折紙結(jié)構(gòu)在與貴金屬光敏造影劑偶聯(lián)前后的結(jié)構(gòu)變化，可見核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物形成良好，組裝和純化過程對DNA折紙-金納米棒復(fù)合物沒有不利影響。
[0024]所述貴金屬光敏造影劑可使用領(lǐng)域內(nèi)任意已知方法制備。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述貴金屬光敏造影劑為表面進行巰基化DNA修飾的金納米棒。
[0025]本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會理解，本發(fā)明的貴金屬光敏造影劑的制備方法并不必然依賴于上述詳細(xì)工藝及參數(shù)，此處給出的僅僅是較優(yōu)的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)其經(jīng)驗制備所需的貴金屬光敏造影劑。
[0026]本發(fā)明的一個具體實施方案以巰基化DNA修飾的金納米棒作為貴金屬光敏造影齊U，由本發(fā)明的核酸納米結(jié)構(gòu)載體將其運載進入動物細(xì)胞及動物體后測量其成像效果。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠知曉，現(xiàn)有的貴金屬光敏造影劑及以后研發(fā)出來的光敏造影劑均可與本發(fā)明的核酸納米結(jié)構(gòu)載體進行偶聯(lián)制備成復(fù)合物，都落入本發(fā)明的范圍。
[0027]本發(fā)明的第四方面在于提供本發(fā)明第三方面所述的核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0028](I)制備核酸納米結(jié)構(gòu)載體；
[0029](2)制備貴金屬光敏造影劑；
[0030](3)將步驟⑴得到的核酸納米結(jié)構(gòu)載體與步驟(2)得到的貴金屬造影劑按照摩爾比為1:1.5-5混合于溶液中，以梯度循環(huán)的方式降溫退火；
[0031](4)將步驟(3)得到的溶液進行電泳除去過量的貴金屬光敏造影劑，純化得到核酸納米結(jié)構(gòu)-光敏造影劑復(fù)合物。
[0032]該制備過程為將所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體與所述貴金屬光敏造影劑混合，DNA雜交偶聯(lián)形成所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物。其將所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體溶液與所述貴金屬光敏造影劑溶液混合，以梯度循環(huán)的方式逐漸降溫退火；再在一定的電泳條件下分離過量的貴金屬光敏造影劑，純化得到所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物。
[0033]步驟(I)中，核酸納米結(jié)構(gòu)載體的制備方法為根據(jù)本發(fā)明第二方面的制備方法，例如將M13噬菌體基因組DNA與所述人工合成的寡核苷酸序列按摩爾比1:2-50、優(yōu)選I: 5-30、更優(yōu)選1:10-25、特別優(yōu)選1:20混合于溶液中，以90_100°C，優(yōu)選92_98°C，更優(yōu)選950C為初始溫度，逐漸降溫退火至15-25°C，優(yōu)選18-22°C，更優(yōu)選20°C。降溫退火過程持續(xù)時間為8-28h，優(yōu)選10-26h，更優(yōu)選12-24h，得到核酸納米結(jié)構(gòu)載體；
[0034]步驟(2)中所述貴金屬光敏造影劑可通過以下方法制備:利用晶種誘導(dǎo)生長法制備表面CTAB包裹的金納米棒；使用合成的巰基化寡核苷酸序列取代金棒表面的CTAB，由此完成金納米棒的DNA表面修飾；或者具體地，通過上文所述的巰基化DNA修飾的金納米棒的合成和表面修飾方法進行制備；
[0035]步驟(3)中，所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體與所述貴金屬造影劑的摩爾比為1:1.5、1:2、1: 3、1: 4、1: 5，優(yōu)選1:2 ;所述降溫退火為從溫度40-45°C，逐漸降溫退火至溫度20_25°C，該降溫退火過程為一個循環(huán)，共30-60個循環(huán)，優(yōu)選30-45個循環(huán)，每。C為一個梯度，每梯度保持 3_5min ；
[0036]步驟⑷中，所述電泳的條件為:0.5-1 %瓊脂糖膠、電泳環(huán)境溫度4-10°C、電泳緩沖液為0.5-1 X TBE緩沖液并含5-1 ImM Mg2+、電泳電壓為10_15V/cm、且電泳時間30_50min。
[0037]本發(fā)明的第五方面在于提供本發(fā)明第一方面所述的核酸納米結(jié)構(gòu)載體在制備抗腫瘤藥物或腫瘤檢測金屬造影劑中的應(yīng)用。所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體裝載抗腫瘤藥物或貴金屬光敏造影劑，所述腫瘤為卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞癌、頭頸癌、食管癌、肝癌、肺腺細(xì)胞癌、前列腺癌和非何金氏淋巴瘤中的一種或至少兩種的組合。
[0038]本發(fā)明的第六方面在于提供本發(fā)明第三方面所述的核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物在制備活體光聲成像造影劑或腫瘤手術(shù)導(dǎo)航探針中的應(yīng)用，所述腫瘤為卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞癌、頭頸癌、食管癌、肝癌、肺腺細(xì)胞癌、前列腺癌和非何金氏淋巴瘤中的一種或至少兩種的組合。
[0039]本發(fā)明中，“訂書釘鏈”、“寡核苷酸序列”和“短鏈核苷酸序列”等表示核苷酸片段的術(shù)語或短語都意指同樣的對象且具有相同的功能，即指通過堿基互補配對原則對腳手架鏈起到輔助折疊作用以使其自組裝形成特定二維和/或三維結(jié)構(gòu)的短的核苷酸序列。所述“訂書釘鏈”是一種形象的表達，意指其像訂書釘一樣將腳手架鏈的不同位點釘在一起。“捕獲序列”則指在選取5-20訂書釘鏈位點延伸出捕獲序列的短DNA序列，其捕獲序列與DNA修飾貴金屬納米光敏成分采用的序列互補。
[0040]本發(fā)明中，術(shù)語“腳手架鏈”是指長的DNA或RNA序列，尤其是指單鏈DNA序列，其是形成核酸納米結(jié)構(gòu)的主體原料，在訂書釘鏈的輔助折疊作用下自組裝形成特定二維和/或三維結(jié)構(gòu)。
[0041]本發(fā)明中，術(shù)語“核酸納米結(jié)構(gòu)”是指腳手架鏈在訂書釘鏈的輔助折疊作用下自組裝形成的特定二維和/或三維結(jié)構(gòu)。需要說明的是，該名稱雖然含有“納米” 一詞，但其實際所指的對象并不一定要限定為納米級別，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會理解，雖然納米級別的顆粒作為藥物載體是常見的，但也有些藥物載體能夠達到微米的級別，因此，本發(fā)明納米只是一個統(tǒng)稱，核酸納米結(jié)構(gòu)實際上代表納米或微米級別的具備本發(fā)明技術(shù)特征的結(jié)構(gòu)。
[0042]本發(fā)明中，術(shù)語“核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物”是指核酸納米結(jié)構(gòu)負(fù)載相應(yīng)光敏成分，(在本發(fā)明中特指貴金屬納米顆粒)或其活性成分形成的結(jié)構(gòu)復(fù)合體。
[0043]本發(fā)明的有益效果為:
[0044](I)本發(fā)明通過DNA折紙技術(shù)，將腳手架鏈與輔助折疊的訂書釘鏈和捕獲鏈通過堿基互補配對原則進行雜交完成自組裝而形成帶有捕獲序列核酸納米結(jié)構(gòu)載體，該核酸納米結(jié)構(gòu)載體可負(fù)載貴金屬光敏造影劑，實現(xiàn)核酸納米結(jié)構(gòu)載體與貴金屬光敏造影劑的結(jié)口 ο
[0045](2)所示核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物具有高靈敏度的光聲成像能力，能夠作為影像探針，在細(xì)胞水平和動物水平的實驗證明，該復(fù)合物不但能夠保證活細(xì)胞水平的雙光子熒光成像，而且能夠在活體水平實現(xiàn)非侵入性和高靈敏性的光聲成像能力。
[0046](3)動物水平的光聲成像實驗證明，核酸納米結(jié)構(gòu)載體有效的提高貴金屬光敏造影劑的被動靶向性，使抗腫瘤藥物在腫瘤組織內(nèi)部明顯富集，顯著改善單獨貴金屬光敏成分僅停留在腫瘤組織表面的性質(zhì)。去氧血紅蛋白在注射所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑后3h出現(xiàn)大量分布，且分布區(qū)域與核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒復(fù)合物信號較好的吻合，同時3-24小時后核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒復(fù)合物信號在腫瘤組織內(nèi)部均勻分布。
[0047](4)本發(fā)明制備所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體的方法，只需要按照合適的比例將輔助折疊的訂書釘鏈加入到腳手架鏈溶液中，混勻后，在適宜的溫度范圍內(nèi)降溫以實現(xiàn)自組裝，不需要太多的人為干預(yù)，因此工藝簡單且方便易行。
[0048]本發(fā)明制備的核酸納米結(jié)構(gòu)載體裝載貴金屬光敏造影劑可以制成復(fù)合物探針，作為成像造影劑和手術(shù)導(dǎo)航探針，在腫瘤篩查和手術(shù)中用于檢測和/或治療腫瘤。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]圖1為金納米棒及核酸納米結(jié)構(gòu)載體-金納米棒復(fù)合物的電泳圖。
[0050]圖2為三角形的核酸納米結(jié)構(gòu)載體及核酸納米結(jié)構(gòu)載體-金納米棒復(fù)合物的電子顯微鏡照片，標(biāo)尺為20nm。
[0051]圖3為金納米棒組及核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒復(fù)合物組在活細(xì)胞中進行雙光子熒光成像效果的對比圖，20倍油鏡觀測，標(biāo)尺為20 μ m。
[0052]圖4為貴金屬光敏造影劑在活體水平注射后，在不同時間進行光聲成像后，材料在移植瘤中匯聚效果圖。
[0053]圖5為核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物在活體水平注射后，在不同時間進行光聲成像后，材料在移植瘤中匯聚效果圖。

【具體實施方式】
[0054]下面結(jié)合附圖并通過【具體實施方式】來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0055]本發(fā)明所用的器材和材料:
[0056]器材:MastercyclerPro 梯度 PCR 儀(Eppendorf,德國)，581R 小型高速離心機(Eppendorf，德國)，UV-2450紫外-可見分光光度計(島津，日本)，透射電鏡(Tecnei，日本)，雙光子熒光顯微鏡(Olympus，日本)，小動物光聲成像系統(tǒng)(iThera，德國)。
[0057]原料:短鏈核苷酸序列(訂書釘鏈，Nature, 2006，440，297-302)購自上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司，M13噬菌體基因組DNA購自New England B1labs公司。CTAB，氯金酸，硼氫化鈉，硝酸銀等合成金納米棒的原料購自Sigma-Aldrich公司。
[0058]試劑:實驗中所用的緩沖溶液有TAE/Mg2+緩沖溶液(pH 8.0)和PBS緩沖溶液(pH7.4)。其中，ΙΧΤΑΕ/Mg2+緩沖溶液(pH 8.0)的組分為:4Xl(T2mol L^1Tris, 2X 10_2mol Γ1乙酸，2.0Xl(T3mol T1EDTA 和 1.25Xl(T2mol L—1 醋酸鎂；I XPBS 緩沖溶液(pH 7.4)的組成為:136.9Xl(T3mol L-1 (8.0Og L’NaCl, 2.68X 10_3mol L-1 (0.20g L-1)KC1，9.75X l(T3molΓ1 (1.56g Γ1) Na2HPO4.H2O 和 1.47 X l(T3mol Γ1 (0.20g Γ1) KH2PO4 ;這些緩沖溶液所用的試劑均為分析純，購自Sigma-Aldrich公司。
[0059]細(xì)胞:4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞系，購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
[0060]培養(yǎng)基:RPMI1640培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清，細(xì)胞接種于10mm2培養(yǎng)皿中，置于5% CO2培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至融合度80%左右時傳代；所用培養(yǎng)基和胎牛血清購自 Life Technology 公司。
[0061]BALB/c裸鼠:購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部。
[0062]實施例1制備核酸納米結(jié)構(gòu)載體、貴金屬光敏造影劑和核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物
[0063]將50 μ L終濃度為5ηΜ的Μ13噬菌體基因組DNA與100 μ L終濃度為50ηΜ的訂書釘鏈及捕獲鏈混合溶液充分混勻在ImL I X TAE/Mg2+(pH = 8.0)溶液中，從95°C開始，逐漸降溫退火至20°C，退火孵育時間為12-24h，制備得到具有預(yù)先設(shè)計幾何外形的核酸納米結(jié)構(gòu)。本實驗中所用的三角形DNA折紙是基于Rothemund 2006年的設(shè)計進行修改(Nature, 2006, 440, 297-302.)，在 7 個位點延伸出了捕獲鏈(5’-AAAAAAAAAAAAAAA-原始訂書釘鏈序列-3’)，其捕獲序列與后續(xù)DNA修飾金棒采用的序列互補。
[0064]利用晶種誘導(dǎo)生長法以十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)為表面活性劑，調(diào)控AgNO3濃度制備金納米棒(Chem Mater, 2003，15(10): 1957-62.)。具體方法如下:
[0065]a)晶種的合成。將7.5mL的濃度為10mM的CTAB加入25mL圓底燒瓶中，加入50yL濃度2% (w/v) HAuCl40在攪拌狀態(tài)下迅速加入600 μ L濃度為1mM預(yù)冷NaBH4，攪拌均勻。待溶液顏色由無色變?yōu)橥咙S色，停止攪拌，28-30°C靜置2h備用。
[0066]b)金棒的生長。在25mL圓底燒瓶中加入1mL濃度為10mM的CTAB和80 μ L 2%(w/v) HAuCl40在攪拌條件下，加入75 μ L濃度為1mM AgNO3, 50 μ L濃度為10mM的抗壞血酸和20 μ L晶種溶液。攪拌Imin后，將溶液置于28°C溫水浴生長5h。
[0067]c)金納米棒的純化。將上述生長溶液加入試管離心(8000rpm,30min),棄上清,將沉于管底的納米顆粒用超純水重新分散并再次離心(3000rpm，25min)。棄去沉淀，取上清液再次離心(8000rpm, 30min),將沉于管底的AuNR用100 μ L超純水重新分散,利用紫外_可見分光光度計檢測金納米棒濃度。
[0068]利用巰基化DNA對于金納米棒進行表面修飾，具體方法如下:
[0069]巰基化DNA (ACGCTTTTTTTTTTTTTTT-SH, 100 μ Μ)用 TCEP (20mM, 200 倍過量)還原6h，過量TCEP用G-25體積排阻柱離心去除。將純化后的巰基化DNA(100 μ Μ)加入修飾緩沖液中(含 0.01% (w/v) SDS,89mM Tris, 89mM 硼酸，2mM EDTA, 500mM NaCl，pH 5-6)，在震蕩時加入AuNR(100nM，AuNR:DNA = 1:1000)置于28°C溫水浴進行修飾。修飾過夜后將修飾了 DNA 的金棒(AuNR-DNA)離心(8000rpm，30min)去除過量 DNA。
[0070]DNA折紙結(jié)構(gòu)與金納米棒的組裝:
[0071]DNA折紙結(jié)構(gòu)經(jīng)PCR程序控溫組裝后，利用截留分子量為10kDa離心柱純化去除過量DNA訂書釘鏈和捕獲鏈。將DNA折紙結(jié)構(gòu)和包覆了 DNA的金棒(AuNR-DNA)以1:1.2-1:5的比例混合，置于PCR中退火雜交，制備金納米棒-DNA折紙復(fù)合物。退火條件為:從45°C -25°C為一個循環(huán)，共30個循環(huán)，每。C為一個梯度，每梯度保持3min。
[0072]電泳純化:制備I %瓊脂糖膠，將包覆了 DNA的金棒、DNA折紙和DNA折紙-金納米棒加入膠孔中進行電泳，電泳環(huán)境為0.5XTBE緩沖液并含llmMMg2+。電泳結(jié)束后在白光下對凝膠進行拍照。在白光下切出目標(biāo)條帶，利用凝膠純化柱4°C離心濃縮。
[0073]電鏡:鍍碳支持膜(銅網(wǎng))經(jīng)等離子體處理機輝光濺射，將7 μ L純化后的DNA折紙-金納米棒復(fù)合結(jié)構(gòu)沉積在銅網(wǎng)上，1min后吸棄，用0.7%醋酸雙氧鈾染色30s。吸棄染色液，待銅網(wǎng)完全干燥后進行透射電鏡觀測，電壓為80kV，高反差模式進行拍照。
[0074]如圖1所示，左邊第一泳道為巰基化DNA修飾的金納米棒，右側(cè)四個泳道為DNA折紙-金納米棒復(fù)合結(jié)構(gòu)；瓊脂糖膠前沿的條帶為DNA修飾的金納米棒條帶，白色虛線框中為目標(biāo)DNA折紙-金納米棒復(fù)合結(jié)構(gòu)的條帶，目標(biāo)條帶之上為復(fù)合結(jié)構(gòu)的多聚體。由圖1可見裝載金納米棒后的核酸納米結(jié)構(gòu)具有清晰的電泳條帶。如圖2所示，左圖為DNA折紙納米結(jié)構(gòu)電鏡圖，右圖為DNA折紙-金納米棒復(fù)合結(jié)構(gòu)電鏡圖。由圖2可見組裝金納米棒前后的三角形DNA折紙結(jié)構(gòu)，可見DNA折紙-金納米棒復(fù)合物形成良好，組裝和純化過程對DNA折紙-金納米棒復(fù)合物沒有不利影響。
[0075]實施例2核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒復(fù)合物的活細(xì)胞攝入
[0076]鼠乳腺癌4T1細(xì)胞接種于10mm2培養(yǎng)皿中，利用RPMI1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清和雙抗)于5% 0)2培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至融合度80%左右，消化細(xì)胞，接種于35mm2共聚焦小皿中培養(yǎng)過夜,加入金棒、DNA折紙-金納米棒復(fù)合結(jié)構(gòu)(0.1nM,完全培養(yǎng)基稀釋)和對照組孵育24h。吸棄各組藥液，用PBS清洗細(xì)胞后利用雙光子熒光顯微鏡進行觀察，激發(fā)波長為800nm。
[0077]觀察結(jié)果如圖3所示，圖片從上至下分別為對照組、金納米棒處理組和DNA折紙-金納米棒復(fù)合結(jié)構(gòu)處理組，從左至右分別為明場成像、雙光子熒光成像和雙光子通道與細(xì)胞膜染料的疊加信號。由圖3可得知，核酸納米結(jié)構(gòu)能夠有效運載金納米棒在活細(xì)胞內(nèi)雙光子熒光成像良好；在相同金納米棒濃度條件下，核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒復(fù)合物的細(xì)胞攝入效果明顯優(yōu)于單獨金納米棒。該結(jié)果展示了核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒復(fù)合物在活細(xì)胞水平進行成像的能力。
[0078]實施例3核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒復(fù)合物的活體光聲成像
[0079]培養(yǎng)4T1細(xì)胞至對數(shù)生長期，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為I X 17個/mL，取100 μ L原位接種于5-6周雌性BALB/c裸鼠背部皮下，進行皮下乳腺移植瘤建模。建模I周后，當(dāng)腫瘤大小至100mm3，分為2組進行給藥處理，分別為金納米棒組(3nMX 150 μ L)，核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒復(fù)合物組(3nMX 150 μ L)，靜脈注射藥物。注射后0、3、24h時利用小動物光聲成像系統(tǒng)對于荷瘤鼠進行活體光聲成像。
[0080]圖4所示為注射金棒后0h，3h和24h的荷瘤鼠光聲成像結(jié)果。由圖4可見，利用單獨金納米棒處理后，1-3小時后造影劑已聚集于荷瘤鼠腫瘤區(qū)域，去氧血紅蛋白在注射后3h出現(xiàn)大量分布,且分布區(qū)域與金棒信號較好的吻合；注射后24h僅腫瘤表層具有金棒的光聲信號。圖5所不為注射DNA折紙-金納米棒復(fù)合結(jié)構(gòu)后Oh, 3h和24h的荷瘤鼠光聲成像結(jié)果。而由圖5可見，與單獨金棒類似，核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒復(fù)合物處理后，去氧血紅蛋白在注射后3h出現(xiàn)大量分布，且分布區(qū)域與核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒復(fù)合物信號較好的吻合，同時3-24h后核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒復(fù)合物信號在腫瘤組織內(nèi)部均勻分布。該結(jié)果進一步證明核酸納米結(jié)構(gòu)-金納米棒復(fù)合物是一種良好的納米探針材料，在活細(xì)胞內(nèi)和活體腫瘤內(nèi)部具有良好的分布，在活體水平能夠?qū)τ谀[瘤組織進行非侵入性、實時的光聲成像，有望為進一步開發(fā)核酸納米結(jié)構(gòu)作為腫瘤檢測造影劑和切除術(shù)導(dǎo)航探針提供基礎(chǔ)，具有極大的應(yīng)用價值。
[0081] 申請人:聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)方法才能實施。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種核酸納米結(jié)構(gòu)載體，其特征在于，所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體具有通過DNA折紙技術(shù)構(gòu)建的二維和/或三維納米結(jié)構(gòu)，具體是通過腳手架鏈與輔助折疊的訂書釘鏈進行雜交而自組裝形成的核酸納米結(jié)構(gòu)；其中所述腳手架鏈為M13噬菌體基因組DNA、基于M13噬菌體基因組DNA進行改造的各種單鏈環(huán)狀DNA、Lambda噬菌體基因組DNA、利用點突變技術(shù)和位點-延伸非依賴克隆技術(shù)從給定質(zhì)粒大規(guī)模生產(chǎn)長度可調(diào)的單鏈環(huán)狀DNA鏈、通過PCR得到的M13噬菌體基因組DNA片段、Lambda噬菌體基因組DNA片段或利用體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA片段中的一種或至少兩種的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸納米結(jié)構(gòu)載體，其特征在于，所述腳手架鏈與所述訂書釘鏈通過堿基互補配對原則進行雜交； 優(yōu)選地，所述腳手架為M13噬菌體基因組DNA ； 優(yōu)選地，所述訂書釘鏈為人工合成的寡核苷酸序列； 優(yōu)選地，使用DNA折紙技術(shù)將所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體構(gòu)建成三角形、長方形、納米管狀、四面體、巴基球形、納米片狀、帶狀或籠狀，優(yōu)選三角形。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸納米結(jié)構(gòu)載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:將所述訂書釘鏈混合溶液加入到所述腳手架鏈溶液中，所述腳手架鏈與所述訂書釘鏈的摩爾比為1:2-50，混勻；以90-100°C為起始溫度進行降溫退火至15-25°C，整個過程持續(xù)8-28h,制得所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述腳手架鏈與所述訂書釘鏈的摩爾比1:5-30，更優(yōu)選1:10-25，特別優(yōu)選1:20 ； 優(yōu)選地，所述降溫退火的起始溫度為92-98°C，更優(yōu)選95°C ； 優(yōu)選地，所述降溫退火的終點溫度為18-22°C，更優(yōu)選20°C ； 優(yōu)選地，所述降溫退火過程的持續(xù)時間為10-26h，更優(yōu)選12-24h。
5.—種核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物，其特征在于，所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物包括貴金屬光敏造影劑和根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸納米結(jié)構(gòu)載體；所述貴金屬光敏造影劑為表面進行寡核苷酸序列修飾的金納米棒、金納米殼、表面包銀的金納米棒、金納米籠中的一種或至少兩種的混合物；所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體與所述貴金屬光敏造影劑通過寡核苷酸序列相偶聯(lián)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物，其特征在于，所述貴金屬光敏造影劑為表面進行巰基化DNA修飾的金納米棒。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)制備核酸納米結(jié)構(gòu)載體； (2)制備貴金屬光敏造影劑； (3)將步驟(I)得到的核酸納米結(jié)構(gòu)載體與步驟(2)得到的貴金屬造影劑按照摩爾比為1:1.5-5混合于溶液中，以梯度循環(huán)的方式降溫退火； (4)將步驟(3)得到的溶液進行電泳除去過量的貴金屬光敏造影劑，純化得到核酸納米結(jié)構(gòu)-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，核酸納米結(jié)構(gòu)載體的制備方法為根據(jù)權(quán)利要求3或4的制備方法； 優(yōu)選地，步驟(2)中所述貴金屬光敏造影劑通過以下方法制備:利用晶種誘導(dǎo)生長法制備金納米棒；使用十六烷基三甲基溴化銨CTAB進行修飾；使用合成的巰基化寡核苷酸序列替代CTAB，由此完成金納米棒的DNA表面修飾； 優(yōu)選地，步驟(3)中，所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體與所述貴金屬造影劑的摩爾比為1:2;所述降溫退火為從溫度40-45°C，逐漸降溫退火至溫度20-25°C，此退火降溫過程為一個循環(huán)，共30-60個循環(huán)，優(yōu)選30-45個循環(huán)，每攝氏度。C為一個梯度，每梯度保持3_5min ；優(yōu)選地，步驟(4)中，所述電泳的條件為:0.5-1%瓊脂糖膠、電泳環(huán)境溫度4-10°C、電泳緩沖液為0.5-1 XTBE緩沖液并含5-llmM Mg2+、電泳電壓為10_15V/cm、且電泳時間30_50mino
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸納米結(jié)構(gòu)載體在制備抗腫瘤藥物或腫瘤檢測金屬造影劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述核酸納米結(jié)構(gòu)載體裝載抗腫瘤藥物或貴金屬光敏造影劑，所述腫瘤為卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞癌、頭頸癌、食管癌、肝癌、肺腺細(xì)胞癌、前列腺癌和非何金氏淋巴瘤中的一種或至少兩種的組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的核酸納米結(jié)構(gòu)載體-貴金屬光敏造影劑復(fù)合物在制備活體光聲成像造影劑或腫瘤手術(shù)導(dǎo)航探針中的應(yīng)用，所述腫瘤為卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞癌、頭頸癌、食管癌、肝癌、肺腺細(xì)胞癌、前列腺癌和非何金氏淋巴瘤中的一種或至少兩種的組合。
【文檔編號】A61K49/00GK104324375SQ201410426106
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月26日
【發(fā)明者】丁寶全, 蔣喬, 蘇曉芳, 宋琳琳, 杜洋, 張倩 申請人:國家納米科學(xué)中心, 中國科學(xué)院自動化研究所