一種含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明以殼聚糖為載體，三聚磷酸鈉為交聯(lián)劑，通過離子交聯(lián)法，包封厚樸酚或和厚樸酚藥物，然后經(jīng)過濾、透析除去溶液中未包埋的藥物和小分子物質(zhì)，最后冷凍干燥即得含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球。所制備的載藥納米微球的平均粒徑為40～150nm，載藥量為74.4～283.14μg/mg，包封率為20.27～82.11％，多分散系數(shù)為0.3～0.4，Zeta電位為20～50mV。所制得的載藥納米微球粒徑均一、分散性好，有較高的抗氧化活性和抗癌活性，有效地提高了厚樸酚、和厚樸酚的水溶性、穩(wěn)定性和生物利用度，在新型天然抗氧化劑和抗腫瘤制劑方面有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球及其制備方 法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)是中藥資源生物多樣性最豐富的國(guó)家。但是，我國(guó)中藥制劑劑型老化、單一， 極大的限制了中藥臨床療效的提高。充分利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，使中藥具有更好的現(xiàn)代劑型 可能是現(xiàn)代中藥發(fā)展的重要方向之一。納米藥物具有一些特別的性質(zhì)，像靶向性、緩釋行、 可控性、低毒性等，納米中藥也具有這些相似的性質(zhì)。將納米技術(shù)引入中藥的研究，開發(fā)具 有自主知識(shí)廣權(quán)的中藥新劑型，對(duì)中藥的研究是很有意義的。相關(guān)研究表明，引入納米技 術(shù)，將中藥制備成納米中藥，能有效改善藥物的穩(wěn)定性、水溶性、使藥物具有緩釋效果、提高 藥物靶向性，從而提高中藥生物利用度；同時(shí)，還可豐富傳統(tǒng)中藥劑型和給藥途徑，解決中 藥劑型單一的問題。雖然納米技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域起步較晚，但已展現(xiàn)出巨大的潛力及廣闊 的前景。
[0003] 厚樸（Magnolia officinalis.)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，在我國(guó)已有2000多年的藥用歷 史，而厚樸酚（magnolol)與和厚樸酚（honokiol)是木蘭科植物厚樸中的兩個(gè)主要活性成 分，屬于難溶性藥物。研究發(fā)現(xiàn)，厚樸酚、和厚樸酚具有良好抗炎、抗菌、抗腫瘤、肌肉松弛、 降膽固醇和抗衰老等廣泛的藥理活性，且毒副作用小，是很具有開發(fā)前途的中藥經(jīng)濟(jì)作物。 但由于厚樸酚與和厚樸酚均為酚類結(jié)構(gòu)，由于溶解性差在生物體內(nèi)利用率很低，主要滯留 于胃腸內(nèi)，95%由糞便排出，進(jìn)入循環(huán)后以肝代謝和腎排泄為主。且酚類物質(zhì)穩(wěn)定性較差， 在潮濕、陽光、高溫等條件下極易發(fā)生氧化、聚合、縮合等反應(yīng)，使其分子結(jié)構(gòu)中有生物活性 的酚羥基變成醌，導(dǎo)致其應(yīng)用受到局限。因此，采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)將厚樸酚或和厚樸酚包裹 起來，制備成納米微球，改善其水溶性和穩(wěn)定性以提高其生物利用度，成為亟需解決的一大 難題。
[0004] 殼聚糖是一種具有反應(yīng)性官能團(tuán)，較高的吸附能力和可生物降解性的高分子電解 質(zhì)。此外，它有良好的生物相容性，在體內(nèi)能被降解，降解產(chǎn)物能完全地被人體吸收,對(duì)生命 體無毒且有抗細(xì)菌、抗真菌和抗腫瘤的能力。這些特點(diǎn)使它在藥物的控制與釋放、改善藥物 的溶解性和吸收性等方面發(fā)揮重要作用。殼聚糖作為藥物緩釋載體還具有維持血藥濃度平 衡、降低藥物不良反應(yīng)、提高藥物療效等優(yōu)勢(shì)。因此殼聚糖是制備納米微球理想的載體。
[0005] 將難溶性藥物通過殼聚糖載體進(jìn)行包裹可制得載藥的納米微球，這種微球已被證 實(shí)可提高藥物分子的溶解性和生物活性。殼聚糖載藥微球的制備方法通常有噴霧干燥法、 溶劑蒸發(fā)法、乳化-化學(xué)交聯(lián)法和離子交聯(lián)法等。乳化交聯(lián)法，溶劑蒸發(fā)法和噴霧干燥法都 會(huì)用到乳化劑，如果清洗不徹底，會(huì)影響藥物活性甚至對(duì)生物體產(chǎn)生副作用，且這些方法的 制備工藝比較復(fù)雜，而離子交聯(lián)法工藝簡(jiǎn)便易行，而且不會(huì)用到有毒的有機(jī)溶劑。
[0006] 目前關(guān)于難溶性藥物的殼聚糖載藥微球的報(bào)道還不多，例如，CN102389398 A公開 了一種殼聚糖載辣椒素微球的制備方法。以殼聚糖溶液和辣椒素溶液為主要原料，通過離 子交聯(lián)法聯(lián)合噴霧干燥法制備得到，交聯(lián)劑為三聚磷酸鈉，得到的微球粒徑分布在0. 8? 4. 5 μ moCN 102641245 A公開了一種裝載紫杉醇等難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納 米球制備方法，先將難溶性藥物溶于有機(jī)溶劑，然后與殼聚糖溶液、乳化劑在一定壓力的條 件下先制備成初乳再制備成0/W/0型復(fù)乳液，多次過微孔濾膜再加入戊二醛或甲醛等交聯(lián) 齊U，最后固化得到產(chǎn)物。CN 102349871 B公開了一種制備難溶性藥物10-羥基喜樹堿載藥 納米微球的方法，先在較高壓力下通過反復(fù)壓過微孔膜制備含藥乳滴，再通過兩步較長(zhǎng)時(shí) 間交聯(lián)固化得到粒徑在300nm?2 μ m之間的載藥納米微球。這些殼聚糖載藥微球的制備 方法步驟復(fù)雜，反應(yīng)條件較苛刻，有些方法使用了有毒溶劑，并且所得到的載藥微球粒徑均 偏大，分布較廣。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，提供一種粒徑較 小、分散良好的含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球及其制備方法和應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明為解決上述提出的問題所采用的技術(shù)方案為：
[0009] -種含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球，該納米微球?yàn)闅ぞ厶桥c三聚磷酸鈉交聯(lián) 形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，厚樸酚或和厚樸酚以分子形式固定其中，厚樸酚或和厚樸酚的包封 率為20. 27?82. 11 %，納米微球的平均粒徑為40?150nm，納米微球粒徑的多分散系數(shù) (PDI)為 0· 3 ?0· 4,載藥量為 74. 4 ?283. 14 μ g/mg，Zeta 電位為 20 ?50mV。
[0010] 本發(fā)明還提供了上述含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球的制備方法，步驟如下：
[0011] (1)殼聚糖溶液的配制：將殼聚糖溶于含有濃度為〇. 〇1?〇. 〇5mg/mL的泊洛沙姆 188和體積濃度為1. 0?1. 5%醋酸的溶劑中，所述的溶劑為水或水與乙醇的混合物，其中 乙醇體積含量不超過50%，攪拌溶解、過濾，配成殼聚糖濃度為1. 0?3. Omg/mL的溶液，然 后用堿液調(diào)節(jié)pH值為3. 5?4. 5,即得殼聚糖溶液；
[0012] (2)厚樸酚或和厚樸酚溶液的配制：將厚樸酚或和厚樸酚溶于無水乙醇中，配制 厚樸酚或和厚樸酚濃度為1. 〇?10. 〇mg/mL的乙醇溶液，然后過濾得到厚樸酚或和厚樸酚 溶液；
[0013] (3)含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球的制備：將步驟（2)所得厚樸酚或和厚樸酚 溶液逐滴加入步驟（1)所得殼聚糖溶液中，并逐滴加入1. 〇?2. Omg/mL的三聚磷酸鈉水 溶液，其中厚樸酚或和厚樸酚溶液、殼聚糖溶液及三聚磷酸鈉水溶液的體積比為1:5:2,在 30?40°C持續(xù)攪拌反應(yīng)10?60min，所得微乳液靜置陳化10?15h，再后處理即得含厚樸 酚或和厚樸酚的納米微球。
[0014] 按上述方案，步驟（1)所述殼聚糖脫乙酰度為82?97%，分子量為10?50萬。
[0015] 按上述方案，步驟（1)所述堿液為濃度lmol/L的NaOH溶液。
[0016] 按上述方案，步驟（1)和步驟（2)所述過濾為采用孔徑為0.45 μ m的微孔濾膜過 濾。
[0017] 按上述方案，步驟（3)所述攪拌速率為800?1600r/min，優(yōu)選攪拌速率為1200r/ min〇
[0018] 優(yōu)選的是，步驟（3)所述三聚磷酸鈉水溶液濃度為1. 2mg/mL。
[0019] 按上述方案，步驟（3)所述后處理包括過濾、透析、真空冷凍干燥。
[0020] 本發(fā)明還提供了上述含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球的應(yīng)用，具體為在制備抗氧 化劑方面的應(yīng)用，及在制備人肝癌細(xì)胞抑制劑方面的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明的有益效果在于：1、本發(fā)明以殼聚糖為載體，三聚磷酸鈉為交聯(lián)劑，泊洛沙 姆188為穩(wěn)定劑，采用離子交聯(lián)法制備含厚樸酚或和厚樸酚的載藥納米微球，改善其水溶 性差，吸收較差的問題，以提高其生物利用度。2、將厚樸酚與和厚樸酚制備成納米微球，改 善了藥物的水溶性，增強(qiáng)了藥物的穩(wěn)定性，提高了藥物的生物利用度，為開發(fā)治療和預(yù)防由 體內(nèi)氧化反應(yīng)引起的心腦血管、糖尿病、癌癥等疾病的新制劑提供了新途徑，并對(duì)開發(fā)中藥 新劑型和實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化具有積極促進(jìn)作用。3、本發(fā)明所提供的制備方法操作簡(jiǎn)單，條件 溫和，重復(fù)性好，制得的納米微球粒徑均一、分散穩(wěn)定，且納米微球中的藥物以分子形式存 在其中，解決了現(xiàn)有制備技術(shù)中存在的有毒物質(zhì)殘留和載藥微球粒徑偏大、粒度分布廣、生 物活性低的問題，可實(shí)現(xiàn)難溶藥物溶解度的增加和生物利用度的提高，并有效提高了難溶 藥物的包封率，可實(shí)現(xiàn)藥物的控釋緩釋，有望在大規(guī)模中藥納米微球的制備上得到應(yīng)用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1所制備的含厚樸酚的納米微球的原子力顯微鏡（AFM)圖；
[0023] 圖2為實(shí)施例2所制備的含厚樸酚的納米微球的AFM圖；
[0024] 圖3為實(shí)施例4所制備的含和厚樸酚的納米微球的AFM圖；
[0025] 圖4為實(shí)施例5所制備的含和厚樸酚的納米微球的AFM圖；
[0026] 圖5是實(shí)施例2和5所制備的含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球清除自由基活性 圖；
[0027] 圖6是實(shí)施例2和5所制備的含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球?qū)θ烁伟┘?xì)胞 0fepG2)存活率關(guān)系圖；
[0028] 圖7是施例5所制備的含和厚樸酚的納米微球的釋放曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 為使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn) 一步詳細(xì)描述。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 本實(shí)施例含厚樸酚的納米微球的制備方法如下：
[0032] (1)殼聚糖溶液的配制：將殼聚糖（脫乙酰度82%，分子量50萬）溶于含有 0.01mg/mL泊洛沙姆188和1.0% (V/V)醋酸的溶劑中，溶劑為含50% (V/V)乙醇的水溶 液，攪拌溶解、過濾，配成殼聚糖濃度為1. 5mg/mL的溶液，然后用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾 膜過濾，所得濾液經(jīng)濃度為lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為4. 5,得到殼聚糖溶液；
[0033] (2)厚樸酚溶液的配制：將厚樸酚溶于無水乙醇中配成濃度為1. Omg/mL的厚樸酚 乙醇溶液，采用孔徑為〇. 45 μ m的微孔濾膜過濾，得到厚樸酚溶液；
[0034] (3)含厚樸酚的納米微球的制備：將lmL步驟⑵所得厚樸酚溶液緩慢加入5mL步 驟（1)所得殼聚糖溶液中，充分?jǐn)嚢瑁〝嚢杷俾蕿?00r/min)，并逐滴加入2mL 1. 0mg/mL的 三聚磷酸鈉水溶液，在40°C持續(xù)攪拌反應(yīng)30min，所得微乳液靜置10h，采用中速定量濾紙 抽濾，再將濾液放入8000?14000截留分子量的透析袋中并在室溫下于超純水中透析3h ; 將透析后的微乳液倒入培養(yǎng)皿中，在_20°C預(yù)凍12h，然后在-50°C真空冷凍干燥24h，即得 含厚樸酚的納米微球。
[0035] 本實(shí)施例所制備的納米微球平均粒徑約為40nm，載藥量為74. 4 μ g/mg，包封率為 78. 12%。
[0036] 附圖1為采用美國(guó)Veeco公司MultiMode?型原子力顯微鏡所觀察到的本實(shí)施例 所得含厚樸酚的納米微球的原子力顯微鏡（AFM)圖。由AFM圖可以看出，制備得到的納米 微球球形規(guī)則，粒徑均一，分散良好，微球平均粒徑約為40nm。
[0037] 實(shí)施例2
[0038] 本實(shí)施例含厚樸酚的納米微球的制備方法如下：
[0039] (1)殼聚糖溶液的配制：將殼聚糖（脫乙酰度97%，分子量10萬）溶于含有 0.03mg/mL泊洛沙姆188和1.0% (V/V)醋酸的溶劑中，溶劑為含20% (V/V)乙醇的水溶 液，攪拌溶解、過濾，配成殼聚糖濃度為1. 〇mg/mL的溶液，然后用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾 膜過濾，所得濾液經(jīng)濃度為lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為4. 0,得到殼聚糖溶液；
[0040] (2)厚樸酚溶液的配制：將厚樸酚溶于無水乙醇中配成濃度為5. 0mg/mL的厚樸酚 乙醇溶液，采用孔徑為〇. 45 μ m的微孔濾膜過濾，得到厚樸酚溶液；
[0041] (3)含厚樸酚的納米微球的制備：將lmL步驟（2)所得厚樸酚溶液緩慢加入5mL步 驟⑴所得殼聚糖溶液中，充分?jǐn)嚢瑁〝嚢杷俾蕿?200r/min)，并逐滴加入2mL 1. 2mg/mL 的三聚磷酸鈉水溶液，在30°C持續(xù)攪拌反應(yīng)60min，所得微乳液采用與實(shí)施例1相同的方法 后處理得含厚樸酚的納米微球。
[0042] 本實(shí)施例所制備的納米微球平均粒徑約為120nm，載藥量為81. 73 μ g/mg，包封率 為 20. 27%。
[0043] 附圖2是本實(shí)施例所制備的含厚樸酚的納米微球的AFM圖。由AFM圖可以看出， 制備得到的載藥微球球形規(guī)則，粒徑均一，分散良好，微球平均粒徑約為120nm。
[0044] 實(shí)施例3
[0045] 本實(shí)施例含厚樸酚的納米微球的制備方法如下：
[0046] (1)殼聚糖溶液的配制：將殼聚糖（脫乙酰度90%，分子量30萬）溶于含有 0.02mg/mL泊洛沙姆188和1.5% (V/V)醋酸的溶劑中，溶劑為含30% (V/V)乙醇的水溶 液，攪拌溶解、過濾，配成殼聚糖濃度為2. 0mg/mL的溶液，然后用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾 膜過濾，所得濾液經(jīng)濃度為lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為4. 0,得到殼聚糖溶液；
[0047] (2)厚樸酚溶液的配制：將厚樸酚溶于無水乙醇中配成濃度為7. 0mg/mL的厚樸酚 乙醇溶液，采用孔徑為〇. 45 μ m的微孔濾膜過濾，得到厚樸酚溶液；
[0048] (3)含厚樸酚的納米微球的制備：將lmL步驟（2)所得厚樸酚溶液緩慢加入5mL步 驟（1)所得殼聚糖溶液中，充分?jǐn)嚢瑁〝嚢杷俾蕿閘〇〇〇r/min)，并逐滴加入2mL 1. 5mg/mL 的三聚磷酸鈉水溶液，在35°C持續(xù)攪拌反應(yīng)30min，所得微乳液采用與實(shí)施例1相同的方法 后處理得含厚樸酚的納米微球。
[0049] 本實(shí)施例所制備的納米微球平均粒徑約為140nm，載藥量為115. 42 μ g/mg，包封 率為 32. 98%。
[0050] 實(shí)施例4
[0051] 本實(shí)施例含和厚樸酚的納米微球的制備方法如下：
[0052] (1)殼聚糖溶液的配制：將殼聚糖（脫乙酰度82%，分子量50萬）溶于含有 0. 05mg/mL泊洛沙姆188和1. 5% (V/V)醋酸的水中，攪拌溶解、過濾，配成殼聚糖濃度為 3. Omg/mL的溶液，然后用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過濾，所得濾液經(jīng)濃度為lmol/L的 NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為3. 5,得到殼聚糖溶液；
[0053] (2)和厚樸酚溶液的配制：將和厚樸酚溶于無水乙醇中配成濃度為10. Omg/mL的 和厚樸酚乙醇溶液，采用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過濾，得到厚樸酚溶液；
[0054] (3)含和厚樸酚的納米微球的制備：將lmL步驟⑵所得和厚樸酚溶液緩慢加入 5mL步驟（1)所得殼聚糖溶液中，充分?jǐn)嚢瑁〝嚢杷俾蕿?600r/min)，并逐滴加入2mL 2mg/ mL的三聚磷酸鈉水溶液，在35°C持續(xù)攪拌反應(yīng)lOmin，所得微乳液采用與實(shí)施例1相同的方 法后處理得含和厚樸酚的納米微球。
[0055] 本實(shí)施例所制備的納米微球平均粒徑約為150nm，載藥量為283. 14 μ g/mg，包封 率為 82. 11%。
[0056] 附圖3是本實(shí)施例所制備的含和厚樸酚的納米微球的AFM圖。由AFM圖可以看出， 納米微球球形較規(guī)則，粒徑均一，分散良好，微球的平均粒徑約為150nm。
[0057] 實(shí)施例5
[0058] 本實(shí)施例含和厚樸酚的納米微球的制備方法如下：
[0059] (1)殼聚糖溶液的配制：將殼聚糖（脫乙酰度97%，分子量10萬）溶于含有 0. 03.g/mL泊洛沙姆188和1.0% (V/V)醋酸的溶劑中，溶劑為含20% (V/V)乙醇的水溶 液，攪拌溶解、過濾，配成殼聚糖濃度為1. 〇mg/mL的溶液，然后用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾 膜過濾，所得濾液經(jīng)濃度為lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為4. 0,得到殼聚糖溶液；
[0060] (2)和厚樸酚溶液的配制：將和厚樸酚溶于無水乙醇中配成濃度為5. Omg/mL的和 厚樸酚乙醇溶液，采用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過濾，得到厚樸酚溶液；
[0061] (3)含和厚樸酚的納米微球的制備：將lmL步驟（2)所得和厚樸酚溶液緩慢加 入5mL步驟（1)所得殼聚糖溶液中，充分?jǐn)嚢瑁〝嚢杷俾蕿?200r/min)，并逐滴加入2mL 1. 2mg/mL的三聚磷酸鈉水溶液，在30°C持續(xù)攪拌反應(yīng)60min，所得微乳液采用與實(shí)施例1相 同的方法后處理得含和厚樸酚的納米微球。
[0062] 本實(shí)施例所制備的納米微球平均粒徑約為130nm，載藥量為240. 64 μ g/mg，包封 率為 59. 68%。
[0063] 附圖4是本實(shí)施例所制備的含和厚樸酚的納米微球的AFM圖。由AFM圖可以看出， 納米微球球形較規(guī)則，粒徑均一，分散良好，微球的平均粒徑約為130nm。
[0064] 實(shí)施例6
[0065] 本實(shí)施例含和厚樸酚的納米微球的制備方法如下：
[0066] (1)殼聚糖溶液的配制：將殼聚糖（脫乙酰度90%，分子量30萬）溶于含有 0. 04mg/mL泊洛沙姆188和1. 2% (V/V)醋酸的水中，攪拌溶解、過濾，配成殼聚糖濃度為 2. Omg/mL的溶液，然后用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過濾，所得濾液經(jīng)濃度為lmol/L的 NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為4. 0,得到殼聚糖溶液；
[0067] (2)和厚樸酚溶液的配制：將和厚樸酚溶于無水乙醇中配成濃度為8. Omg/mL的和 厚樸酚乙醇溶液，采用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過濾，得到厚樸酚溶液；
[0068] (3)含和厚樸酚的納米微球的制備：將lmL步驟（2)所得和厚樸酚溶液緩慢加入 5mL步驟（1)所得殼聚糖溶液中，充分?jǐn)嚢瑁〝嚢杷俾蕿?000r/min)，并逐滴加入2mL 2mg/ mL的三聚磷酸鈉水溶液，在35°C持續(xù)攪拌反應(yīng)60min，所得微乳液采用與實(shí)施例1相同的方 法后處理得含和厚樸酚的納米微球。
[0069] 本實(shí)施例所制備的納米微球平均粒徑約為80nm，載藥量為252. 87 μ g/mg，包封率 為 69. 54%。
[0070] 實(shí)施例7
[0071] 含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球抗氧化活性測(cè)試：
[0072] 將二苯代苦味酰基自由基（DPPH)用無水乙醇配置成lmmol/L的工作液，實(shí)施例1、 實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的載藥納米微球都用無水乙醇配成濃度為0,0. 5, l，2,4,8mg/mL 待用。實(shí)驗(yàn)時(shí)按順序依次加入3. 5mL無水乙醇，400 μ L DPPH ·溶液和100 μ L不同濃度樣 品溶液混合均勻，37°C于暗處振蕩反應(yīng)lh ;3000r/min離心5min，去上清液，使用紫外可見 分光光度計(jì)測(cè)其在517nm處的吸光值，以無水乙醇調(diào)零。實(shí)施例1作為對(duì)照組，結(jié)果表示為 樣品對(duì)DPPH ·自由基的清除率（％ ) = (A。一 Α^/ΧΧ 100% (A。為未加樣品的吸光值，Ai 為加入樣品的吸光值）。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，取平均值。
[0073] 附圖5是實(shí)施例2、5所制備的納米微球清除自由基活性圖。結(jié)果表明，含厚樸酚 或和厚樸酚的納米微球均有較好的清除自由基的能力，且起清除作用的是游離的羥基。載 藥量越高，清除自由基活性越強(qiáng)。
[0074] 實(shí)施例8
[0075] 含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球?qū)θ烁伟┘?xì)胞（HepG2)的細(xì)胞毒性測(cè)試：
[0076] 將實(shí)施例2、5制備的納米微球用二甲亞砜（DMS0)超聲分散，然后用DMEM高糖型 培養(yǎng)液稀釋為lmg/mL溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用；厚樸酚用DMS0溶解后用高糖型DMEM稀釋至80 μ g/ mL ;和厚樸酚用DMS0溶解后用高糖型DMEM稀釋至240 μ g/mL ;所有溶液中DMS0的含量均 為2. 5 %。收集對(duì)數(shù)期HepG2細(xì)胞，以1 X 105個(gè)/mL接種至96孔板中，每孔接種100 μ L ;細(xì) 胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，4、8、16、32、641117孔加入載藥納米微球溶液與（和）厚樸酚溶液，每 個(gè)濃度5孔，每孔最終體積為200 μ L，連續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔避光加入20 μ L MTT (5mg/mL) 溶液，37°C培養(yǎng)4h ;棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100μ L DMS0,37°C恒溫低速振蕩30min，使 用酶標(biāo)儀在490nm處檢測(cè)吸光值。結(jié)果表示為細(xì)胞存活率（％) = (Ai/A^XlOO% (A。為 對(duì)照孔的吸光值A(chǔ)為加藥孔的吸光值）。對(duì)比載藥納米微球和裸藥對(duì)Η印G2細(xì)胞生長(zhǎng)的 抑制作用。所用濃度為微球的濃度，裸藥與微球中所含藥物濃度一致。
[0077] 附圖6是實(shí)施例2、5所制備納米微球及（和）厚樸酚對(duì)人肝癌細(xì)胞（HepG2)存活 率的影響圖。由圖可知，所制備載藥納米微球能有效抑制Η印G2細(xì)胞的生長(zhǎng)，且實(shí)施例2、4 的載藥納米微球?qū)Ζв2細(xì)胞的細(xì)胞毒性均優(yōu)于裸藥。
[0078] 實(shí)施例9
[0079] 含和厚樸酚的納米微球的釋放曲線：
[0080] 稱取5mg含和厚樸酚的納米微球于透析袋中，透析袋內(nèi)加入10mL釋放介質(zhì)，放入 含有100mL釋放介質(zhì)的燒杯中，于37°C、150r/min震蕩，每隔一段時(shí)間取出2mL釋放介質(zhì)， 補(bǔ)充2mL釋放介質(zhì)。取出的釋放介質(zhì)測(cè)其在294nm的紫外吸收值，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算釋放 量，作釋放曲線。釋放介質(zhì)為pH = 1. 2的HC1和pH = 7. 4的磷酸緩沖鹽（PBS)溶液。
[0081] 附圖7是實(shí)施例5所制備的含和厚樸酚的納米微球于pH = 1. 2的HC1和pH = 7. 4的磷酸緩沖鹽（PBS)溶液中的釋放曲線。由圖可知，所制備的載藥納米微球在酸性環(huán)境 下48小時(shí)后釋放達(dá)到80%，在中性環(huán)境下48小時(shí)后釋放達(dá)到95%，具有緩釋效果。
[0082] 實(shí)施例10
[0083] 含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球的動(dòng)態(tài)光散射（DLS)和Zeta電位測(cè)試，采用英國(guó) Malvern儀器公司的Zetasizer Nano儀器，用來說明微球在溶液中的尺寸、多分散性和穩(wěn) 定性。
[0084] 表1是實(shí)施例1、2、4、5所制備的載藥納米微球DLS和Zeta電位表征。
[0085] 表 1
【權(quán)利要求】
1. 一種含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球，其特征在于：該納米微球?yàn)闅ぞ厶桥c三聚磷 酸鈉交聯(lián)形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，厚樸酚或和厚樸酚以分子形式固定其中，厚樸酚或和厚樸 酚的包封率為20. 27?82. 11 %，納米微球的平均粒徑為40?150nm，納米微球粒徑的多分 散系數(shù)為〇· 3?0· 4,載藥量為74. 4?283. 14 μ g/mg，Zeta電位為20?50mV。
2. -種含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球的制備方法，其特征在于步驟如下： (1) 殼聚糖溶液的配制：將殼聚糖溶于含有濃度為〇. 01?〇. 〇5mg/mL的泊洛沙姆188 和體積濃度為1. 〇?1. 5%醋酸的溶劑中，所述的溶劑為水或水與乙醇的混合物，其中乙醇 體積含量不超過50%，攪拌溶解、過濾，配成殼聚糖濃度為1. 0?3. Omg/mL的溶液，然后用 堿液調(diào)節(jié)pH值為3. 5?4. 5,即得殼聚糖溶液； (2) 厚樸酚或和厚樸酚溶液的配制：將厚樸酚或和厚樸酚溶于無水乙醇中，配制厚樸 酚或和厚樸酚濃度為1. 〇?10. Omg/mL的乙醇溶液，然后過濾得到厚樸酚或和厚樸酚溶 液； (3) 含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球的制備：將步驟（2)所得厚樸酚或和厚樸酚溶 液逐滴加入步驟（1)所得殼聚糖溶液中，充分?jǐn)嚢?，并逐滴加?. 〇?2. Omg/mL的三聚 磷酸鈉水溶液，其中厚樸酚或和厚樸酚溶液、殼聚糖溶液及三聚磷酸鈉水溶液的體積比為 1:5:2,在30?40°C持續(xù)攪拌反應(yīng)10?60min，所得微乳液靜置陳化10?15h，再后處理即 得含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球的制備方法，其特征在于步 驟⑴所述殼聚糖脫乙酰度為82?97%，分子量為10?50萬。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球的制備方法，其特征在于步 驟（1)所述堿液為濃度lmol/L的NaOH溶液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球的制備方法，其特征在于步 驟（1)和步驟（2)所述過濾為采用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過濾。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球的制備方法，其特征在于步 驟（3)所述攪拌速率為800?1600r/min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球的制備方法，其特征在于步 驟（3)所述后處理包括過濾、透析、真空冷凍干燥。
8. -種權(quán)利要求1所述的含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球在制備抗氧化劑方面的應(yīng) 用。
9. 一種權(quán)利要求1所述的含厚樸酚或和厚樸酚的納米微球在制備人肝癌細(xì)胞抑制劑 方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/05GK104095817SQ201410350015
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月22日
【發(fā)明者】陳嶸, 王雅萍, 楊浩, 呂中 申請(qǐng)人:武漢工程大學(xué)