一種香菇生物活性肽的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種香菇生物活性肽的制備方法，具體步驟如下：1)香菇足粉中加入6～12倍質(zhì)量的蒸餾水溶解；2)超聲波破碎處理，每kg香菇足粉加入10～20萬國(guó)際單位纖維素酶，調(diào)pH至4.0～5.0，溫度40～50℃，水解60～120min；3)冷卻至室溫，氫氧化鈉調(diào)pH9.5～10.5，5～15℃冷水浴提取20～40min，離心取上清液，減壓濃縮，加無水乙醇至濃度為83％～85％。4℃下靜置60～90min。離心，收集沉淀，烘干得香菇蛋白；4)將香菇蛋白溶于40～60倍質(zhì)量的蒸餾水中，調(diào)pH至6.0～7.0，加入0.2％～0.4％復(fù)合蛋白酶水解，溫度45～55℃，水解150～200min。滅酶，離心，收集濾液；5)用0.22μm的濾膜微濾，超濾，收集相對(duì)分子質(zhì)量在5～10KD的肽段，真空冷凍干燥，得棕色香菇生物活性肽凍干粉末。本發(fā)明制得的香菇生物活性肽具有較好的體外抗氧化活性和醒酒活性。
【專利說明】一種香菇生物活性肽的制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種香菇生物活性肽的制備方法，屬于現(xiàn)代食品加工生物【技術(shù)領(lǐng)域】?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]香燕屬擔(dān)子菌綱(Basidaiomycetes)、傘菌目(Agaricales)、口蘑科(Tricholomataceae)、香燕屬(Lent inus),學(xué)名Lentinus edodes,是我國(guó)久負(fù)盛名的珍貴食用菌。據(jù)分析，干香菇食用部分占72%，每100g食用部分中含水13g、脂肪1.8g、碳水化合物54g、粗纖維7.8g、灰分4.9g、|^ 124mg、磷415mg、鐵25.3mg、維生素BI0.07mg、維生素B21.13mg、尼克酸18.9mg。香燕中的氨基酸十分豐富,構(gòu)成人體蛋白質(zhì)的20種氨基酸,香燕就有18種，其中包含8種人體必需氨基酸，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值是牛肉的4倍。香菇不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且具有很高的藥用價(jià)值。自古以來就被認(rèn)為是延年益壽的珍品，可治療多種疾病。元代《日用草木》記載香菇有益氣、治風(fēng)破血的功能；清代黃富繼的《本草求真》中也有“香菇味甘性平，能益氣、助食及理小便失禁”的記述?，F(xiàn)代研究證明:香菇中香菇多糖、香菇太生、香菇腺嘌呤、香菇生物活性肽等均具有一定的生理功能，如調(diào)節(jié)人體免疫力，抗腫瘤，降血壓、降血脂，促進(jìn)人體新陳代謝，提高機(jī)體免疫力，預(yù)防肥胖癥、結(jié)腸癌、便秘、冠心病等疾病，香菇是不可多得的保健品之一。
[0003]氨基酸彼此以酰胺鍵相互連接形成的化合物稱作肽，對(duì)生物體的生命活動(dòng)有益或具有生理作用的肽類化合物稱為生物活性肽。相對(duì)于蛋白質(zhì)而言，活性肽分子小，生物活性高，少量肽就可以發(fā)揮 重要作用。目前，人們從動(dòng)物、植物和微生物中分離得到了多種生物活性肽，這些活性肽有多種生理功能，如降血壓、調(diào)節(jié)血糖、降血脂、抑制病毒、抗癌等。近年的研究證實(shí)，消化道可以完整的吸收小肽，小腸內(nèi)存在一個(gè)寡肽的吸收通道，因此生物活性肽可以直接被人體吸收。與氨基酸相比，肽的吸收效率更高且不易飽和。常見的生物活性肽有大豆肽、谷胱甘肽、白蛋白肽、魚肉肽、玉米肽、小麥肽、各種乳源肽?！队衩纂牡男丫苹钚泽w外試驗(yàn)及其醒酒機(jī)理研究》(《中國(guó)糧油學(xué)報(bào)》，2008年第23卷第5期，2008/9，P54-58，隋玉杰等)中針對(duì)玉米肽對(duì)ADH的激活率及對(duì).0H的抑制率進(jìn)行的研究探討，并對(duì)玉米肽的醒酒機(jī)理進(jìn)行深入報(bào)道。研究表明，體外測(cè)定玉米肽對(duì)ADH的激活率及對(duì).0Η的抑制率，兩者基本上是正相關(guān)關(guān)系。而文中并未指出醒酒肽的相對(duì)分子質(zhì)量，未進(jìn)行其他抗氧化活性的研究以及未深入研究玉米肽對(duì)ALDH的影響。
[0004]香菇生物活性肽，又稱香菇低聚肽。是以香菇足粉為原料，酶解后獲得的低相對(duì)分子質(zhì)量肽產(chǎn)物。低聚肽吸收速度快、耗能低、易于被人體消化、吸收和利用，具有抗氧化、抗疲勞、醒酒護(hù)肝等重要的生理活性。《復(fù)合酶法水解香菇工藝的研究》(《微生物學(xué)通報(bào)》，2012年第39卷第一期，2011/9，Ρ62-67，陳海強(qiáng)等)中研究了復(fù)合酶法水解香菇的工藝條件，并計(jì)算出此法所得香菇水解液的水解度。《雙酶法水解香菇蛋白的工藝研究》(《食品科技》，2003年第12期，2003/8，Ρ14-16，聞?dòng)麜缘?中研究了纖維素酶和枯草桿菌中性蛋白酶共同水解香菇蛋白的工藝，確定了兩種酶的水解條件。以上研究只是簡(jiǎn)單探索了香菇生物活性肽的水解工藝，得到香味濃郁的香菇蛋白水解液。并未對(duì)香菇生物活性肽進(jìn)一步分離，研究其生物活性。
[0005]目前國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的專利200710061492.5 “香菇抽提物的生產(chǎn)工藝”、200810013119.7 “具有抗腫瘤活性的香菇發(fā)酵純蛋白、提取方法及其制劑”、200810183845.3 “從香菇足粉中綜合提取多種生物活性成分的方法”、2009101937.7 “一種香菇生物活性肽粉的制備方法”、201110230360.7 “一種多肽菌菇精的制備方法”、201110314779.0 “從香菇中提取具有抗氧化降血糖作用的活性蛋白的方法”等，大部分是將香菇粉用蛋白酶酶解的方法制備成香菇抽提物、調(diào)味劑或是含有香菇生物活性肽的飲品。制備具有生物活性的香菇蛋白，而很少將香菇生物活性肽提純，并研究某一相對(duì)分子質(zhì)量肽段的生物活性。中國(guó)專利申請(qǐng)201110155206.8“香菇生物活性肽的制備方法和用途”，公開了一種香菇生物活性肽的制備方法，包括前處理、酶解、脫色、超濾、干燥得到香菇生物活性肽。所制得香菇生物活性肽粉純度為50%以上，具有抗疲勞作用。本發(fā)明采用超聲波輔助纖維素酶解方法，首先提取香菇蛋白，并首次公開利用Protamex蛋白酶(諾維信公司購(gòu)買)酶解香菇蛋白制取香菇生物活性肽的最佳工藝，通過對(duì)比不同相對(duì)分子質(zhì)量肽段的抗氧化活性及不同濃度香菇生物活性肽的體外醒酒活性，挑選出活性最高肽段，制備出一種具有抗氧化活性及醒酒活性的香菇生物活性肽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于針對(duì)之前發(fā)明的不足，提供一種以香菇足粉為原料，制備具有醒酒、抗氧化功能香菇生物活性肽的方法。本發(fā)明的香菇生物活性肽具有純度高、相對(duì)分子質(zhì)量已知、吸收利用率高等特點(diǎn)。 [0007]本發(fā)明制備方法的技術(shù)方案包括:超聲波破碎技術(shù)輔助纖維素酶提取香燕內(nèi)容物，乙醇沉淀香菇蛋白，用Protamex蛋白酶酶解制備香菇生物活性肽，純化香菇生物活性肽，檢測(cè)不同相對(duì)分子質(zhì)量香菇生物活性肽的醒酒、抗氧化活性。最終制備高純度、高活性，具有醒酒、抗氧化功能的香菇生物活性肽。
[0008]具體說，本發(fā)明研究一種香菇生物活性肽的制備方法，步驟如下:
[0009]I)溶解:稱取一定量香菇足粉，加入6~12倍質(zhì)量的蒸餾水溶解，并充分?jǐn)嚢瑁?br> [0010]2)破壁:將香菇水溶液超聲波破碎處理15~25min，按照每kg香菇足粉加入10~20萬國(guó)際單位纖維素酶,調(diào)pH至4.0~5.0,加熱溫度至40~50°C,水解60~120min ；
[0011]3)制取香菇蛋白:冷卻至室溫，加入氫氧化鈉將pH調(diào)至9.5~10.5，在5~15°C冷水浴中提取20~40min，離心，取上清液，減壓濃縮，加入無水乙醇至濃度為83%~85%沉淀，冰水浴。在4°C條件下靜置60~90min。離心棄去上清液，收集沉淀，40~50°C烘干，得香菇蛋白；
[0012]4)酶解:將香菇蛋白溶于40~60倍蒸餾水中，調(diào)pH至6.0~7.0，加入0.2%~
0.4% Protamex蛋白酶水解，溫度保持在45~55°C，水解150~200min。滅酶后降至室溫。離心，收集濾液；
[0013]5)獲取香菇生物活性肽:用孔徑大小為0.22tm的濾膜微濾，得淺黃色澄清液體，用不同濾膜超濾，收集相對(duì)分子質(zhì)量在5~IOKD的肽段，真空冷凍干燥，得棕色香菇生物活性肽凍干粉末。
[0014]其中，香菇足粉的水解度隨著料液比的增加而增加，綜合考慮水解程度及濃縮的方便，在一個(gè)特別優(yōu)選的方案中，料液比為1: 6~1: 10 (m/m)，首選，料液比為1: 8~1: 10(m/m)。
[0015]超聲波在食品加工中的應(yīng)用越來越廣泛，在液體中它可以產(chǎn)生空化作用，由空化作用產(chǎn)生的沖擊波和射流又可破壞細(xì)胞和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而增加細(xì)胞內(nèi)容物通過細(xì)胞膜的穿透力和傳輸能力?？商岣呦愎降鞍踪|(zhì)提取率。香菇細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較堅(jiān)實(shí)，細(xì)胞內(nèi)容物不易流出，通過超聲方法可以增加內(nèi)容物的流出，同時(shí)使用纖維素酶水解細(xì)胞壁組成物質(zhì)，可以最大程度獲得香菇蛋白，最終獲得香菇醒酒活性肽。
[0016]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，將香燕水溶液超聲處理15~20min,在處理后的溶液中按照每kg香菇足粉加入10~20萬國(guó)際單位纖維素酶，調(diào)pH至4.5~5.0，加熱溫度至45~50°C，水解60~120min。
[0017]香菇蛋白可溶解于堿液中，堿液提取之后，還需將其沉淀出來。蛋白質(zhì)的沉淀方法有酸沉淀法、硫酸銨沉淀法、乙醇沉淀法和丙酮沉淀法，其中乙醇沉淀法的安全性較好且成本較低，隨著乙醇濃度的增大，沉淀的蛋白越多，但是多糖也被沉淀下來。當(dāng)乙醇濃度大于80 %后，蛋白沉淀量要大于多糖沉淀量，因此可選擇83 %~85 %作為蛋白的沉淀濃度。
[0018]對(duì)于一些具有熱敏性的原料，想要將其濃縮使溶液體積減小，一般采用減壓濃縮的方法，減壓濃縮的溫度根據(jù)濃縮過程中溶液的沸騰情況而定，減壓濃縮的時(shí)間根據(jù)所需要的溶液體積而定。
[0019]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，將水解液冷卻至室溫，加入氫氧化鈉將pH調(diào)至 9.5~10.0，在8~15°C冷水浴中提取20~40min，離心，取上清液；減壓濃縮，減壓濃縮的溫度和時(shí)間無特定要求，要根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程中液體的沸騰情況以及所需的液體量而定；加入無水乙醇至濃度為83%~85%沉淀，冰水浴。在4°C條件下靜置60~90min。離心棄去上清液，收集沉淀，45~50°C烘干，得香菇蛋白。
[0020]本發(fā)明中對(duì)于制備香菇蛋白的烘干時(shí)間無特殊要求，香菇蛋白中含水量盡量少即可。
[0021 ] 在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，將香菇蛋白溶于40~60倍質(zhì)量的蒸餾水中，調(diào)pH至6.5~7.0，酶量為0.3%~0.4%加入Protamex蛋白酶水解，溫度保持在45~50°C，水解150~180min。滅酶，降至室溫。離心，收集濾液。
[0022]用孔徑大小為0.22 μ m的濾膜微濾，得淺黃色澄清液體，用不同孔徑的濾膜超濾，收集相對(duì)分子質(zhì)量在5~IOKD的肽段，真空冷凍干燥，得香菇生物活性肽。
[0023]本發(fā)明中對(duì)離心步驟的轉(zhuǎn)速不做要求，不過不要過高，避免溫度升高影響香菇生物活性肽的生物活性。
[0024]本發(fā)明的香菇醒酒活性肽具有生物吸收快的有益效果。研究表明，人體攝入的蛋白主要是以多肽形式從腸道直接吸收。與蛋白質(zhì)和氨基酸相比，小分子短肽的吸收效率更高且不易飽和，例如二肽和三肽的吸收速度高于同一組成的氨基酸。小腸粘膜上短肽載體的發(fā)現(xiàn)以直接證據(jù)證實(shí)了二肽和三肽能被完整吸收的觀點(diǎn)。研究認(rèn)為，動(dòng)物體內(nèi)對(duì)蛋白酶解產(chǎn)物的氨基酸吸收強(qiáng)度比相應(yīng)游離氨基酸高70-80%。短肽載體的吸收能力可能高于各種氨基酸載體吸收能力的總和?，F(xiàn)有技術(shù)制備的香菇生物活性肽可以將香菇蛋白水解成相對(duì)分子質(zhì)量在5~10KD，有利于人體的吸收利用。
[0025]本發(fā)明的香菇生物活性肽，具有明顯的抗氧化活性，顯著提高ADH和ALDH激活率，可以提高酒精在體內(nèi)的代謝速率，具有顯著的醒酒效果。結(jié)合香菇生物活性肽醒酒活性及小分子活性肽的易被吸收利用率優(yōu)勢(shì)，是具有增強(qiáng)生物吸收和醒酒效果的新型醒酒劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1香菇生物活性肽的提取工藝圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下結(jié)合圖表和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但不限制本發(fā)明的范圍。
[0028]實(shí)施例1
[0029]溶解:稱取5.0g香菇足粉置于反應(yīng)器中，加入45g蒸餾水溶解并充分?jǐn)嚢?，得到香菇水溶液?br> [0030]破壁:超聲波破碎處理20min,加入500國(guó)際單位纖維素酶,調(diào)pH至4.5,加熱溫度至 45°C,水解 60min ；
[0031]沉淀:冷卻至室溫，加入氫氧化鈉將pH調(diào)至10，在10°C冷水浴中提取30min，離心，取上清液；在真空濃縮設(shè)備中減壓濃縮，溫度為44°C，90min ;加入無水乙醇至濃度為83%沉淀，冰水浴。在4°C條件下靜置60min。離心棄去上清液，收集沉淀，40°C烘干，得香菇蛋白:
[0032]酶解:將香燕蛋白溶于50倍蒸懼水中，單位為g。調(diào)pH至6.5,加入0.01g Protamex蛋白酶，溫度保持在50°C，水解180min。95°C滅酶，降至室溫；離心，收集濾液；
[0033]獲取香菇生物活性肽:用孔徑大小為0.22 μ m的濾膜微濾，得淺黃色澄清液體，用5KD和IOKD濾膜超濾，收集相對(duì)分子質(zhì)量在5~IOKD的肽段，真空冷凍干燥，得香菇生物活性肽。
[0034]實(shí)施例2
[0035]溶解:稱取10.0kg香菇足粉置于反應(yīng)器中，加入IOOkg蒸餾水溶解并充分?jǐn)嚢?，得到香菇水溶液?br> [0036]破壁:超聲波破碎處理20min，加入200萬國(guó)際單位纖維素酶，調(diào)pH至5.0，加熱溫度至50°C，水解90min ；
[0037]沉淀:冷卻至室溫，加入氫氧化鈉將pH調(diào)至10左右，在8°C冷水浴中提取40min，離心，取上清液；在真空濃縮設(shè)備中減壓濃縮，溫度為45°C，120min ;加入無水乙醇至濃度為85%沉淀，冰水浴。在4°C條件下靜置90min。離心棄去上清液，收集沉淀，45°C烘干，得香菇蛋白；
[0038]酶解:將香菇蛋白溶于60倍蒸餾水中，單位為g。調(diào)pH至6.5左右，加入40gProtamex蛋白酶,溫度保持在55°C,水解200min。95°C滅酶15min,降至室溫；離心，收集濾液；
[0039]獲取香菇生物活性肽:用孔徑大小為0.22 μ m的濾膜微濾，得淺黃色澄清液體，采用中空纖維超濾膜對(duì)濾液超濾，選用合適孔徑大小的濾膜，收集相對(duì)分子質(zhì)量在5~IOKD的肽段，真空冷凍干燥，得香菇生物活性肽。
[0040] 實(shí)施例3[0041]通過查閱文獻(xiàn)得出木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、Protamex蛋白酶、胰蛋白酶水解蛋白質(zhì)的最佳實(shí)驗(yàn)條件，用以上四種酶分別水解等量的香菇足粉、傘粉、全粉，用甲醛滴定法檢測(cè)每一種水解物的水解度，結(jié)果如表1所示。
[0042]表1四種酶對(duì)香菇傘粉、全粉、足粉水解度比較
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種香菇生物活性肽制備的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟: ①溶解:稱取一定量香菇足粉，加入6~12倍質(zhì)量的蒸餾水溶解，并充分?jǐn)嚢瑁? ②破壁:將香菇水溶液超聲波破碎處理15~25min，按照每kg香菇足粉加入10~20萬國(guó)際單位纖維素酶，調(diào)pH至4.0~5.0,加熱溫度至40~50°C,水解60~120min ； ③制取香菇蛋白:冷卻至室溫，加入氫氧化鈉將PH調(diào)至9.5~10.5，在5~15°C冷水浴中提20~40min，離心，取上清液，減壓濃縮，加入無水乙醇至濃度為83%~85 %，沉淀，冰水浴，在4°C條件下靜置60~90min，離心棄去上清液，收集沉淀，40~50°C烘干，得香菇蛋白； ④酶解:將香菇蛋白溶于40~60倍質(zhì)量的蒸餾水中，調(diào)pH至6.0~7.0，加入0.2 %~0.4% Protamex蛋白酶水解，溫度保持在45~55°C，水解150~200min，滅酶后降至室溫，離心，收集濾液； ⑤獲取香菇生物活性肽:用孔徑大小為0.22 μ m的濾膜微濾，得淺黃色澄清液體，用不同濾膜超濾，收集相對(duì)分子質(zhì)量在5~IOKD的肽段，真空冷凍干燥，得棕色香菇生物活性肽凍干粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于:步驟①在一個(gè)特別優(yōu)選的方案中，料液比為 1: 6 ~1: 10(m/m)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于:步驟①在一個(gè)特別優(yōu)選的方案中，料液比為 1: 8 ~1: 10(m/m)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于:步驟②采用超聲波破碎輔助纖維素酶水解香燕水溶液，超聲波破碎處理15~20min,按照每kg香燕足粉加入10~20萬國(guó)際單位纖維素酶，調(diào)pH至4.5~5.0，加熱溫度至45~50°C，水解60~120min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于:步驟④中將香菇蛋白水溶液調(diào)pH至6.5~7.0，加入0.3%~0.4% Protamex蛋白酶水解，溫度保持在45~50°C，水解150~180mino
6.一種香菇蛋白的制備方法，其特征在于:按照權(quán)利要求1所述步驟③制備香菇蛋白。
7.一種按照權(quán)利要求1所述的方法制取的香菇生物活性肽，其特征在于:該香菇生物活性肽具備體外抗氧化和醒酒活性。
8.一種按照權(quán)利要求1所述制備方法制作的香菇生物活性肽，其特征在于:此香菇生物活性肽可應(yīng)用于抗氧化、醒酒功能食品或營(yíng)養(yǎng)保健制品。
【文檔編號(hào)】A61P25/32GK104004813SQ201410267204
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】任迪峰, 楊宇迪, 程湛, 匡綺蓉, 魯軍, 任劍 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)