亞臨界二氧化碳燒結(jié)共載細胞多孔微球支架的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種亞臨界二氧化碳燒結(jié)共載細胞多孔微球支架的方法，以碳酸氫銨水溶液作為水相，PLGA的有機溶液作為油相，將上述水相分散到油相中，通過均質(zhì)勻化形成油包水的單乳液；將上述單乳液分散到PVA水溶液中得到水包油包水的復(fù)乳；繼續(xù)攪拌使二氯甲烷揮發(fā)，得到固化的多孔微球；收集固化的多孔微球，洗滌，凍干；將凍干的多孔微球與一定數(shù)量的細胞共同填入模具中，在亞臨界二氧化碳的條件下，燒結(jié)成多孔微球支架。本發(fā)明在溫和的條件下，通過一步法獲得共載細胞多孔微球燒結(jié)支架，確保微球表面多孔形貌的同時，保證細胞活性。
【專利說明】亞臨界二氧化碳燒結(jié)共載細胞多孔微球支架的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及三維組織工程支架的制備方法，具體地說是涉及一種亞臨界二氧化碳燒結(jié)共載細胞多孔微球支架的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)前國內(nèi)外研究較成熟的組織構(gòu)建思路是自上而下(Top-down)的方式，即先制備仿生支架，再將種子細胞接種到支架材料上，通過灌注技術(shù)、添加生長因子、機械刺激等手段進行組織構(gòu)建。主要制備方法包括:溶劑澆鑄法，相分離/冷凍干燥法，纖維粘接法，三維打印，熔融成型法等。這種構(gòu)建方式存在的主要問題為:有機溶劑殘留量高，生物活性因子易失活，細胞相容性差。更重要的是無法精確控制細胞的生長規(guī)律，難以形成復(fù)雜微結(jié)構(gòu)特征的組織。而模塊化組織工程的構(gòu)建思路為自下而上(Bottom-up)的方式，模擬天然情況下的人的機體，許多組織就是由小的組織塊形成，如:肌纖維束形成肌肉，肝小葉構(gòu)成肝臟等，通過對微結(jié)構(gòu)特征的設(shè)計形成擬生態(tài)微結(jié)構(gòu)單元以構(gòu)建模塊化結(jié)構(gòu)，再用以構(gòu)建大塊組織。
[0003]燒結(jié)微球支架技術(shù)正是利用模塊化思想，進行組織構(gòu)建。首先制備出不同組分特征的單個微球體，再利用不同燒結(jié)方式對材料塑化，使微球間彼此黏結(jié)在一起，形成支架，常見的燒結(jié)方式有熱燒結(jié)，溶劑燒結(jié)等。基本原理為通過高溫或者溶劑將微球表面熔解，使相鄰的微球分子鏈纏繞，當(dāng)溫度降低或有機溶劑揮發(fā)后，聚合物分子鏈重新固化，形成永久性黏結(jié)°Aronin等(Aronin CEP, Sadik Kff, Lay AL, et al.Comparative effects of scaffoldpore size,pore volume, and total void volume on cranial bone healing patternsusing microsphere-based scaffolds.Journal of Biomedical Materials ResearchPart A, 2009, 89 (3): 632-641)以聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly (lactic-co-glycolicacid), PLGA)為材料，在銅質(zhì)模具中80 °C燒結(jié)3h，制備實心微球燒結(jié)支架；Shi等(Shi X，Wang Y, Varshney RR, et al.Microsphere-based drug releasing scaffolds forinducing osteogenesis of human mesenchymal stem cells in vitr0.European Journal ofPharmaceutical Sciences, 2010, 39 (1-3): 59-67)用 PLGA 包封地塞米松，β -甘油憐酸鹽和抗壞血酸，以丙酮/乙醇混合溶劑為燒結(jié)劑，制備出了共載三種藥物的實心微球組分支架。然而高溫與有機溶劑不僅不利于蛋白類藥物的活性，且殘留的有機溶劑難以去除，細胞相容性差。雖然人們嘗試其他方法制備PLGA微球支架，如王迎軍等(CN103212116A)公開了一種常溫低壓干燥法制備PLGA多孔微球支架的方法；D Michael等(US8669107B2)公開了一種亞臨界燒結(jié)共載細胞PLGA微球支架的方法，但都無法實現(xiàn)在保證微球表面形貌的前提下能夠共載細胞，或者在共載細胞的情況下，為細胞提供更多黏附位點，使細胞向單個微球單元內(nèi)部生長，避免由于傳質(zhì)受阻，造成血管化再生受阻和細胞凋亡的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供了一種亞臨界二氧化碳燒結(jié)共載細胞多孔微球支架的方法，實現(xiàn)了共載細胞多孔微球支架的一步構(gòu)建，減少了傳統(tǒng)支架需要二次接種細胞的步驟，避免了高溫及有機溶劑的影響，在保留微球表面形貌的同時，還能保證細胞向微球內(nèi)部生長，并保持活性。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是:
[0006]一種亞臨界二氧化碳燒結(jié)共載細胞多孔微球支架的方法，包括:
[0007]a)將PLGA添加到有機溶劑二氯甲烷中，通過攪拌獲得均勻的油相；
[0008]b)將碳酸氫銨添加到蒸餾水中，通過攪拌獲得均勻的水相，其中碳酸氫銨濃度為5% ~20% (w/v)；
[0009]c)將步驟b得到的水相分散到步驟a得到的油相中，通過均質(zhì)勻化作用，形成油包水的單乳液，其中水相與油相的體積比為l/ι~1/20 ；
[0010]d)在100~1000rpm攪拌速率下，將步驟c獲得的單乳液分散到PVA水溶液中得到水包油包水的復(fù)乳液；
[0011]e)以步驟d中攪拌速率繼續(xù)攪拌乳液2~12h，使油相中的二氯甲烷揮發(fā)，得到固化的多孔微球；
[0012]f)收集固化的多孔微球，用去離子水洗滌，隨后凍干；
[0013]g)將凍干的多孔微球與2X IO4~2X IO7個細胞或50~1000 μ L含有2X IO4~2X IO7個細胞的細胞懸液共同填入模具中，在壓力為0.5~7.38MPa，溫度為20~40°C的亞臨界二氧化碳條件下處理10~1800s，燒結(jié)成共載細胞多孔微球支架。
[0014]一實施例中:步驟a中，所述油相中PLGA的濃度為1%~15% (w/v)，PLGA分子量為20~lOOkDa，PLGA中LA與GA之摩爾比為25/75~75/25。
[0015]一實施例中:步驟c中，所述均質(zhì)勻化的條件為:攪拌速率3000~15000rpm,攪拌時間2~IOmin。
[0016]一實施例中:步驟d中，所述PVA水溶液中，PVA濃度為0.1 %~2 % (w/v)。
[0017]一實施例中:所述PLGA用PCL或PLA-PET中的一種取代。
[0018]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是:
[0019]一種亞臨界二氧化碳燒結(jié)共載微生物多孔微球支架的方法，包括:
[0020]a)將PLGA添加到有機溶劑二氯甲烷中，通過攪拌獲得均勻的油相；
[0021]b)將碳酸氫銨添加到蒸餾水中，通過攪拌獲得均勻的水相，其中碳酸氫銨濃度為5% ~20% (w/v)；
[0022]c)將步驟b得到的水相分散到步驟a得到的油相中，通過均質(zhì)勻化作用，形成油包水的單乳液，其中水相與油相的體積比為1/1~1/20 ；
[0023]d)在100~1000rpm攪拌速率下，將步驟c獲得的單乳液分散到PVA水溶液中得到水包油包水的復(fù)乳液；
[0024]e)以步驟d中攪拌速率繼續(xù)攪拌乳液2~12h，使油相中的二氯甲烷揮發(fā)，得到固化的多孔微球；
[0025]f)收集固化的多孔微球，用去離子水洗滌，隨后凍干；
[0026]g)將凍干的多孔微球與2X IO4~2X IO7個微生物或50~1000 μ L含有2X IO4~
2X IO7個微生物的微生物懸液共同填入模具中，在壓力為0.5~7.38MPa，溫度為20~40°C的亞臨界二氧化碳條件下處理10~1800s,燒結(jié)成共載微生物多孔微球支架。[0027]本發(fā)明中所述模具均為現(xiàn)有市場上可購買或訂制的產(chǎn)品。
[0028]本技術(shù)方案與【背景技術(shù)】相比，它具有如下優(yōu)點:
[0029]1.本發(fā)明所提供的一種亞臨界二氧化碳燒結(jié)共載細胞多孔微球支架的方法，實現(xiàn)了一步法制備共載細胞多孔微球支架，帶來如下技術(shù)效果:a)與傳統(tǒng)技術(shù)中先燒結(jié)支架再二次接種細胞相比，本發(fā)明步驟更簡潔，操作更簡便山)傳統(tǒng)技術(shù)中二次接種細胞后，細胞無法向內(nèi)生長，容易產(chǎn)生傳質(zhì)受阻，造成血管化再生受阻和細胞凋亡，從而引起組織壞死；而本發(fā)明中共載細胞與燒結(jié)支架一步到位，細胞在燒結(jié)支架時即進入支架內(nèi)部，可在支架的表面及內(nèi)部同時存活并生長，避免了傳質(zhì)受阻的問題；c)相比傳統(tǒng)實心微球燒結(jié)支架，多孔微球燒結(jié)支架具有較高的孔隙率，利于傳質(zhì)與細胞增殖，而且多孔微球較高的比表面積為細胞附著提供更多的位點，利于高效構(gòu)建組織。
[0030]2.本發(fā)明所提供的一種亞臨界二氧化碳燒結(jié)共載細胞多孔微球支架的方法，不采用高溫及有機溶劑，避免了對微球表面形貌的破壞，且無有機溶劑殘留，不影響細胞生長活性；由于不存在高溫過程和有機溶劑的使用，本發(fā)明也可推廣應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，不會對藥物活性及安全性產(chǎn)生影響。
[0031]3.本發(fā)明所提供的一種亞臨界二氧化碳燒結(jié)共載細胞多孔微球支架的方法，以亞臨界二氧化碳作為燒結(jié)劑，易揮發(fā)，無殘留，無污染，相比現(xiàn)有技術(shù)更為清潔環(huán)保。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0033]圖1為實施例1制備的多孔微球表面形貌圖。
[0034]圖2為實施例1制備的多孔微球支架形貌圖。
[0035]圖3為實施例2制備的共載細胞多孔微球表面形貌圖。
[0036]圖4為實施例2制備的共載細胞多孔微球支架形貌圖。
[0037]圖5為實施例2制備的共載細胞多孔微球支架激光共聚焦顯微鏡照片，圖中白色箭頭標(biāo)示為經(jīng)過亞臨界二氧化碳燒結(jié)后，活性良好的細胞。
[0038]圖6為實施例3制備的共載細胞多孔微球支架激光共聚焦顯微鏡照片，圖中白色箭頭標(biāo)示為經(jīng)過亞臨界二氧化碳燒結(jié)后，活性良好的細胞。
【具體實施方式】
[0039]下面通過實施例具體說明本發(fā)明的內(nèi)容:
[0040]實施例1
[0041]具體實施步驟如下:
[0042]a)室溫下，將PLGA添加到有機溶劑二氯甲烷中，通過攪拌獲得均勻的油相，其中PLGA的濃度為6.25% (w/v)，PLGA分子量為40kDa，PLGA中LA(乳酸)與GA(羥基乙酸)之摩爾比為50/50 ；
[0043]b)將碳酸氫銨添加到蒸餾水中，通過攪拌獲得均勻的水相，其中碳酸氫銨濃度為10% (w/v)；
[0044] c)將步驟b得到的水相2.5ml分散到步驟a得到的油相15ml中,通過均質(zhì)勻化作用，形成油包水的單乳液，其中水相與油相的體積比為1/6 ;所述均質(zhì)勻化的條件為:攪拌速率8000rpm,攬拌時間4min ；
[0045]d)在200rpm攪拌速率下，將步驟c獲得的單乳液分散到體積為400ml的0.5 %(w/v)的PVA(聚乙烯醇)水溶液中得到水包油包水的復(fù)乳液；
[0046]e)以200rpm攪拌速率繼續(xù)攪拌乳液4h，使油相中的二氯甲烷揮發(fā)，得到固化的多孔微球；
[0047]f)收集固化的多孔微球，用去離子水洗滌3次，隨后凍干48h，得到表面形貌良好干燥的多孔PLGA微球；
[0048]g)將凍干的多孔微球填入聚四氟乙烯模具中，在壓力為2MPa，溫度為25°C的亞臨界二氧化碳條件下處理lOmin，燒結(jié)成多孔微球支架，請查閱圖1-2，得到的多孔微球支架表面形貌良好，平均孔徑大于20 μ m。
[0049]實施例2
[0050]具體實施步驟如下:
[0051]a)室溫下，將PLGA添加到有機溶劑二氯甲烷中，通過攪拌獲得均勻的油相，其中PLGA的濃度為6.25% (w/v)，PLGA分子量為40kDa, PLGA中LA與GA之摩爾比為50/50 ；
[0052]b)將碳酸氫銨添加到蒸餾水中，通過攪拌獲得均勻的水相，其中碳酸氫銨濃度為10% (w/v)；
[0053]c)將步驟b得到的水相2.5ml分散到步驟a得到的油相12.5ml中,通過均質(zhì)勻化作用，形成油包水的單乳液，其中水相與油相的體積比為1/5 ;所述均質(zhì)勻化的條件為:攪拌速率8000rpm,攪拌時間4min ；
[0054]d)在200rpm攪拌速率下，將步驟c獲得的單乳液分散到體積為400ml的0.5 %(w/v)的PVA水溶液中得到水包油包水的復(fù)乳液；
[0055]e)以200rpm攪拌速率繼續(xù)攪拌乳液4h，使油相中的二氯甲烷揮發(fā)，得到固化的多孔微球；
[0056]f)收集固化的多孔微球，用去離子水洗滌3次，隨后凍干48h，得到表面形貌良好干燥的多孔PLGA微球；
[0057]g)將凍干的多孔微球與IX IO6個鼠成纖維細胞混合均勻，共同填入聚四氟乙烯模具中，在壓力為3MPa，溫度為25°C的亞臨界二氧化碳條件下處理4min，燒結(jié)成共載細胞多孔微球支架，請查閱圖3-4，得到的多孔微球支架表面形貌良好；隨后將支架通過AO/EB (吖啶橙/溴化乙錠)染色，并用激光共聚焦顯微鏡檢測細胞活性，檢測結(jié)果如圖5所示，圖中白色箭頭標(biāo)示為活性良好的細胞。由此可見，本發(fā)明通過一步法獲得共載細胞多孔微球燒結(jié)支架，在確保微球表面多孔形貌的同時，還能保證細胞活性。
[0058]實施例3
[0059]具體實施步驟如下:
[0060]a)室溫下，將PLGA添加到有機溶劑二氯甲烷中，通過攪拌獲得均勻的油相，其中PLGA的濃度為6.25% (w/v)，PLGA分子量為40kDa, PLGA中LA與GA之摩爾比為50/50 ；
[0061]b)將碳酸氫銨添加到蒸餾水中，通過攪拌獲得均勻的水相，其中碳酸氫銨濃度為10% (w/v)；
[0062]c)將步驟b得到的水相2.5ml分散到步驟a得到的油相8ml中，通過均質(zhì)勻化作用，形成油包水的單乳液，其中水相與油相的體積比為1/3.2 ;所述均質(zhì)勻化的條件為:攪拌速率5000rpm，攪拌時間3min ；
[0063]d)在200rpm攪拌速率下，將步驟c獲得的單乳液分散到體積為400ml的0.1 %(w/v)的PVA水溶液中得到水包油包水的復(fù)乳液；
[0064]e)以200rpm攪拌速率繼續(xù)攪拌乳液4h，使油相中的二氯甲烷揮發(fā)，得到固化的多孔微球；
[0065]f)收集固化的多孔微球，用去離子水洗滌3次，隨后凍干48h，得到表面形貌良好干燥的多孔PLGA微球；
[0066]g)將凍干的多孔微球與含有2X IO6個鼠成纖維細胞的500 μ I細胞懸液混合均勻，共同填入聚四氟乙烯模具中，在壓力為3MPa，溫度為25°C的亞臨界二氧化碳條件下處理2min，燒結(jié)成共載細胞多孔微球支架；隨后將其轉(zhuǎn)入Iml的培養(yǎng)基中，通過Α0/ΕΒ染色，并用激光共聚焦顯微鏡檢測細胞活性，檢測結(jié)果如圖6所示，圖中白色箭頭標(biāo)示為活性良好的細胞。由此可見，本發(fā)明通過一步法獲得共載細胞多孔微球燒結(jié)支架，細胞活性良好。
[0067]實施例4
[0068]具體實施步驟如下:
[0069]a)室溫下，將PLGA添加到有機溶劑二氯甲烷中，通過攪拌獲得均勻的油相，其中PLGA的濃度為I % (w/v)，PLGA分子量為lOOkDa，PLGA中LA與GA之摩爾比為75/25 ；
[0070]b)將碳酸氫銨添加到蒸餾水中，通過攪拌獲得均勻的水相，其中碳酸氫銨濃度為20% (w/v)；
[0071]c)將步驟b得到的水相2.5ml分散到步驟a得到的油相50ml中,通過均質(zhì)勻化作用，形成油包水的單乳液，其中水相與油相的體積比為1/20 ;所述均質(zhì)勻化的條件為:攪拌速率15000rpm，攪拌時間2min ；
[0072]d)在1000rpm攪拌速率下，將步驟c獲得的單乳液分散到體積為400ml的2% (w/V)的PVA水溶液中得到水包油包水的復(fù)乳液；
[0073]e)以1000rpm攪拌速率繼續(xù)攪拌乳液2h，使油相中的二氯甲烷揮發(fā)，得到固化的多孔微球；
[0074]f)收集固化的多孔微球，用去離子水洗滌3次，隨后凍干48h，得到表面形貌良好干燥的多孔PLGA微球；
[0075]g)將凍干的多孔微球與含有2X IO4個鼠成纖維細胞的50 μ I細胞懸液混合均勻，共同填入聚四氟乙烯模具中，在壓力為0.5MPa，溫度為20°C的亞臨界二氧化碳條件下處理30min，燒結(jié)成共載細胞多孔微球支架。
[0076]實施例5
[0077]具體實施步驟如下:
[0078]a)室溫下，將PLGA添加到有機溶劑二氯甲烷中，通過攪拌獲得均勻的油相，其中PLGA的濃度為15% (w/v)，PLGA分子量為20kDa，PLGA中LA與GA之摩爾比為25/75 ；
[0079]b)將碳酸氫銨添加到蒸餾水中，通過攪拌獲得均勻的水相，其中碳酸氫銨濃度為5% (w/v)；
[0080]c )將步驟b得到的水相2.5ml分散到步驟a得到的油相2.5ml中,通過均質(zhì)勻化作用，形成油包水的單乳液，其中水相與油相的體積比為1/1 ;所述均質(zhì)勻化的條件為:攪拌速率3000rpm，攪拌時間IOmin ；[0081]d)在IOOrpm攪拌速率下，將步驟c獲得的單乳液分散到體積為400ml的IV0 (w/V)的PVA水溶液中得到水包油包水的復(fù)乳液；
[0082]e)以IOOrpm攪拌速率繼續(xù)攪拌乳液12h，使油相中的二氯甲烷揮發(fā)，得到固化的多孔微球；
[0083]f)收集固化的多孔微球，用去離子水洗滌3次，隨后凍干48h，得到表面形貌良好干燥的多孔PLGA微球；
[0084]g)將凍干的多孔微球與含有2 X IO7個鼠成纖維細胞的1000 μ I細胞懸液混合均勻，共同填入聚四氟乙烯模具中，在壓力為7.38MPa，溫度為40°C的亞臨界二氧化碳條件下處理10s，燒結(jié)成共載細胞多孔微球支架。
[0085]此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以得知，本發(fā)明利用了 PLGA能被亞臨界二氧化碳溶脹，引起材料表面塑化并黏結(jié)在一起的特性，因此，其他能夠被亞臨界二氧化碳溶脹引起表面塑化并黏結(jié)的材料，包括但不限于PCL(聚己內(nèi)酯)、PLA-PET(聚乳酸-聚乙二醇共聚物)等，均適用本發(fā)明的亞臨界二氧化碳燒結(jié)共載細胞多孔微球的方法。
[0086]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以得知，本發(fā)明所采用的隨材料一次燒結(jié)成型為多孔微球支架的細胞，對其的要求在于在亞臨界條件下能夠保持活性；因此，其他在亞臨界條件下能保持活性的生物體，例如硝化桿菌屬、假單胞菌屬、青霉屬、酵母細胞、趨磁細菌等微生物，均適用本發(fā)明的亞臨界二氧化碳燒結(jié)共載細胞多孔微球的方法。
[0087]以上所述，僅為本發(fā)明較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種亞臨界二氧化碳燒結(jié)共載細胞多孔微球支架的方法，其特征在于:包括: a)將PLGA添加到有機溶劑二氯甲烷中，通過攪拌獲得均勻的油相； b)將碳酸氫銨添加到蒸餾水中，通過攪拌獲得均勻的水相，其中碳酸氫銨濃度為5% ~20% (w/v)； c)將步驟b得到的水相分散到步驟a得到的油相中，通過均質(zhì)勻化作用，形成油包水的單乳液，其中水相與油相的體積比為1/1~1/20 ； d)在100~1000rpm攪拌速率下，將步驟c獲得的單乳液分散到PVA水溶液中得到水包油包水的復(fù)乳液； e)以步驟d中攪拌速率繼續(xù)攪拌乳液2~12h，使油相中的二氯甲烷揮發(fā)，得到固化的多孔微球； f)收集固化的多孔微球，用去離子水洗滌，隨后凍干； g)將凍干的多孔微球與2XIO4~2X IO7個細胞或50~1000 μ L含有2X IO4~2X IO7個細胞的細胞懸液共同填入模具中，在壓力為0.5~7.38MPa，溫度為20~40°C的亞臨界二氧化碳條件下處 理10~1800s,燒結(jié)成共載細胞多孔微球支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種亞臨界二氧化碳燒結(jié)共載細胞多孔微球支架的方法，其特征在于:步驟a中，所述油相中PLGA的濃度為1%~15% (w/v)，PLGA分子量為20~IOOkDa, PLGA 中 LA 與 GA 之摩爾比為 25/75 ~75/25。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種亞臨界二氧化碳燒結(jié)共載細胞多孔微球支架的方法，其特征在于:步驟c中，所述均質(zhì)勻化的條件為:攪拌速率3000~15000rpm，攪拌時間2~IOmin0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種亞臨界二氧化碳燒結(jié)共載細胞多孔微球支架的方法，其特征在于:步驟d中，所述PVA水溶液中，PVA濃度為0.1 %~2 % (w/v)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種亞臨界二氧化碳燒結(jié)共載細胞多孔微球支架的方法，其特征在于:所述PLGA用PCL或PLA-PET中的一種取代。
6.一種亞臨界二氧化碳燒結(jié)共載微生物多孔微球支架的方法，其特征在于:包括: a)將PLGA添加到有機溶劑二氯甲烷中，通過攪拌獲得均勻的油相； b)將碳酸氫銨添加到蒸餾水中，通過攪拌獲得均勻的水相，其中碳酸氫銨濃度為5% ~20% (w/v)； c)將步驟b得到的水相分散到步驟a得到的油相中，通過均質(zhì)勻化作用，形成油包水的單乳液，其中水相與油相的體積比為1/1~1/20 ； d)在100~1000rpm攪拌速率下，將步驟c獲得的單乳液分散到PVA水溶液中得到水包油包水的復(fù)乳液； e)以步驟d中攪拌速率繼續(xù)攪拌乳液2~12h，使油相中的二氯甲烷揮發(fā)，得到固化的多孔微球； f)收集固化的多孔微球，用去離子水洗滌，隨后凍干； g)將凍干的多孔微球與2X104~2XIO7個微生物或50~1000 μ L含有2 X IO4~2X IO7個微生物的微生物懸液共同填入模具中，在壓力為0.5~7.38MPa，溫度為20~40°C的亞臨界二氧化碳條件下處理10~1800s,燒結(jié)成共載微生物多孔微球支架。
【文檔編號】A61L27/56GK104001219SQ201410264713
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】陳愛政, 王士斌, 馬騰, 劉源崗, 吳文果 申請人:華僑大學(xué)