一種用于骨組織修復的三維支架材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于骨組織修復的三維支架材料及其制備方法，其由具有相互貫通的大孔結構的三維打印聚合物骨架和作為填充材料且具有微孔結構的蛋白質材料組成。制備步驟為：1)用三維打印機制作聚合物三維骨架；2)配置蛋白質的水溶液；3)冷凍干燥；4)加入交聯(lián)劑，水洗，再次冷凍干燥，即得到產品。本發(fā)明操作簡單，穩(wěn)定性高，全程不涉及有機溶劑，綠色安全，制備的骨組織支架力學性能良好，該支架中聚合物與蛋白緊密結合，其中聚合物骨架可以提供足夠的強力，而蛋白質部分則可以提供更多的細胞粘附位點，有利于細胞的滲透長入，進而促進組織再生。
【專利說明】一種用于骨組織修復的三維支架材料及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于組織工程和生物制造領域，特別涉及一種用于骨組織修復的三維支架材料及其制備方法。
【背景技術】
[0002]目前，由于創(chuàng)傷、腫瘤切除、感染、發(fā)育異常等原因造成的骨缺損的發(fā)病率較高，對患者日常生活產生了嚴重影響?，F(xiàn)有的方法主要是自體骨和異體骨移植，自體骨的來源較少，且會給病人帶來一定的痛苦；異體骨移植容易引發(fā)排斥反應，其應用受到限制。近年來，以生物材料為基礎的骨組織工程的發(fā)展為治療骨缺損提供了新的途徑。骨組織工程包括種子細胞、生長因子和支架三個要素。其中三維空間支架可以為細胞的生長提供粘附位點、營養(yǎng)輸送和代謝廢物的排放場所。骨組織工程改變了骨缺損修復的傳統(tǒng)模式，以少量細胞修復大塊組織缺損，同時可以根據實際需要進行塑造達到理想狀態(tài)。
[0003]目前，快速成型技術三維打印被廣泛應用于個性化骨修復支架材料的制備，是生物醫(yī)學、材料科學和現(xiàn)代制造技術等多學科交叉發(fā)展的產物，能夠滿足臨床治療的迫切需求。三維打印骨組織工程支架的強力較大，更接近于天然骨的力學性能。該方法有效地縮短了開發(fā)周期，降低了研發(fā)費用，其精確定制可以滿足不同部位不同形狀的骨缺損修復，在復雜性狀的骨支架制備方面具有獨特的優(yōu)勢?？梢愿鶕∪藗€性化的要求快速制備出任意形狀大小的骨組織工程支架。然而現(xiàn)有的三維打印骨組織工程支架由于打印技術的限制，其結構無法再更精細的尺度上模仿天然骨的結構，孔徑尺寸過大無法提供所必需的粘附位點使得組織難以長入支架內部(Roosa, Kemppainen et al.2010)。而且可以通過此方法加工的材料比較有限，多為高聚物合成材料，其生物相容性受到了限制。
[0004]此外，冷凍干燥技術也被應用于制備三維多孔骨組織工程支架材料，利用冷凍過程中冰晶的生長在支架內部形成比較均勻的分布，冷凍干燥后，冰晶被去除，冰晶所在的位置形成大小均勻且相互貫通的孔洞。利用此方法可以將多種水溶性蛋白質或其它生物材料制備成多孔結構的支架。利用該種方所制備的支架，其孔洞大小可控、取向排列可控(Wu，Liu et al.2010)，具有良好的生物相容性，研究表明其能夠促進細胞的增殖與滲透(Mandaland Kundu2009)，并被應用于組織工程支架和醫(yī)用敷料的制備。然而該種微孔支架的力學性能較差，尤其是濕態(tài)下容易變形，限制了其在骨組織工程中的應用。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種用于骨組織修復的三維支架材料及其制備方法，該支架的聚合物骨架能夠為骨組織再生提供必需的力學支撐，而蛋白質材料形成的微孔結構能夠為骨組織細胞提供有利的生長環(huán)境，有效的促進骨組織的再生。
[0006]本發(fā)明的一種用于骨組織修復的三維支架材料，由具有相互貫通的大孔結構的三維打印聚合物骨架和作為填充材料且具有微孔結構的蛋白質材料組成。
[0007]所述大孔結構孔徑為0.1-20毫米；所述微孔結構孔徑為0.05-0.6毫米。[0008]所述聚合物是聚己內酯、聚乳酸、聚氨酯中的一種或幾種；所述蛋白質是明膠、再生絲素、膠原等水溶性蛋白中的一種或幾種。
[0009]所述聚合物骨架與納米羥基磷灰石形成聚合物/納米羥基磷灰石骨架，納米羥基磷灰石的質量百分比為10% -60%。
[0010]所述蛋白質中包含活性物質；其中，活性物質為藥物、生長因子、無機納米顆粒中的一種或幾種。
[0011]所述藥物是慶大霉素、四環(huán)素等抗菌類藥物、抗炎癥類藥物、紫杉醇等抗癌癥類藥物中的一種或幾種；生長因子是骨形態(tài)發(fā)生蛋白或者轉化生長因子，骨形態(tài)發(fā)生蛋白為BMP-U BMP-2、BMP-3、BMP-7或BMP-14 ;轉化生長因子為TGF-α或TGF-β ;無機納米顆粒為納米羥基磷灰石或納米生物玻璃顆粒，無機納米顆粒直徑為30-200納米，無機納米顆粒與蛋白質的質量比為1: 0.5-10。
[0012]所述聚合物骨架外觀形狀為立方體、圓柱體、長方體、截面為異形多邊形或圓環(huán)的柱體中的一種。
[0013]本發(fā)明的一種用于骨組織修復的三維支架材料的制備方法，其包括下述步驟: [0014](I)三維打印:將聚合物加熱使其熔融，利用三維打印機擠出，擠出的聚合物流體冷卻凝固，形成聚合物三維骨架；
[0015](2)蛋白質水溶液的配制:將蛋白質固體溶于去離子水中，經過攪拌至完全溶解，得到蛋白質水溶液；
[0016](3)冷凍干燥:將打印成型的聚合物骨架放置于模具中，將蛋白質水溶液注入模具，將聚合物骨架完全浸沒，然后將模具置于-80°C冷凍，進行冷凍干燥處理；
[0017](4)交聯(lián):利用交聯(lián)劑交聯(lián)蛋白質使其不溶于水，交聯(lián)之后用去離子水洗滌去除交聯(lián)劑，再次冷凍干燥，即得。
[0018]所述步驟(1)中的針頭內徑為0.3-1.0毫米，聚合物擠出速率為0.02-0.10毫米/秒，接受平板移動速率為0.01-0.1毫米/秒，聚合物流體的直徑為0.3-0.6毫米，聚合物流體間距為0.1-20毫米，聚合物三維骨架的層高為0.2-0.5毫米，聚合物三維骨架高度> 0.3毫米。
[0019]所述步驟(2)中的蛋白質水溶液的濃度為0.5-20毫克/毫升。
[0020]所述步驟(4)中的交聯(lián)劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺EDC/NHS、京尼平、乙醇中的一種或幾種。
[0021]所述步驟(1)中的聚合物中可以選擇性的加入納米羥基磷灰石。具體操作步驟為:將聚合物溶于有機溶劑形成溶液，加入羥基磷灰石顆粒攪拌均勻，加熱使有機溶劑蒸發(fā)，冷卻后利用三維打印機制備聚合物/納米羥基磷灰石骨架。
[0022]有益.效果
[0023]采用上述技術方案后，本發(fā)明至少有以下有益效果:
[0024](I)本發(fā)明通過將三維打印技術與冷凍干燥技術結合在一起該支架的聚合物骨架能夠為骨組織再生提供必需的力學支撐，而蛋白質材料形成的微孔結構能夠為骨組織細胞提供有利的生長環(huán)境，有利于骨組織的修復和再生；
[0025](2)三維打印技術可以依照骨缺損部位的形狀定制相應的聚合物骨架，聚合物骨架具有優(yōu)良的機械性能，蛋白質水溶液注入聚合物骨架經冷凍干燥可以形成填充聚合物骨架大孔的微孔結構，能夠在成分上仿生天然骨。
[0026] (3)蛋白質微孔大小可控、取向可控，且微孔相互連通能夠促進細胞的增殖與遷移，有利于營養(yǎng)物質的輸送和代謝廢物的移除。
[0027](4)本發(fā)明還引入無機納米顆粒、藥物、生長因子等生物活性材料，可進一步改善三維支架材料的生物相容性，促進骨組織的再生。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1是一種用于骨組織修復的三維支架材料的制備流程圖；
[0029]圖2是實施例1中PCL骨架的照片；
[0030]圖3是實施例1中PCL骨架的SEM圖像；
[0031]圖4是實施例1中PCL/再生絲素復合三維支架材料的照片；
[0032]圖5是實施例1中PCL/再生絲素復合三維支架材料的SEM圖片；
[0033]圖6是實施例1中PCL/再生絲素復合三維支架材料上細胞形態(tài)(PCL部分)。
[0034]圖7是實施例1中PCL/再生絲素復合三維支架材料上細胞形態(tài)(絲素部分)。
[0035]圖8是實施例1中PCL/再生絲素復合三維支架與純絲素凍干支架的力學性能對比圖。
【具體實施方式】
[0036]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0037]實施例1
[0038](a)聚己內酯(?(^，分子量65，000)加熱到60攝氏度，由內徑為0.4毫米針頭擠出，形成0.4毫米PCL流體，接受平板移動速度為0.05毫米/秒，聚合物擠出速率為0.05毫米/秒，流體間距為0.5毫米，層與層之間垂直排列，層高0.3毫米，層數(shù)為7層，形成圓柱體PCL骨架，直徑為20毫米(圖2，圖3)。
[0039](b)將I克桑蠶絲再生絲素固體溶于50毫升去離子水中，攪拌使其完全溶解，得到質量體積百分比為2%的絲素溶液。
[0040](c)將PCL骨架放置于塑料模具中，并注入配置好的絲素溶液，使其完全浸潤并沒過PCL骨架。將模具置于-80攝氏度冰箱中冷凍12小時，隨后于冷凍干燥機中(-60攝氏度)凍干處理2天，得到孔徑為100-150 μ m的多孔結構。
[0041](d)配制95%的乙醇水溶液，將凍干好的樣品浸入乙醇水溶液中，交聯(lián)處理4小時。其后，用去離子水洗滌支架三遍，并再次冷凍干燥，得到用于骨組織修復的PCL/再生絲素復合支架材料(圖4，圖5)。
[0042]在此支架上培養(yǎng)成纖維細胞，三天后可觀測到細胞在支架上呈現(xiàn)出良好的細胞形態(tài)。如圖6、圖7所示。
[0043]實施例2
[0044](a) PCL加熱到60攝氏度，由內徑為0.4毫米的針頭擠出，形成0.4毫米PCL流體，接受平板移動速度為0.05毫米/秒，聚合物擠出速率為0.05毫米/秒，流體間距為0.5毫米，層與層之間垂直排列，層高0.3毫米，層數(shù)為7層，得到圓柱體PCL骨架，直徑為14毫米。
[0045](b)將I克明膠(A型豬皮明膠)與I克桑蠶絲再生絲素溶于50毫升去離子水中，加熱至60攝氏度攪拌使明膠與絲素完全溶解，得到質量體積百分比為4%的明膠/絲素(I: D水溶液。
[0046](c)將PCL骨架放置于塑料模具中，并注入配置好的絲素溶液，使其完全浸潤并沒過PCL骨架。將模具置于-80攝氏度冰箱中冷凍12小時，隨后于冷凍干燥機中(-60攝氏度)凍干處理2天。
[0047](d)配制95%的乙醇水溶液，加入EDC和NHS使得兩者的濃度皆為0.15摩爾/升。將凍干好的樣品浸入含EDC/NHS的乙醇水溶液中，隨后放置于4攝氏度冰箱冷藏交聯(lián)，交聯(lián)時間為18小時。用去離子水洗滌支架三遍，并再次冷凍干燥，得到用于骨組織修復的明膠/再生絲素和PCL復合支架材料。
[0048]實施例3
[0049](a)將3克PCL加入到30毫升三氟乙醇中，攪拌使其溶解，溶解完全后加入1.5克納米羥基磷灰石顆粒，繼續(xù)攪拌并超聲使羥基磷灰石均勻分散。配好的PCL/納米羥基磷灰石溶液倒入金屬容器中，加熱使三氟乙醇迅速揮發(fā)并全部去除，得到PCL和納米羥基磷灰石質量比例為2/1的混 合物。將此混合物加熱到60攝氏度，有內徑為0.5毫米的針頭擠出，形成0.5毫米PCL流體，接受平板移動速度為0.05毫米/秒，聚合物擠出速率為0.05毫米/秒，流體間距為0.5毫米，層與層之間60度排列，層高0.4毫米，層數(shù)為9層，得到圓柱體PCL骨架，直徑為20毫米。
[0050](b)將0.4克膠原(I型豬皮膠原)加入到20毫升去離子水中，攪拌使其完全溶解，得到質量體積百分比為2%的膠原水溶液。再加入0.4克納米羥基磷灰石顆粒，攪拌并超聲，使納米羥基磷灰石顆粒均勻分散，得到膠原/納米羥基磷灰石質量比為1:1的均勻水溶液。
[0051](c)將PCL/納米羥基磷灰石骨架放置于塑料模具中，并注入配置好的膠原/納米羥基磷灰石溶液，使其完全浸潤并沒過骨架。將模具置于-80攝氏度冰箱中冷凍12小時，隨后于冷凍干燥機中(-60攝氏度)凍干處理2天。
[0052](d)配制95%的乙醇水溶液，加入EDC和NHS使得兩者的最終濃度皆為0.15摩爾/升。將凍干好的樣品浸入含EDC/NHS的乙醇水溶液中，隨后放置于4攝氏度冰箱冷藏交聯(lián)，交聯(lián)時間為12小時。用去離子水洗滌支架三遍，并再次冷凍干燥，得到用于骨組織修復的膠原/納米羥基磷灰石和PCL復合支架材料。
【權利要求】
1.一種用于骨組織修復的三維支架材料，其特征在于:由具有相互貫通的大孔結構的三維打印聚合物骨架和作為填充材料且具有微孔結構的蛋白質材料組成。
2.根據權利要求1所述的一種用于骨組織修復的三維支架材料，其特征在于:所述大孔結構孔徑為0.1-20毫米；所述微孔結構孔徑為0.05-0.6毫米。
3.根據權利要求1所述的一種用于骨組織修復的三維支架材料，其特征在于:所述聚合物是聚己內酯、聚乳酸、聚氨酯中的一種或幾種；所述蛋白質是明膠、再生絲素、膠原中的一種或幾種。
4.根據權利要求1所述的一種用于骨組織修復的三維支架材料，其特征在于:所述聚合物骨架與納米羥基磷灰石形成聚合物/納米羥基磷灰石骨架，納米羥基磷灰石的質量百分比為10% -60% ο
5.根據權利要求1所述的一種用于骨組織修復的三維支架材料，其特征在于:所述蛋白質中包含活性物質；其中，活性物質為藥物、生長因子、無機納米顆粒中的一種或幾種。
6.根據權利要求5所述的一種用于骨組織修復的三維支架材料，其特征在于:所述藥物是抗菌類藥物、抗炎癥類藥物、抗癌癥類藥物中的一種或幾種；生長因子是骨形態(tài)發(fā)生蛋白或者轉化生長因子；無機納米顆粒為納米羥基磷灰石或納米生物玻璃顆粒，無機納米顆粒直徑為30-200納米，無機納米顆粒與蛋白質的質量比為1: 0.5-10。
7.根據權利要求1所述的一種用于骨組織修復的三維支架材料，其特征在于:所述聚合物骨架外觀形狀為立方體、圓柱體、長方體、截面為異形多邊形或圓環(huán)的柱體中的一種。
8.一種用于骨組織修復的三維支架材料的制備方法，其包括下述步驟: (1)將聚合物加熱使其熔融，利用三維打印機擠出，擠出的聚合物流體冷卻凝固，形成聚合物三維骨架； (2)將蛋白質固體溶于去離子水中，經過攪拌至完全溶解，得到蛋白質水溶液； (3)將打印成型的聚合物骨架放置于模具中，將蛋白質水溶液注入模具，將聚合物骨架完全浸沒，然后將模具置于-80°C冷凍，進行冷凍干燥處理； (4)利用交聯(lián)劑交聯(lián)蛋白質使其不溶于水，交聯(lián)之后用去離子水洗滌去除交聯(lián)劑，再次冷凍干燥，即得。
9.根據權利要求8所述的一種用于骨組織修復的三維支架材料的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)中的針頭內徑為0.3-1.0毫米，聚合物擠出速率為0.02-0.10毫米/秒，接受平板移動速率為0.01-0.1毫米/秒，聚合物流體的直徑為0.3-0.6毫米，聚合物流體間距為0.1-20毫米，聚合物三維骨架的層高為0.2-0.5毫米，聚合物三維骨架高度> 0.3毫米。
10.根據權利要求8所述的一種用于骨組織修復的三維支架材料的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中的蛋白質水溶液的濃度為0.5-20毫克/毫升。
11.根據權利要求8所述的一種用于骨組織修復的三維支架材料的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中的交聯(lián)劑為EDC/NHS、京尼平、乙醇中的一種或幾種。
【文檔編號】A61L27/56GK103990182SQ201410236085
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月30日 優(yōu)先權日:2014年5月30日
【發(fā)明者】莫秀梅, 李大偉, 許杜亮, 柯勤飛 申請人:東華大學