一種降血壓肽p16及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種降血壓肽P16，其氨基酸序列如SEQ?IDNo.1所示，該降血壓肽P16結(jié)構(gòu)明確，降血壓活性好，還公開(kāi)了該降血壓肽P16的制備方法，該制備方法工藝簡(jiǎn)潔，可規(guī)范化產(chǎn)品質(zhì)量，本發(fā)明還公開(kāi)了上述降血壓肽P16在制備具有降血壓功效的藥物或食品中的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種降血壓肽P16及其制備方法和應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明屬于多肽【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種降血壓肽P16及其制備方法和應(yīng)用。 【背景技術(shù)】
[0002] 高血壓是一種常見(jiàn)的心血管疾病，它不僅患病率高，而且常引起嚴(yán)重的心、腦、腎 等其他疾病，是腦卒中、冠心病、心力衰竭和腎臟疾病主要的危險(xiǎn)因素。降血壓肽是一類具 有降血壓肽作用的肽物質(zhì)，從食物蛋白中獲得ACE抑制肽雖然比人工合成的ACEI功能弱， 但它們的重要性在于這些活性相對(duì)較弱的降血壓物質(zhì)潛在于我們?nèi)粘z入的食物中，并有 其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：一是只對(duì)高血壓患者可起到降壓作用，對(duì)血壓正常者無(wú)降壓作用，因而不會(huì) 產(chǎn)生降血壓過(guò)度的問(wèn)題；二是這些肽是經(jīng)食品級(jí)蛋白酶在溫和條件下獲得的，其安全性極 高，無(wú)副作用；三是活性的多樣性，除降血壓功能外，往往同時(shí)具免疫促進(jìn)、抗凝血、易消化 吸收、抗腫瘤等功能；四是具有較好的酸、熱穩(wěn)定性、水溶性及勃度隨濃度變化遲鈍等特點(diǎn)， 因而易于作為功能因子添加到各類食品中。用食品為原料制備降血壓肽，己在食品中掀起 風(fēng)潮。
[0003] 中國(guó)專利公開(kāi)的《一種酪蛋白降血壓肽的制備方法》（申請(qǐng)公布號(hào) CN102296100A)，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶分步酶解酪蛋白、經(jīng)過(guò)滅酶，離 心、干燥后得到降血壓肽初品，再經(jīng)過(guò)大孔吸附脂和萄聚糖凝膠層析得到具有ACE抑制活 性的酪蛋白降血壓肽。但沒(méi)有指明特定的降血壓肽成分和結(jié)構(gòu)，也沒(méi)有驗(yàn)證最終得到的產(chǎn) 品是否具有降血壓活性。
[0004] 中國(guó)專利公開(kāi)的《牦牛乳酪蛋白降血壓肽的制備方法》（申請(qǐng)公布號(hào) CN102787155A)，涉及一種利用牦牛乳酪蛋白為原料制備降血壓肽的方法，主要通過(guò)胰蛋白 酶水解、滅酶、沉淀酪蛋白、超濾、純?yōu)V、噴霧干燥等工藝制備了 ACE抑制活性高的降血壓肽 混合樣品。但也未對(duì)降血壓活性最高的降血壓肽成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，不能規(guī)范化產(chǎn)品質(zhì)量。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種降血壓肽P16,該肽結(jié)構(gòu)明確，降血壓活性好。
[0006] 本發(fā)明的目的還在于提供上述降血壓肽P16的制備方法，該制備方法工藝簡(jiǎn)潔， 能規(guī)范化產(chǎn)品質(zhì)量。
[0007] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的在于提供上述降血壓肽P16在制備具有降血壓功效的藥 物或食品中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種降血壓肽P16,其氨基 酸序列如SEQ IDNo. 1所示。
[0009] 經(jīng)鑒定，本發(fā)明中的降血壓肽P16,其氨基酸序列為GPFPIIV(Gly-Pr〇-Phe-Pr〇-I le-Ile-Val)，具體如 SEQ IDNo. 1 所示，分子量為 74L 2Da。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：上述降血壓肽P16的制備方 法，含以下步驟： toon] (1)取酪蛋白，加水溶解后，得酪蛋白的水溶液；
[0012] (2)在酪蛋白的水溶液中加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解，胰蛋白酶的加入量占酪蛋白總 質(zhì)量的0. 1?0. 2%，酶解溫度為40?50°C，酶解時(shí)間為1?2h，pH值為7. 0?9. 0,酶解 后進(jìn)行滅酶處理，得滅酶液；
[0013] (3)調(diào)節(jié)pH值為4. 0?5. 0使滅酶液中未酶解的大分子進(jìn)行蛋白沉淀，并除去未 酶解的大分子蛋白沉淀，得含有降血壓肽的清液；
[0014] (4)將含有降血壓肽的清液采用HPLC進(jìn)行反相硅膠純化，收集含目標(biāo)物的洗脫 液，將洗脫液濃縮干燥后，即獲得降血壓肽P16。
[0015] 在上述制備方法中：
[〇〇16] 本發(fā)明步驟（1)中所述水的用量?jī)?yōu)選為酪蛋白總質(zhì)量的4?6倍，溶解溫度優(yōu)選 為 40 ?60°C。
[0017] 本發(fā)明步驟（2)中滅酶時(shí)的溫度優(yōu)選為80?90°C，滅酶時(shí)間優(yōu)選為20?30min。
[0018] 為了便于某些未酶解的大分子蛋白沉淀，本發(fā)明步驟（3)中先調(diào)節(jié)pH值為4.0? 5. 0,采用過(guò)濾或離心方式除去未酶解的大分子蛋白質(zhì)沉淀，離心時(shí)離心機(jī)轉(zhuǎn)速為3000? 5000r/min，離心時(shí)間為20?30min。
[0019] 本發(fā)明步驟（4)中HPLC采用LC-8A島津高效液相色譜儀，色譜柱為HW-0121，色 譜條件為：流速：8mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm，進(jìn)樣量：2mL，流動(dòng)相：A泵超純水，含體積百分 含量為0. 1 %的TFA，B泵乙腈，B泵初始濃度為25%，洗脫方式，二元梯度洗脫，洗脫梯度： 0. 01 ?60min,25 ?36%,60. Olmin ?80min,36%,80. 01 ?90min,90%?90%,90. 01 ? 100min,90%?25%。
[0020] 本發(fā)明提供的降血壓肽的制備方法，主要包括利用胰蛋白酶水解酪蛋白，經(jīng)調(diào)節(jié) pH值、脫蛋白、反相硅膠純化、干燥等工藝，制備得到降血壓肽單體。
[0021] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：上述降血壓肽P16在制備 具有降血壓功效的藥物或食品中的應(yīng)用。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0023] (1)本發(fā)明中的降血壓肽P16結(jié)構(gòu)明確，其氨基酸序列為GPFPIIV(Gly-Pr〇-Phe-P ro-Ile-Ile-Val)，分子量為 741. 2Da ;
[0024] (2)本發(fā)明中的降血壓肽P16降血壓效果好，在濃度為lmg/mL時(shí)，對(duì)ACE酶的抑制 率可高達(dá)53. 6%，流動(dòng)性好、20% (質(zhì)量百分含量）降血壓肽的乙醇溶液澄清透明，顏色為 純白色粉末，也就是說(shuō)，本發(fā)明中的降血壓肽，能有效地抑制ACE酶的活性，具有巨大的實(shí) 用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。 【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中液相分離降血壓肽P16的HPLC圖譜；
[0026] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中降血壓肽P16單體的高效液相色譜圖；
[0027] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中降血壓肽P16的質(zhì)譜圖。 【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 本實(shí)施例提供的降血壓肽P16,其氨基酸序列如SEQ IDNo. 1所示。
[0031] 上述降血壓肽P16通過(guò)如下方法制備獲得：
[0032] (1)向燒杯中加純水4000mL，開(kāi)攪拌200rpm，向燒杯中緩慢投入酪蛋白（恒天然食 品級(jí)進(jìn)口酪蛋白，僅為列舉，并不僅限于此）lkg，在40°C條件下攪拌溶解，得酪蛋白的水溶 液；
[0033] (2)在酪蛋白的水溶液中加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解條件為：加酶量為酪蛋白 總質(zhì)量的〇. 1 %，反應(yīng)溫度40°C，反應(yīng)時(shí)間lh，pH7. 0 ;
[0034] (3)將溫度調(diào)節(jié)至80°C，保溫30min，進(jìn)行滅菌；
[0035] (4)調(diào)pH值4. 0,3000r/min離心30min，除去未酶解的大分子蛋白沉淀，得含有高 活性降血壓肽的清液；
[0036] (5)反相硅膠純化，將含有高活性降血壓肽的清液再進(jìn)行反相硅膠純化，HPLC系 統(tǒng)：LC-8A島津制備高效液相色譜儀；色譜柱：服一 0121 ;色譜條件：流速：8mL/min ;檢測(cè) 波長(zhǎng)：214nm;進(jìn)樣量：2mL ;流動(dòng)相：A泵超純水（含0. 1% (v/v)TFA，三氟乙酸），B泵乙腈， 8泵初始濃度為25%;洗脫方式：二元梯度洗脫；洗脫梯度：0.011^11?6〇1^11，25%?36% ; 60. Olmin ?80min，36 % ;80. Olmin ?90min，90 % ?90 % ;90. Olmin ?100min，90 % ? 25%，重復(fù)進(jìn)樣，收集高活性降血壓肽洗脫液，該降血壓肽單峰液相圖譜的保留時(shí)間如圖 1-2中所示；
[0037] (6)將高活性降血壓肽洗脫液離心后，收集上清液，真空濃縮，冷凍干燥，得到降血 壓肽單體P16 ;
[0038] (7)降血壓肽的鑒定
[0039] 根據(jù)圖3中的液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定P16分子量，再到上海中科新生命生物科技有限公司 做Edman降解，測(cè)定P16 -級(jí)結(jié)構(gòu)，再與酪蛋白的氨基酸排列比對(duì)驗(yàn)證可知，本發(fā)明中獲得 的降血壓肽的氨基酸序列為 GPFPIIV(Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val)，具體如 SEQ IDNo. 1 中所示。
[0040] (8) ACE (血管緊張素轉(zhuǎn)化酶）抑制活性測(cè)定：馬尿酸法
[0041] a)反應(yīng)液的制備
[0042] 在樣品管中加入10 μ L濃度為0. 2U/mL的ACE溶液和10 μ L的樣品溶液，于37°C 下保溫5min，加入50yL濃度為6. 5mmol噸-1的HHL(購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司）溶液，混勻后 在37°C下保溫60min，再加85 μ L濃度為1. 0m〇L/L的鹽酸溶液靜置5min終止反應(yīng)，具體操 作步驟如表1所示。
[0043] 表1ACE抑制活性馬尿酸檢測(cè)法反應(yīng)液制備步驟
[0044]
【權(quán)利要求】
1. 一種降血壓肽P16,其特征是：其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2. 權(quán)利要求1所述的降血壓肽P16的制備方法，其特征是含以下步驟： (1) 取酪蛋白，加水溶解后，得酪蛋白的水溶液； (2) 在酪蛋白的水溶液中加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解，胰蛋白酶的加入量占酪蛋白總質(zhì)量 的0. 1?0.2%，酶解溫度為40?50°C，酶解時(shí)間為1?2h，pH值為7.0?9.0,酶解后進(jìn) 行滅酶處理，得滅酶液； (3) 調(diào)節(jié)pH值為4. 0?5. 0使滅酶液中未酶解的大分子進(jìn)行蛋白沉淀，并除去未酶解 的大分子蛋白沉淀，得含有降血壓肽的清液； (4) 將含有降血壓肽的清液采用HPLC進(jìn)行反相硅膠純化，收集含目標(biāo)物的洗脫液，將 洗脫液濃縮干燥后，即獲得降血壓肽P16。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的降血壓肽P16的制備方法，其特征是：步驟（1)中所述水的 用量為酪蛋白總質(zhì)量的4?6倍，溶解溫度為40?60°C。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的降血壓肽P16的制備方法，其特征是：步驟（2)中滅酶時(shí)的 溫度為80?90°C，滅酶時(shí)間為20?30min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的降血壓肽P16的制備方法，其特征是：步驟（3)中采用過(guò)濾 或離心方式除去未酶解的大分子蛋白質(zhì)沉淀，離心時(shí)離心機(jī)轉(zhuǎn)速為3000?5000r/min，離 心時(shí)間為20?30min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的降血壓肽P16的制備方法，其特征是：步驟（4)HPLC采用 LC-8A島津高效液相色譜儀，色譜柱為HW-0121，色譜條件為：流速：8mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)： 214nm，進(jìn)樣量：2mL，流動(dòng)相：A泵超純水，含體積百分含量為0. 1 %的TFA，B泵乙腈，B泵初 始濃度為25%，洗脫方式，二元梯度洗脫，洗脫梯度：0. 01?60min，25?36%，60. Olmin? 80min,36%,80. 01 ?90min,90%?90%,90. 01 ?100min,90%?25%。
7. 權(quán)利要求1所述的降血壓肽P16在制備具有降血壓功效的藥物中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求1所述的降血壓肽P16在制備具有降血壓功效的食品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P9/12GK104059126SQ201410233895
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】寧德山, 趙力超, 馬忠華, 曹庸, 郭曉蕾, 劉飛, 杜潔, 陳飛龍, 吳成順 申請(qǐng)人:無(wú)限極（中國(guó)）有限公司