一種具有組織學(xué)結(jié)構(gòu)的人工食道的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有組織學(xué)結(jié)構(gòu)的人工食道的制備方法，特點(diǎn)是先從動(dòng)物食道的粘膜組織中提取基膜蛋白液，然后制取電紡絲/脫細(xì)胞基質(zhì)支架，再制取帶有雙面微槽的聚氨酯薄片，最后將聚氨酯薄片包裹在電紡絲/脫細(xì)胞基質(zhì)支架外并縱向縫接成管狀，得到具有組織學(xué)結(jié)構(gòu)的人工食道；優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)該方法可制備出模擬正常人體食道的組織學(xué)結(jié)構(gòu)的人工食道，利用了組織工程學(xué)原理，在體外構(gòu)建出與人體食道具有相似微觀構(gòu)造和功能的人工食道，然后逐層與病變食道切除后的剩余食道相縫接，使人工食道逐漸長(zhǎng)成為真正的食道，并與人體內(nèi)原有食道融合，與傳統(tǒng)的替代物相比，結(jié)構(gòu)與功能上更趨近天然食道，能減輕病患的痛苦，延長(zhǎng)病患的生命。
【專利說(shuō)明】一種具有組織學(xué)結(jié)構(gòu)的人工食道的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組織工程學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種具有組織學(xué)結(jié)構(gòu)的人工食道的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]正常的人體食道為一約20~25厘米長(zhǎng)、直徑約1.9厘米(因個(gè)體而異)的中空管道，連接咽喉和胃部，擔(dān)負(fù)著將食物從咽喉輸送到胃的功能。從組織學(xué)的角度，食管由粘膜、粘膜下層、肌層和外膜等四層構(gòu)成，其中粘膜和肌層是最重要的功能成分。如粘膜是一滲透性屏障層，對(duì)食管內(nèi)部組織起保護(hù)和隔離作用；粘膜下層中含有管狀腺，使得粘膜表面始終保持潤(rùn)滑，以減少食物通過(guò)時(shí)的摩擦，使食物能在不損傷食管的前提下被輸送至胃部；而肌層含有明顯的內(nèi)環(huán)行和外縱行復(fù)層結(jié)構(gòu)，通過(guò)肌細(xì)胞的收縮和蠕動(dòng)實(shí)現(xiàn)食物的運(yùn)送功能；而粘膜的底層是基膜，這是一薄層儲(chǔ)有生長(zhǎng)因子、某些特殊蛋白及其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)，具有影響和調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的粘附、增殖、遷移、分化以及死亡等功能。經(jīng)檢測(cè)，基膜厚約50~150nm、由直徑為28~166nm的纖維和大小不均的孔組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。基膜中含有IV型膠原、層粘連蛋白、巢蛋白和蛋白聚糖等功能蛋白。
[0003]人體食道病變時(shí)有發(fā)生 ，有先天帶來(lái)的也有后天變異的。尤其食道癌已成為世界第五大惡性腫瘤。而且在食道癌患者中調(diào)查發(fā)現(xiàn)，食道癌的好發(fā)部位為食道中下段，將近占到90%。這些食道疾病引起食道梗阻而不能進(jìn)食，嚴(yán)重威脅人類生命健康。臨床上對(duì)早期食道癌的治療以手術(shù)切除、胃-頸段食道吻合為主，對(duì)于長(zhǎng)段食道病變，以手術(shù)切除并重建替代為主。常用的替代物有兩類:一類是自體其他組織或器官，如胃、空腸、結(jié)腸等，其中，國(guó)內(nèi)食道替代手術(shù)中胃是最常用的替代品，但這些替代物以損傷修復(fù)損傷，同時(shí)治療效果也不理想，如以胃替代病變食道的患者死亡率達(dá)7~20%，術(shù)后患綜合癥的高達(dá)50%以上；另一類替代物為塑料、橡膠、玻璃、聚乙烯、Teflon、鋼絲圈等，這些非降解、非生物相容的替代物其缺點(diǎn)也是顯而易見(jiàn)的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種模擬正常人體食道的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，利用組織工程學(xué)原理，在體外構(gòu)建與人體食道具有相似微觀構(gòu)造和功能、能減輕病患痛苦、延長(zhǎng)病患生命的具有組織學(xué)結(jié)構(gòu)的人工食道的制備方法。
[0005]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為:一種具有組織學(xué)結(jié)構(gòu)的人工食道的制備方法，具體包括以下步驟:
(I)、取動(dòng)物食道中的粘膜及粘膜下層，洗凈、剪碎，并將粘膜及粘膜下層組織浸入由NaCl, Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷)、苯甲基磺酰氟和N-甲基馬來(lái)酰亞胺混合而成的溶液中，其中=NaCl在溶液中的濃度為3.4mol/L、Tris-HCl在溶液中的濃度為0.05mol/L、苯甲基磺酰氟在溶液中的濃度為2mmol/L、N-甲基馬來(lái)酰亞胺在溶液中的濃度為lmmol/L，勻漿后將勻漿液在4 °C的低溫下以8000~12000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取離心后的上清液，并將離心后剩下的沉淀物再浸入由NaCl、Tris-HCl、苯甲基磺酰氟和N-甲基馬來(lái)酰亞胺混合而成的溶液中，其中=NaCl在溶液中的濃度為0.5mol/L、Tris-HCl在溶液中的濃度為0.05mol/L、苯甲基磺酰氟在溶液中的濃度為2mmol/L、N-甲基馬來(lái)酰亞胺在溶液中的濃度為lmmol/L，勻漿后將勻漿液在4 °C的低溫下以8000~12000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取離心后的上清液，并將離心后剩下的沉淀物接著浸入由鹽酸胍、二硫蘇糖醇和Tris-HCl混合而成的溶液中，其中:鹽酸胍在溶液中的濃度為2.0mol/L、二硫蘇糖醇在溶液中的濃度為2mmol/L、Tris-HCl在溶液中的濃度為0.05mol/L，勻漿后將勻漿液在4 °C的低溫下以8000~12000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取離心后的上清液，并將離心后剩下的沉淀物最后浸入由鹽酸胍、二硫蘇糖醇和Tris-HCl混合而成的溶液中，其中:鹽酸胍在溶液中的濃度為4.0mol/L、二硫蘇糖醇在溶液中的濃度為2mmol/L、Tris-HCl在溶液中的濃度為
0.05mol/L，勻漿后將勻漿液在4 °C的低溫下以8000~12000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取離心后的上清液，將四次所取得的上清液混合，得到基膜蛋白液，用于支架包被；
(2)、取動(dòng)物食道中的粘膜和粘膜下層，清水沖洗干凈，并用75%酒精浸泡I~4h消毒，消毒后用PBS緩沖液沖洗干凈，將由青霉素與鏈霉素組成的雙抗和曲拉通混合到PBS緩沖液中形成PBS混合液，其中:曲拉通在PBS混合液的重量百分比為1%、青霉素和鏈霉素在PBS混合液中的濃度均為200U/L，再將上述粘膜及粘膜下層置于該P(yáng)BS混合液中，振蕩并持續(xù)渦旋，每12h更換PBS混合液，持續(xù)振蕩渦旋3天后用含雙抗的PBS緩沖液清洗粘膜及粘膜下層，其中:組成雙抗的青霉素和鏈霉素在PBS緩沖液中的濃度均為200U/L，然后將粘膜及粘膜下層在37°C的溫度下浸泡在含有DNA酶的PBS緩沖液中2h，其中:DNA酶在PBS緩沖液中的濃度為1000~5000U/L，再用含雙抗的PBS緩沖液清洗，其中:組成雙抗的青霉素和鏈霉素在PBS緩沖液中的濃度均為200U/L，得到食道粘膜脫細(xì)胞基質(zhì)；
(3)、用三氟乙醇溶解聚己內(nèi) 酯得到聚己內(nèi)酯溶液、用甲酸溶解絲素蛋白得到絲素蛋白溶液，并將聚己內(nèi)酯溶液和絲素蛋白溶液按溶質(zhì)重量比為4:1的比例混合得到混合液，然后以六氟異丙醇為溶劑調(diào)節(jié)混合液的濃度為0.125μg/ml，并作為電紡絲溶液，取步驟(2)所制備的食道粘膜脫細(xì)胞基質(zhì)作為基底，通過(guò)靜電紡絲裝置將電紡絲溶液在基底內(nèi)腔表面進(jìn)行靜電紡絲，獲得纖維直徑為50~500nm、厚度為100~200nm的多孔纖維膜，然后將此多孔纖維膜連同基底一起浸泡在步驟(1)所制備的基膜蛋白液中，在4 °C下浸泡24 h后取出，并以PBS緩沖液沖洗去多余基膜蛋白，得到包被了基膜蛋白的電紡絲/脫細(xì)胞基質(zhì)支架，備用；
(4)、將可降解聚酯型聚氨酯溶于1，4-二氧六環(huán)中，配制成重量濃度為5~25%的聚氨酯溶液，將該聚氨酯溶液澆注到帶有連續(xù)和點(diǎn)斷微槽結(jié)構(gòu)的模具上，制備成寬為5~10厘米且?guī)в须p面微槽的長(zhǎng)方形的聚氨酯薄片，其中聚氨酯薄片的一面為連續(xù)微槽，另一面為點(diǎn)斷微槽，連續(xù)微槽的結(jié)構(gòu)為:槽寬200Mm、槽深30Mm、槽間距30Mm ;點(diǎn)斷微槽的結(jié)構(gòu)為:槽寬100~200Mm、槽深30Mm，每個(gè)隔斷長(zhǎng)100~200Mm，隔斷寬30Mm、同一行中相鄰兩個(gè)隔斷的間距為30Mm，所述的連續(xù)微槽和所述的點(diǎn)斷微槽互相垂直，且連續(xù)微槽的延伸方向?yàn)榫郯滨ケ∑拈L(zhǎng)度方向，點(diǎn)斷微槽的延伸方向?yàn)榫郯滨ケ∑膶挾确较颍?br> (5)、從蠶絲或蠶繭中提取絲素蛋白，并在聚氨酯薄片的內(nèi)外表面以化學(xué)方式接上可供反應(yīng)的自由胺基，然后將接有自由胺基的聚氨酯薄片浸在重量濃度為I~3%的戊二醛溶液中室溫反應(yīng)I~5h，之后用去離子水沖洗去除聚氨酯薄片表面未反應(yīng)的戊二醛，再將聚氨酯薄片浸入濃度為lmg/ml的絲素蛋白溶液中，在4°C的溫度下浸泡12~24h，取出后用PBS緩沖液沖洗去除聚氨酯薄片表面沒(méi)有反應(yīng)的絲素蛋白；
(6)、將聚氨酯薄片以點(diǎn)斷微槽為內(nèi)表面一點(diǎn)斷微槽呈環(huán)向、連續(xù)微槽為外表面一連續(xù)微槽呈縱向包裹于由步驟(3)所制得的包被了基膜蛋白的電紡絲/脫細(xì)胞基質(zhì)支架外，并將聚氨酯薄片縱向縫接成管狀，得到具有組織學(xué)結(jié)構(gòu)的人工食道；
(7)、將制得的人工食道以75%酒精浸泡消毒30分鐘，然后以滅菌PBS緩沖液沖洗，無(wú)菌保存；
(8)、當(dāng)將所制得的人工食道與人體食道對(duì)接時(shí)，將人體食道中的病變部位整段切除，按層/層對(duì)接的方法，將人工食道與剩余食道組織縫接，即電紡絲/脫細(xì)胞基質(zhì)與食道的粘膜下層縫接，聚氨酯薄片上的點(diǎn)段微槽層與人體食道中的環(huán)形肌層對(duì)接，聚氨酯薄片上的連續(xù)微槽層與人體食道中的縱形肌層對(duì)接，逐層縫合傷口，體內(nèi)培育6~18個(gè)月。
[0006]本方法中所使用的PBS緩沖液即為磷酸鹽緩沖液。
[0007]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)該方法可制備出模擬正常人體食道的組織學(xué)結(jié)構(gòu)的人工食道，利用了組織工程學(xué)原理，在體外構(gòu)建出與人體食道具有相似微觀構(gòu)造和功能的人工食道，然后逐層與病變食道切除后的剩余食道相縫接，使人工食道逐漸長(zhǎng)成為真正的食道，并與人體內(nèi)原有食道融合，解決了目前人工食道因結(jié)構(gòu)單一帶來(lái)的功能缺乏的弱點(diǎn)，與傳統(tǒng)的替代物相比，結(jié)構(gòu)與功能上更趨近天然食道，能減輕病患的痛苦，延長(zhǎng)病患的生命。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0008]圖1為本發(fā)明所制得的人工食道的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2為本發(fā)明步驟(4)所制取的聚酯型聚氨酯薄片的具有點(diǎn)斷微槽一面的結(jié)構(gòu)示意
圖；
圖3為本發(fā)明步驟(4)所制取的聚酯型聚氨酯薄片的具有連續(xù)微槽一面的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0009]以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0010]實(shí)施例一:一種具有組織學(xué)結(jié)構(gòu)的人工食道的制備方法，具體包括以下步驟:
(I)、取動(dòng)物食道(如豬、狗、羊等動(dòng)物)中的粘膜及粘膜下層，洗凈、剪碎，并將粘膜及粘
膜下層組織浸入由NaCl、Tris-HCl、苯甲基磺酰氟和N-甲基馬來(lái)酰亞胺混合而成的溶液中，其中=NaCl在溶液中的濃度為3.4mol/L、Tris-HCl在溶液中的濃度為0.05mol/L、苯甲基磺酰氟在溶液中的濃度為2mmol/L、N-甲基馬來(lái)酰亞胺在溶液中的濃度為lmmol/L，勻漿后將勻漿液在4 °C的低溫下以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取離心后的上清液，并將離心后剩下的沉淀物再浸入由NaCl、Tris-HCl、苯甲基磺酰氟和N-甲基馬來(lái)酰亞胺混合而成的溶液中，其中=NaCl在溶液中的濃度為0.5mol/L、Tris-HCl在溶液中的濃度為0.05mol/L、苯甲基磺酰氟在溶液中的濃度為2mmol/L、N-甲基馬來(lái)酰亞胺在溶液中的濃度為lmmol/L，勻漿后將勻漿液在4 °C的低溫下以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取離心后的上清液，并將離心后剩下的沉淀物接著浸入由鹽酸胍、二硫蘇糖醇和Tris-HCl混合而成的溶液中，其中:鹽酸胍在溶液中的濃度為2.0mol/L、二硫蘇糖醇在溶液中的濃度為2mmol/L、Tris-HCl在溶液中的濃度為0.05mol/L，勻漿后將勻漿液在4 °C的低溫下以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取離心后的上清液，并將離心后剩下的沉淀物最后浸入由鹽酸胍、二硫蘇糖醇和Tris-HCl混合而成的溶液中，其中:鹽酸胍在溶液中的濃度為4.0mol/L、二硫蘇糖醇在溶液中的濃度為2mmol/L、TriS-HCl在溶液中的濃度為0.05mol/L，勻漿后將勻漿液在4 °〇的低溫下以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取離心后的上清液，將四次所取得的上清液混合，得到基膜蛋白液，用于支架包被；
(2)、取動(dòng)物食道中的粘膜和粘膜下層，清水沖洗干凈，并用75%酒精浸泡2h消毒，消毒后用PBS緩沖液沖洗干凈，將由青霉素與鏈霉素組成的雙抗和曲拉通混合到PBS緩沖液中形成PBS混合液，其中:曲拉通在PBS混合液的重量百分比為1%、青霉素和鏈霉素在PBS混合液中的濃度均為200U/L，再將上述粘膜及粘膜下層置于該P(yáng)BS混合液中，振蕩并持續(xù)渦旋，每12h更換PBS混合液，持續(xù)振蕩渦旋3天后用含雙抗的PBS緩沖液清洗粘膜及粘膜下層，其中:組成雙抗的青霉素和鏈霉素在PBS緩沖液中的濃度均為200U/L，然后將粘膜及粘膜下層在37°C的溫度下浸泡在含有DNA酶的PBS緩沖液中2h，其中:DNA酶在PBS緩沖液中的濃度為2000U/L，再用含雙抗的PBS緩沖液清洗，其中:組成雙抗的青霉素和鏈霉素在PBS緩沖液中的濃度均為200U/L，得到食道粘膜脫細(xì)胞基質(zhì)；
(3)、用三氟乙醇溶解聚己內(nèi)酯得到聚己內(nèi)酯溶液、用甲酸溶解絲素蛋白得到絲素蛋白溶液，并將聚己內(nèi)酯溶液和絲素蛋白溶液按溶質(zhì)重量比為4:1的比例混合得到混合液，然后以六氟異丙醇為溶劑調(diào)節(jié)混合液的濃度為0.125μg/ml，并作為電紡絲溶液，取步驟(2)所制備的食道粘膜脫細(xì)胞基質(zhì)作為基底，通過(guò)靜電紡絲裝置將電紡絲溶液在基底內(nèi)腔表面進(jìn)行靜電紡絲，獲得纖維直徑為lOOnm、厚度為IOOnm的多孔纖維膜，然后將此多孔纖維膜連同基底一起浸泡在步驟(1)所制備的基膜蛋白液中，在4 °C下浸泡24 h后取出，并以PBS緩沖液沖洗去多余基 膜蛋白，得到包被了基膜蛋白的電紡絲/脫細(xì)胞基質(zhì)支架，備用；
(4)、將可降解聚酯型聚氨酯溶于1，4-二氧六環(huán)中，配制成重量濃度為10%的聚氨酯溶液，將該聚氨酯溶液澆注到帶有連續(xù)和點(diǎn)斷微槽結(jié)構(gòu)的模具上，制備成寬為5厘米且?guī)в须p面微槽的長(zhǎng)方形的聚氨酯薄片，其中聚氨酯薄片的一面為連續(xù)微槽，另一面為點(diǎn)斷微槽，連續(xù)微槽的結(jié)構(gòu)為:槽寬W1為200Mm、槽深30Mm、槽間距D1為30Mm ;點(diǎn)斷微槽的結(jié)構(gòu)為:槽寬W2為lOOMm、槽深30Mm，每個(gè)隔斷長(zhǎng)L為150Mm，隔斷寬W為30Mm、同一行中相鄰兩個(gè)隔斷的間距D為30Mm，連續(xù)微槽和點(diǎn)斷微槽互相垂直，且連續(xù)微槽的延伸方向?yàn)榫郯滨ケ∑拈L(zhǎng)度方向，點(diǎn)斷微槽的延伸方向?yàn)榫郯滨ケ∑膶挾确较颍?br> (5)、從蠶絲或蠶繭中提取絲素蛋白，并在聚氨酯薄片的內(nèi)外表面以化學(xué)方式接上可供反應(yīng)的自由胺基，然后將接有自由胺基的聚氨酯薄片浸在重量濃度為1%的戊二醛溶液中室溫反應(yīng)5h，之后用去離子水沖洗去除聚氨酯薄片表面未反應(yīng)的戊二醛，再將聚氨酯薄片浸入濃度為lmg/ml的絲素蛋白溶液中，在4°C的溫度下浸泡24h，取出后用PBS緩沖液沖洗去除聚氨酯薄片表面沒(méi)有反應(yīng)的絲素蛋白；
(6)、將聚氨酯薄片以點(diǎn)斷微槽為內(nèi)表面一點(diǎn)斷微槽呈環(huán)向、連續(xù)微槽為外表面一連續(xù)微槽呈縱向包裹于由步驟(3)所制得的包被了基膜蛋白的電紡絲/脫細(xì)胞基質(zhì)支架外，并將聚氨酯薄片縱向縫接成管狀，得到具有組織學(xué)結(jié)構(gòu)的人工食道；
(7)、將制得的人工食道以75%酒精浸泡消毒30分鐘，然后以滅菌PBS緩沖液沖洗，無(wú)菌保存。
[0011]實(shí)施例二:一種具有組織學(xué)結(jié)構(gòu)的人工食道的制備方法，具體包括以下步驟:
(1)、取動(dòng)物食道(如豬、狗、羊等動(dòng)物)中的粘膜及粘膜下層，洗凈、剪碎，并將粘膜及粘膜下層組織浸入由NaCl、TriS-HCl (三羥甲基氨基甲烷)、苯甲基磺酰氟和N-甲基馬來(lái)酰亞胺混合而成的溶液中，其中=NaCl在溶液中的濃度為3.4mol/L、Tris-HCl在溶液中的濃度為0.05mol/L、苯甲基磺酰氟在溶液中的濃度為2mmol/L、N-甲基馬來(lái)酰亞胺在溶液中的濃度為lmmol/L,勻衆(zhòng)后將勻衆(zhòng)液在4 °C的低溫下以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min,取離心后的上清液，并將離心后剩下的沉淀物再浸入由NaCl、Tris-HCl、苯甲基磺酰氟和N-甲基馬來(lái)酰亞胺混合而成的溶液中，其中=NaCl在溶液中的濃度為0.5mol/L、Tris-HCl在溶液中的濃度為0.05mol/L、苯甲基磺酰氟在溶液中的濃度為2mmol/L、N-甲基馬來(lái)酰亞胺在溶液中的濃度為lmmol/L，勻漿后將勻漿液在4 °C的低溫下以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取離心后的上清液，并將離心后剩下的沉淀物接著浸入由鹽酸胍、二硫蘇糖醇和Tris-HCl混合而成的溶液中，其中:鹽酸胍在溶液中的濃度為2.0mol/L、二硫蘇糖醇在溶液中的濃度為2mmol/L、TriS-HCl在溶液中的濃度為0.05mol/L，勻漿后將勻漿液在4 °C的低溫下以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取離心后的上清液，并將離心后剩下的沉淀物最后浸入由鹽酸胍、二硫蘇糖醇和Tris-HCl混合而成的溶液中，其中:鹽酸胍在溶液中的濃度為4.0mol/L、二硫蘇糖醇在溶液中的濃度為2mmol/L、TriS-HCl在溶液中的濃度為0.05mol/L，勻漿后將勻漿液在4 °C的低溫下以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取離心后的上清液，將四次所取得的上清液混合，得到基膜蛋白液，用于支架包被； (2)、取動(dòng)物食道中的粘膜和粘膜下層，清水沖洗干凈，并用75%酒精浸泡4h消毒，消毒后用PBS緩沖液沖洗干凈，將由青霉素與鏈霉素組成的雙抗和曲拉通混合到PBS緩沖液中形成PBS混合液，其中:曲拉通在PBS混合液的重量百分比為1%、青霉素和鏈霉素在PBS混合液中的濃度均為200U/L，再將上述粘膜及粘膜下層置于該P(yáng)BS混合液中，振蕩并持續(xù)渦旋，每12h更換PBS混合液，持續(xù)振蕩渦旋3天后用含雙抗的PBS緩沖液清洗粘膜及粘膜下層，其中:組成雙抗的青霉素和鏈霉素在PBS緩沖液中的濃度均為200U/L，然后將粘膜及粘膜下層在37°C的溫度下浸泡在含有DNA酶的PBS緩沖液中2h，其中:DNA酶在PBS緩沖液中的濃度為4500U/L，再用含雙抗的PBS緩沖液清洗，其中:組成雙抗的青霉素和鏈霉素在PBS緩沖液中的濃度均為200U/L，得到食道粘膜脫細(xì)胞基質(zhì)；
(3)、用三氟乙醇溶解聚己內(nèi)酯得到聚己內(nèi)酯溶液、用甲酸溶解絲素蛋白得到絲素蛋白溶液，并將聚己內(nèi)酯溶液和絲素蛋白溶液按溶質(zhì)重量比為4:1的比例混合得到混合液，然后以六氟異丙醇為溶劑調(diào)節(jié)混合液的濃度為0.125μg/ml，并作為電紡絲溶液，取步驟(2)所制備的食道粘膜脫細(xì)胞基質(zhì)作為基底，通過(guò)靜電紡絲裝置將電紡絲溶液在基底內(nèi)腔表面進(jìn)行靜電紡絲，獲得纖維直徑為400nm、厚度為200nm的多孔纖維膜，然后將此多孔纖維膜連同基底一起浸泡在步驟(1)所制備的基膜蛋白液中，在4 °C下浸泡24 h后取出，并以PBS緩沖液沖洗去多余基膜蛋白，得到包被了基膜蛋白的電紡絲/脫細(xì)胞基質(zhì)支架，備用；
(4)、將可降解聚酯型聚氨酯溶于1，4-二氧六環(huán)中，配制成重量濃度為20%的聚氨酯溶液，將該聚氨酯溶液澆注到帶有連續(xù)和點(diǎn)斷微槽結(jié)構(gòu)的模具上，制備成寬為8厘米且?guī)в须p面微槽的長(zhǎng)方形的聚氨酯薄片，其中聚氨酯薄片的一面為連續(xù)微槽，另一面為點(diǎn)斷微槽，連續(xù)微槽的結(jié)構(gòu)為:槽寬W1為200Mm、槽深30Mm、槽間距D1為30Mm ;點(diǎn)斷微槽的結(jié)構(gòu)為:槽寬W2為200Mm、槽深30Mm，每個(gè)隔斷長(zhǎng)L為200Mm，隔斷寬W為30Mm、同一行中相鄰兩個(gè)隔斷的間距D為30Mm，連續(xù)微槽和點(diǎn)斷微槽互相垂直，且連續(xù)微槽的延伸方向?yàn)榫郯滨ケ∑拈L(zhǎng)度方向，點(diǎn)斷微槽的延伸方向?yàn)榫郯滨ケ∑膶挾确较颍?br> (5)、從蠶絲或蠶繭中提取絲素蛋白，并在聚氨酯薄片的內(nèi)外表面以化學(xué)方式接上可供反應(yīng)的自由胺基，然后將接有自由胺基的聚氨酯薄片浸在重量濃度為3%的戊二醛溶液中室溫反應(yīng)2h，之后用去離子水沖洗去除聚氨酯薄片表面未反應(yīng)的戊二醛，再將聚氨酯薄片浸入濃度為lmg/ml的絲素蛋白溶液中，在4°C的溫度下浸泡12h，取出后用PBS緩沖液沖洗去除聚氨酯薄片表面沒(méi)有反應(yīng)的絲素蛋白；
(6)、將聚氨酯薄片以點(diǎn)斷微槽為內(nèi)表面一點(diǎn)斷微槽呈環(huán)向、連續(xù)微槽為外表面一連續(xù)微槽呈縱向包裹于由步驟(3)所制得的包被了基膜蛋白的電紡絲/脫細(xì)胞基質(zhì)支架外，并將聚氨酯薄片縱向縫接成管狀，得到具有組織學(xué)結(jié)構(gòu)的人工食道；
(7)、將制得的人工食道以75%酒精浸泡消毒30分鐘，然后以滅菌PBS緩沖液沖洗，無(wú)菌保存。
[0012]將本方法所制得的人工食道與人體食道對(duì)接的方法為:將人體食道中的病變部位整段切除，按層/層對(duì)接的方法，將人工食道與剩余食道組織縫接，即電紡絲/脫細(xì)胞基質(zhì)與食道的粘膜下層縫接，聚氨酯薄片上的點(diǎn)段微槽層與人體食道中的環(huán)形肌層對(duì)接，聚氨酯薄片上的連續(xù)微槽層與人體食道中的縱形肌層對(duì)接，逐層縫合傷口，體內(nèi)培育6~18個(gè)月。 [0013]上述實(shí)施例所述的步驟(4)中，可降解聚酯型聚氨酯可用其它具有彈性的可降解聚合物材料替代，并溶解于與該類可降解聚合物相適配的溶劑中用于制備帶微槽結(jié)構(gòu)的聚合物薄片。
【權(quán)利要求】
1.一種具有組織學(xué)結(jié)構(gòu)的人工食道的制備方法，其特征在于具體包括以下步驟: (1)、取動(dòng)物食道中的粘膜及粘膜下層，洗凈、剪碎，并將粘膜及粘膜下層組織浸入由NaCl, Tris-HCl、苯甲基磺酰氟和N-甲基馬來(lái)酰亞胺混合而成的溶液中，其中=NaCl在溶液中的濃度為3.4mol/L、Tris-HCl在溶液中的濃度為0.05mol/L、苯甲基磺酰氟在溶液中的濃度為2mmol/L、N-甲基馬來(lái)酰亞胺在溶液中的濃度為lmmol/L，勻漿后將勻漿液在4 °C的低溫下以8000~12000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取離心后的上清液，并將離心后剩下的沉淀物再浸入由NaCl、Tris-HCl、苯甲基磺酰氟和N-甲基馬來(lái)酰亞胺混合而成的溶液中，其中=NaCl在溶液中的濃度為0.5mol/L、Tris-HCl在溶液中的濃度為0.05mol/L、苯甲基磺酰氟在溶液中的濃度為2mmol/L、N-甲基馬來(lái)酰亞胺在溶液中的濃度為lmmol/L，勻漿后將勻漿液在4 °C的低溫下以8000~12000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取離心后的上清液，并將離心后剩下的沉淀物接著浸入由鹽酸胍、二硫蘇糖醇和Tris-HCl混合而成的溶液中，其中:鹽酸胍在溶液中的濃度為2.0mol/L、二硫蘇糖醇在溶液中的濃度為2mmol/L、Tris-HCl在溶液中的濃度為0.05mol/L，勻漿后將勻漿液在4 °C的低溫下以8000~12000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取離心后的上清液，并將離心后剩下的沉淀物最后浸入由鹽酸胍、二硫蘇糖醇和Tris-HCl混合而成的溶液中，其中:鹽酸胍在溶液中的濃度為4.0mol/L、二硫蘇糖醇在溶液中的濃度為2mmol/L、TriS-HCl在溶液中的濃度為0.05mol/L，勻漿后將勻漿液在4 °C的低溫下以8000~12000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取離心后的上清液，將四次所取得的上清液混合，得到基膜蛋白液，用于支架包被； (2)、取動(dòng)物食道中的粘膜和粘膜下層，清水沖洗干凈，并用75%酒精浸泡I~4h消毒，消毒后用PBS緩沖液沖洗干凈，將由青霉素與鏈霉素組成的雙抗和曲拉通混合到PBS緩沖液中形成PBS混合液，其中:曲拉通在PBS混合液的重量百分比為1%、青霉素和鏈霉素在PBS混合液中的濃度均為200U/L，再將上述粘膜及粘膜下層置于該P(yáng)BS混合液中，振蕩并持續(xù)渦旋，每12h更換PBS混合液，持續(xù)振蕩渦旋3天后用含雙抗的PBS緩沖液清洗粘膜及粘膜下層，其中:組成雙抗的青霉素和鏈霉素在PBS緩沖液中的濃度均為200U/L，然后將粘膜及粘膜下層在37°C的溫度下浸泡在含有DNA酶的PBS緩沖液中2h，其中:DNA酶在PBS緩沖液中的濃度為1000~5000U/L，再用含雙抗的PBS緩沖液清洗，其中:組成雙抗的青霉素和鏈霉素在PBS緩沖液中的濃度均為200U/L，得到食道粘膜脫細(xì)胞基質(zhì)； (3)、用三氟乙醇溶解聚己內(nèi)酯得到聚己內(nèi)酯溶液、用甲酸溶解絲素蛋白得到絲素蛋白溶液，并將聚己內(nèi)酯溶液和絲素蛋白溶液按溶質(zhì)重量比為4:1的比例混合得到混合液，然后以六氟異丙醇為溶劑調(diào)節(jié)混合液的濃度為0.125μg/ml，并作為電紡絲溶液，取步驟(2)所制備的食道粘膜脫細(xì)胞基質(zhì)作為基底，通過(guò)靜電紡絲裝置將電紡絲溶液在基底內(nèi)腔表面進(jìn)行靜電紡絲，獲得纖維直徑為50~500nm、厚度為100~200nm的多孔纖維膜，然后將此多孔纖維膜連同基底一起浸泡在步驟(1)所制備的基膜蛋白液中，在4 °C下浸泡24 h后取出，并以PBS緩沖液沖洗去多余基膜蛋白，得到包被了基膜蛋白的電紡絲/脫細(xì)胞基質(zhì)支架，備用； (4)、將可降解聚酯型聚氨酯溶于1，4-二氧六環(huán)中，配制成重量濃度為5~25%的聚氨酯溶液，將該聚氨酯溶液澆注到帶有連續(xù)和點(diǎn)斷微槽結(jié)構(gòu)的模具上，制備成寬為5~10厘米且?guī)в须p面微槽的長(zhǎng)方形的聚氨酯薄片，其中聚氨酯薄片的一面為連續(xù)微槽，另一面為點(diǎn)斷微槽，連續(xù)微槽的結(jié)構(gòu)為:槽寬200Mm、槽深30Mm、槽間距30Mm ;點(diǎn)斷微槽的結(jié)構(gòu)為:槽寬100~200Mm、槽深30Mm，每個(gè)隔斷長(zhǎng)100~200Mm，隔斷寬30Mm、同一行中相鄰兩個(gè)隔斷的間距為30Mm，所述的連續(xù)微槽和所述的點(diǎn)斷微槽互相垂直，且連續(xù)微槽的延伸方向?yàn)榫郯滨ケ∑拈L(zhǎng)度方向，點(diǎn)斷微槽的延伸方向?yàn)榫郯滨ケ∑膶挾确较颍? (5)、從蠶絲或蠶繭中提取絲素蛋白，并在聚氨酯薄片的內(nèi)外表面以化學(xué)方式接上可供反應(yīng)的自由胺基，然后將接有自由胺基的聚氨酯薄片浸在重量濃度為I~3%的戊二醛溶液中室溫反應(yīng)I~5h，之后用去離子水沖洗去除聚氨酯薄片表面未反應(yīng)的戊二醛，再將聚氨酯薄片浸入濃度為lmg/ml的絲素蛋白溶液中，在4°C的溫度下浸泡12~24h，取出后用PBS緩沖液沖洗去除聚氨酯薄片表面沒(méi)有反應(yīng)的絲素蛋白； (6)、將聚氨酯薄片以點(diǎn)斷微槽為內(nèi)表面一點(diǎn)斷微槽呈環(huán)向、連續(xù)微槽為外表面一連續(xù)微槽呈縱向包裹于由步驟(3)所制得的包被了基膜蛋白的電紡絲/脫細(xì)胞基質(zhì)支架外，并將聚氨酯薄片縱向縫接成管狀，得到具有組織學(xué)結(jié)構(gòu)的人工食道； (7)、將制得的人工食道以75%酒精浸泡消毒30分鐘，然后以滅菌PBS緩沖液沖洗，無(wú)菌保存； (8)、當(dāng)將所制得的人工食道與人體食道對(duì)接時(shí)，將人體食道中的病變部位整段切除，按層/層對(duì)接的方法，將人工食道與剩余食道組織縫接，即電紡絲/脫細(xì)胞基質(zhì)與食道的粘膜下層縫接，聚氨酯薄片上的點(diǎn)段微槽層與人體食道中的環(huán)形肌層對(duì)接，聚氨酯薄片上的連續(xù)微槽層與人體食道中的縱形肌層對(duì)接，逐層縫合傷口，體內(nèi)培育6~18個(gè)月。
【文檔編號(hào)】A61L27/22GK104013998SQ201410227418
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年5月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月26日
【發(fā)明者】竺亞斌, 侯雷, 呂靜靜, 鞏長(zhǎng)鳳, 金嘉長(zhǎng) 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)