一種去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體的制備方法及應(yīng)用，在制備組織工程材料方面的應(yīng)用；制備方法為將牛皮質(zhì)骨進(jìn)行冷凍粉碎后，篩出粒徑小于200um的骨顆粒，并對(duì)骨顆粒進(jìn)行脫脂、脫鈣和脫蛋白處理。本發(fā)明所得去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體的免疫原性低、細(xì)胞粘附率高。在靜態(tài)培養(yǎng)條件下其所培養(yǎng)細(xì)胞的活性高、干細(xì)胞表型保持完整、且由于去除了脫鈣骨基質(zhì)中的蛋白活性成分，該類去蛋白脫鈣骨基質(zhì)顆粒在培養(yǎng)過程中將不會(huì)引起干細(xì)胞等目的細(xì)胞發(fā)生成骨分化；通過對(duì)BMSCs的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該微載體顆?？捎糜趧?dòng)態(tài)懸浮培養(yǎng)條件，在適宜于細(xì)胞培養(yǎng)的攪拌速度下可順利形成懸浮，其細(xì)胞粘附率較cytodex3稍高、擴(kuò)增效率相仿。
【專利說明】一種去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前種子細(xì)胞的使用主要以自體細(xì)胞為主，但其可獲取量太少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床使用所需，因此需要在體外進(jìn)行擴(kuò)增，待達(dá)到所需數(shù)目后進(jìn)一步完成組織工程骨的構(gòu)建。在種子細(xì)胞的體外擴(kuò)增方面，今年來以微載體在動(dòng)態(tài)懸浮培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)效果較為優(yōu)越且得到廣泛認(rèn)可。
[0003]但是，目前使用較為廣泛的、可作為同類產(chǎn)品考量標(biāo)準(zhǔn)品的微載體選擇主要為Cytodex系列產(chǎn)品，其中以CytodeX3應(yīng)用較為廣泛，該產(chǎn)品為人工合成的含變性蛋白表面包被的右旋糖酐顆粒，具有良好的細(xì)胞粘附性及均質(zhì)性；其細(xì)胞培養(yǎng)效率高，可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增種子細(xì)胞用于疫苗、輔酶等的批量生產(chǎn)，或大量擴(kuò)增干細(xì)胞等種子細(xì)胞并經(jīng)消化分離后收集以用于組織工程構(gòu)建。但是，Cytodex類產(chǎn)品均為人工合成材料，多為不可降解材料，無法直接用于體內(nèi)組織修復(fù)過程，導(dǎo)致經(jīng)微載體培養(yǎng)擴(kuò)增的種子細(xì)胞不能直接以微載體為體內(nèi)移植載體而植入體內(nèi)。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，額外的細(xì)胞消化分離過程會(huì)破壞胞外基質(zhì)，從而造成細(xì)胞活性的喪失及細(xì)胞數(shù)目的浪費(fèi)。在解決上述問題的過程中，研究者們?cè)噲D通過改良細(xì)胞獲取手段、優(yōu)化微載體材料及制備等方法來提高細(xì)胞利用率及有效率，但大都因?yàn)榧?xì)胞活性降低或體內(nèi)局部酸累積無明顯改善而終止，導(dǎo)致可直接用于體內(nèi)移植的微載體材料尚較為缺乏。
[0004]為了得到質(zhì)地統(tǒng)一、可控性好的微載體顆粒(微載體的基本要求之一)，在微載體制備過程中多采用人工合成材料及方法來進(jìn)行微載體加工，這將勢(shì)必造成微載體材料在體內(nèi)的降解性差或不可降解，因而不能作為體內(nèi)植入材料來應(yīng)用于種子細(xì)胞的體內(nèi)移植載體，導(dǎo)致種子細(xì)胞在經(jīng)微載體培養(yǎng)擴(kuò)增后仍需進(jìn)行消化分離以進(jìn)行其與移植支架材料的再貼壁過程。總而言之，在現(xiàn)行的微載體制備思路下，采用人工合成材料制備的微載體顆粒將很難作為種子細(xì)胞的移植載體，由其培養(yǎng)擴(kuò)增所得的種子細(xì)胞將不可避免的進(jìn)行再消化分離。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體的制備方法及應(yīng)用，制備出可用于體外動(dòng)態(tài)懸浮培養(yǎng)條件并大量擴(kuò)增種子細(xì)胞的微載體。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案:
[0007]—種去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體在制備組織工程材料方面的應(yīng)用。
[0008]所述組織工程材料為修復(fù)腔隙狀組織缺損區(qū)的組織工程材料。
[0009]所述組織工程材料為修復(fù)大段骨缺損的組織工程材料。
[0010]一種去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體的制備方法，將牛皮質(zhì)骨進(jìn)行冷凍粉碎后，篩出粒徑小于200um的骨顆粒，并對(duì)骨顆粒進(jìn)行脫脂、脫鈣和脫蛋白處理，得到去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體。
[0011]所述冷凍粉碎前將牛皮質(zhì)骨在-80°c保存24h以上。
[0012]所述脫脂具體過程為:向脫脂液中加入骨顆粒并持續(xù)攪拌2_3h后用蒸餾水沖洗骨顆粒，然后把沖洗后的骨顆粒加入到脫脂液中，持續(xù)攪拌2-3h，其中每3mL脫脂液中加入0.8-1.2g骨顆粒，脫脂液為甲醇與氯仿體積比為1:1的混合物。
[0013]所述脫鈣具體為:將骨顆粒加入到0.5-0.6mol/L的鹽酸中，持續(xù)攪拌8_12h，然后將骨顆粒取出，然后重復(fù)上述過程2-3次；其中，每3mL鹽酸中加入骨顆粒的質(zhì)量為0.8-1.2g0
[0014]所述脫蛋白處理具體為:室溫下，將脫鈣處理后的骨顆粒，依次置于2-3mol/L的CaCl2溶液攪拌16-24h，0.5mol/L的EDTA溶液中攪拌4h，8mol/L的LiCl溶液中攪拌16-24h，然后在52°C的水浴下加熱4-6h，再用6mol/L脲素溶液抽提36_48h，水洗后收集顆粒，并經(jīng)過凍干處理；其中，所用2mol/L的CaCl2溶液、0.5mol/L的EDTA溶液、8mol/L的LiCl溶液、6mol/L脲素溶液的體積為脫鈣處理后的骨顆粒質(zhì)量的2_3倍。
[0015]相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有的有益效果:本發(fā)明將牛皮質(zhì)骨進(jìn)行脫鈣及脫蛋白處理，所得去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體的免疫原性低、細(xì)胞粘附率高。在靜態(tài)培養(yǎng)條件下其所培養(yǎng)細(xì)胞的活性高、干細(xì)胞表型保持完整、且由于去除了脫鈣骨基質(zhì)中的蛋白活性成分(如BMPs等)，該 類去蛋白脫鈣骨基質(zhì)顆粒在培養(yǎng)過程中將不會(huì)引起干細(xì)胞等目的細(xì)胞發(fā)生成骨分化；通過對(duì)BMSCs (骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該微載體顆粒可用于動(dòng)態(tài)懸浮培養(yǎng)條件，在適宜于細(xì)胞培養(yǎng)的攪拌速度下可順利形成懸浮，其細(xì)胞粘附率較cytodex3稍高、擴(kuò)增效率相仿，14天的培養(yǎng)期結(jié)束后對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，證實(shí)BMSCs的表型、多能性、再增殖能力的保持令人滿意；通過動(dòng)物體內(nèi)初步試驗(yàn)證實(shí)該微載體可經(jīng)16#注射針頭順利完成體內(nèi)注射，并可在異位成骨且細(xì)胞存活性更好。
[0016]另外，本發(fā)明對(duì)牛去蛋白脫鈣骨基質(zhì)顆粒同樣進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(大鼠、新西蘭兔)的體內(nèi)免疫反應(yīng)及降解性、成骨性的檢測(cè)，結(jié)果均可達(dá)到組織工程學(xué)組織構(gòu)建對(duì)于植入型生物材料的要求；在以凝膠混合微載體-細(xì)胞復(fù)合物進(jìn)行體內(nèi)早期免疫反應(yīng)測(cè)試的過程中，術(shù)后7d見微少量免疫細(xì)胞浸潤，表明其免疫原性低、生物相容性好。
[0017]本發(fā)明中去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體的制備方法簡單，易于操作，并且制得的微載體的免疫原性低、細(xì)胞粘附率高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為DpDBM微載體的表面掃描電鏡圖片；
[0019]圖2為DpDBM微載體的細(xì)胞粘附低倍掃描電鏡圖片；
[0020]圖3為DpDBM微載體的細(xì)胞粘附高倍掃描電鏡圖片；
[0021]圖4為Cytodex3微載體的表面掃描電鏡圖片；
[0022]圖5為CytodeX3微載體的細(xì)胞粘附低倍掃描電鏡圖片；
[0023]圖6為CytodeX3微載體的細(xì)胞粘附高倍掃描電鏡圖片。
【具體實(shí)施方式】[0024]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明中的溶液均是指水溶液。
[0025]一種去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體的制備方法，包括以下步驟:
[0026]先將牛皮質(zhì)骨在_80°C保存24h以上(冷凍處理可降低材料的免疫原性)，再將牛皮質(zhì)骨進(jìn)行冷凍粉碎后，加入到脫脂液中，持續(xù)攪拌2-3h，其中每3mL脫脂液中加入0.8-1.2g g骨顆粒篩出粒徑小于200um的骨顆粒，并對(duì)骨顆粒進(jìn)行脫脂，即向脫脂液中加入骨顆粒并持續(xù)攪拌2-3h后用蒸餾水沖洗骨顆粒，然后把沖洗后的骨顆粒，脫脂液為甲醇、氯仿體積比1:1的混合物；然后進(jìn)行脫鈣，即將骨顆粒加入到0.5-0.6mol/L的鹽酸中，持續(xù)攪拌8-12h，然后將骨顆粒取出，漂洗后放入0.5-0.6mol/L的鹽酸中，持續(xù)攪拌8_12h，然后將骨顆粒取出，漂洗后放入0.5-0.6mol/L的鹽酸中，持續(xù)攪拌12_24h，然后將骨顆粒取出放入0.5-0.6mol/L的鹽酸中，持續(xù)攪拌12_24h，其中每3mL鹽酸中加入骨顆粒的質(zhì)量為0.8-1.2g，因?yàn)殚_始時(shí)脫鈣較快，所以在前24小時(shí)內(nèi)以每12h更換脫鈣液一次；然后將將骨顆粒進(jìn)行脫蛋白處理，篩選出合適大小顆粒(直徑小于200um的顆粒)，得到去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體。
[0027]其中，脫蛋白處理即采用標(biāo)準(zhǔn)的BMP提取過程，具體為室溫下，將脫鈣處理后的骨顆粒，依次置于2-3mol/L的CaCl2溶液攪拌16_24h，0.5mol/L的EDTA溶液中攪拌4h，8mol/L的LiCl溶液中攪拌16-24h，然后在52°C的水浴下加熱4_6h，再用6mol/L脲素溶液抽提36-48h，水洗后收集顆粒，并經(jīng)過凍干處理；其中，所用2mol/L的CaCl2溶液、0.5mol/L的EDTA溶液、8mol/L的LiCl溶液、6mol/L脲素溶液的體積為脫鈣處理后的骨顆粒質(zhì)量的2_3倍。
[0028]實(shí)施例1
[0029]一種去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體的制備方法，包括以下步驟:
[0030]先將牛皮質(zhì)骨在_80°C保存24h以上(冷凍處理可降低材料的免疫原性)，再將牛皮質(zhì)骨進(jìn)行冷凍粉碎后，加入到脫脂液中，持續(xù)攪拌2h，其中每3mL脫脂液中加入0.Sg骨顆粒篩出粒徑小于200um的骨顆粒，并對(duì)骨顆粒進(jìn)行脫脂，即向脫脂液中加入骨顆粒并持續(xù)攪拌3h后用蒸餾水沖洗骨顆粒，然后把沖洗后的骨顆粒，脫脂液為甲醇、氯仿體積比1:1的混合物；然后進(jìn)行脫鈣，即將骨顆粒加入到0.6mol/L的鹽酸中，持續(xù)攪拌12h，然后將骨顆粒取出，漂洗后放入0.5mol/L的鹽酸中，持續(xù)攪拌8h，然后將骨顆粒取出，漂洗后放入0.5mol/L的鹽酸中，持續(xù)攪拌24h，然后將骨顆粒取出放入0.6mol/L的鹽酸中，持續(xù)攪拌12h，其中每3mL鹽酸中加入骨顆粒的質(zhì)量為1.2g,因?yàn)殚_始時(shí)脫鈣較快，所以在前24小時(shí)內(nèi)以每12h更換脫鈣液一次；然后將骨顆粒進(jìn)行脫蛋白處理，篩選出合適大小顆粒(直徑小于200um的顆粒)，得到去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體。
[0031]其中，脫蛋白處理即采用標(biāo)準(zhǔn)的BMP提取過程，具體為室溫下，將脫鈣處理后的骨顆粒，依次置于2mol/L的CaCl2溶液攪拌16h，0.5mol/L的EDTA溶液中攪拌4h，8mol/L的LiCl溶液中攪拌24h，然后在52°C的水浴下加熱6h，再用6mol/L脲素溶液抽提36h，水洗后收集顆粒，并經(jīng)過凍干處理；其中，所用2mol/L的CaCl2溶液、0.5mol/L的EDTA溶液、8mol/L的LiCl溶液、6mol/L脲素溶液的體積為脫鈣處理后的骨顆粒質(zhì)量的3倍。
[0032]實(shí)施例2
[0033]一種去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體的制備方法，包括以下步驟:
[0034]先將牛皮質(zhì)骨在_80°C保存24h以上(冷凍處理可降低材料的免疫原性)，再將牛皮質(zhì)骨進(jìn)行冷凍粉碎后，加入到脫脂液中，持續(xù)攪拌3h，其中每3mL脫脂液中加入1.2g骨顆粒篩出粒徑小于200um的骨顆粒，并對(duì)骨顆粒進(jìn)行脫脂，即向脫脂液中加入骨顆粒并持續(xù)攪拌2h后用蒸餾水沖洗骨顆粒，然后把沖洗后的骨顆粒，脫脂液為甲醇、氯仿體積比1:1的混合物；然后進(jìn)行脫鈣，即將骨顆粒加入到0.5mol/L的鹽酸中，持續(xù)攪拌8h，然后將骨顆粒取出，漂洗后放入0.6mol/L的鹽酸中，持續(xù)攪拌12h，然后將骨顆粒取出，漂洗后放入
0.6mol/L的鹽酸中，持續(xù)攪拌12h，然后將骨顆粒取出放入0.5mol/L的鹽酸中，持續(xù)攪拌12h，其中每3mL鹽酸中加入骨顆粒的質(zhì)量為0.8g，因?yàn)殚_始時(shí)脫鈣較快，所以在前24小時(shí)內(nèi)以每12h更換脫鈣液一次；然后將骨顆粒進(jìn)行脫蛋白處理，篩選出合適大小顆粒(直徑小于200um的顆粒)，得到去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體。
[0035]其中，脫蛋白處理即采用標(biāo)準(zhǔn)的BMP提取過程，具體為室溫下，將脫鈣處理后的骨顆粒，依次置于3mol/L的CaCl2溶液攪拌24h，0.5mol/L的EDTA溶液中攪拌4h，8mol/L的LiCl溶液中攪拌16h，然后在52°C的水浴下加熱4h，再用6mol/L脲素溶液抽提48h，水洗后收集顆粒，并經(jīng)過凍干處理；其中，所用2mol/L的CaCl2溶液、0.5mol/L的EDTA溶液、8mol/L的LiCl溶液、6mol/L脲素溶液的體積為脫鈣處理后的骨顆粒質(zhì)量的3倍。
[0036]實(shí)施例3
[0037]—種去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體的制備方法，包括以下步驟:
[0038]先將牛皮質(zhì)骨在_80°C保存24h以上(冷凍處理可降低材料的免疫原性)，再將牛皮質(zhì)骨進(jìn)行冷凍粉碎后，加入到脫脂液中，持續(xù)攪拌3h，其中每3mL脫脂液中加入Ig骨顆粒篩出粒徑小于200um的骨顆粒，并對(duì)骨顆粒進(jìn)行脫脂，即向脫脂液中加入骨顆粒并持續(xù)攪拌2h后用蒸餾水沖洗骨顆粒，然后把沖洗后的骨顆粒，脫脂液為甲醇、氯仿體積比1:1的混合物；然后進(jìn)行脫鈣，即將骨顆粒加入到0.5mol/L的鹽酸中，持續(xù)攪拌10h，然后將骨顆粒取出，漂洗后放入0.6mol/L的鹽酸中，持續(xù)攪拌llh，然后將骨顆粒取出，漂洗后放入
0.5mol/L的鹽酸中，持續(xù)攪拌18h，其中每3mL鹽酸中加入骨顆粒的質(zhì)量為lg，因?yàn)殚_始時(shí)脫鈣較快，所以在前24小時(shí)內(nèi)以每12h更換脫鈣液一次；然后將骨顆粒進(jìn)行脫蛋白處理，篩選出合適大小顆粒(直徑小于200um的顆粒)，得到去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體。
[0039]其中，脫蛋白處理即采用標(biāo)準(zhǔn)的BMP提取過程，具體為室溫下，將脫鈣處理后的骨顆粒，依次置于3mol/L的CaCl2溶液攪拌20h，0.5mol/L的EDTA溶液中攪拌4h，8mol/L的LiCl溶液中攪拌19h，然后在52°C的水浴下加熱5h，再用6mol/L脲素溶液抽提40h，水洗后收集顆粒，并經(jīng)過凍干處理；其中，所用2mol/L的CaCl2溶液、0.5mol/L的EDTA溶液、8mol/L的LiCl溶液、6mol/L脲素溶液的體積為脫鈣處理后的骨顆粒質(zhì)量的2倍。
[0040]本發(fā)明制備的去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體的應(yīng)用通過以下實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn):
[0041]種子細(xì)胞的微載體動(dòng)態(tài)懸浮培養(yǎng)(以BMSCs為例):采用攪拌式生物反應(yīng)器動(dòng)態(tài)懸浮培養(yǎng)預(yù)先培養(yǎng)至一定數(shù)目的干細(xì)胞量，以與CytodeX3相仿的接種量及培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行干細(xì)胞擴(kuò)增(接種參數(shù)為 3mg/mL ；l*105cell/mL ；40rpm/min)。BMSCs 采用 8w wistar 大鼠骨髓沖洗所培養(yǎng)的BMSCs原代，擴(kuò)增至P3代后進(jìn)行微載體接種，種植密度及微載體密度如上述接種參數(shù)，因需與CYT0DEX3形成對(duì)比，故采用CYT0DEX3的常用接種參數(shù)(也為微載體使用的推薦參數(shù))。
[0042]培養(yǎng)所得微載體-細(xì)胞復(fù)合物體內(nèi)移植:
[0043]I)利用藻酸鹽凝膠與微載體-細(xì)胞混合[0044]將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-3%藻酸鈉溶液加入到lOOmmol/L氯化鈣溶液形成藻酸鈣凝膠，首先采用藻酸鈉溶液混懸微載體-細(xì)胞復(fù)合物，隨后緩慢添加氯化鈣溶液形成凝膠，制備出可通過20mL注射器針頭注射的凝膠狀混合物，構(gòu)建的組織工程材料可通過微創(chuàng)注射的方式用于修復(fù)腔隙狀組織缺損區(qū)。
[0045]2)由于本發(fā)明去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體顆粒較小(<200um)，故在組織工程學(xué)構(gòu)建過程中，可作為承載高活性的種子細(xì)胞的直接移植載體，以整體形式(移植單元)與大孔徑材料聯(lián)合應(yīng)用，從而獲得負(fù)重區(qū)組織替代材料所需的力學(xué)特性，其優(yōu)點(diǎn)在于:大孔徑材料整體營養(yǎng)供應(yīng)率較高，但其可粘附的有效面積則相應(yīng)不足，與微載體-細(xì)胞復(fù)合物的聯(lián)合應(yīng)用則恰好解決這一難題，而大孔徑材料也可為微載體的使用提供所需的力學(xué)性能，從而拓寬可植入型微載體的利用途徑及方式。
[0046]本發(fā)明的去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體可用于構(gòu)建組織工程學(xué)生物替代材料，具體為:體外對(duì)種子細(xì)胞的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)擴(kuò)增(可同時(shí)完成所需相關(guān)分化誘導(dǎo)等步驟)；作為種子細(xì)胞的直接移植載體與凝膠、大孔支架等材料聯(lián)合應(yīng)用于體內(nèi)大段骨缺損的修復(fù)。
[0047]本發(fā)明的去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體與人工合成聚合物類似，不含誘導(dǎo)分化的活性成分，因此可完成對(duì)種子細(xì)胞的快速擴(kuò)增及表型維持；對(duì)于部分已分化細(xì)胞的培養(yǎng)，添加相應(yīng)的誘導(dǎo)性培養(yǎng)液即可得到表型的維持；本發(fā)明去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體具有良好的生物相容性及降解特性，免疫排斥小，故能在移植入體內(nèi)后得到良好的組織修復(fù)效果，且由其所培養(yǎng)的細(xì)胞，其增殖率高、活性好，同樣確保了組織修復(fù)的高效性。
[0048]圖1-3為DpD BM微載體及細(xì)胞貼附情況的掃描電鏡圖片，圖4_6為及CytodeX3微載體及細(xì)胞貼附情況的掃描電鏡圖片，從圖1-6可以看出與CytodeX3微載體相比，DpDBM微載體取得了類似細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增效果。
[0049]本發(fā)明對(duì)牛去蛋白脫鈣骨基質(zhì)顆粒同樣進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(大鼠、新西蘭兔)的體內(nèi)免疫反應(yīng)及降解性、成骨性的檢測(cè)，結(jié)果均可達(dá)到組織工程學(xué)組織構(gòu)建對(duì)于植入型生物材料的要求；在以凝膠混合微載體-細(xì)胞復(fù)合物進(jìn)行體內(nèi)早期免疫反應(yīng)測(cè)試的過程中，術(shù)后7d見微少量免疫細(xì)胞浸潤，表明其免疫原性低、生物相容性好。
【權(quán)利要求】
1.一種去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體在制備組織工程材料方面的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述組織工程材料為修復(fù)腔隙狀組織缺損區(qū)的組織工程材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述組織工程材料為修復(fù)大段骨缺損的組織工程材料。
4.一種去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體的制備方法，其特征在于，將牛皮質(zhì)骨進(jìn)行冷凍粉碎后，篩出粒徑小于200um的骨顆粒，并對(duì)骨顆粒進(jìn)行脫脂、脫鈣和脫蛋白處理，得到去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體的制備方法，其特征在于，所述冷凍粉碎前將牛皮質(zhì)骨在_80°C保存24h以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體的制備方法，其特征在于，所述脫脂具體過程為:向脫脂液中加入骨顆粒并持續(xù)攪拌2-3h后用蒸餾水沖洗骨顆粒，然后把沖洗后的骨顆粒加入到脫脂液中，持續(xù)攪拌2-3h，其中每3mL脫脂液中加入0.8-1.2g骨顆粒，脫脂液為甲醇與氯仿體積比為1:1的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種去蛋白脫鈣骨基質(zhì)植入型微載體的制備方法，其特征在于，所述脫鈣具體為:將骨顆粒加入到0.5-0.6mol/L的鹽酸中，持續(xù)攪拌8_12h，然后將骨顆粒取出，然后重復(fù)上述過程2-3次；其中，每3mL鹽酸中加入骨顆粒的質(zhì)量為0.8-1.2g。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種去蛋白脫鈣骨基質(zhì)制備植入型微載體的制備方法，其特征在于，所述脫蛋 白處理具體為:室溫下，將脫鈣處理后的骨顆粒，依次置于2-3mol/L的CaCl2溶液攪拌16-24h，0.5mol/L的EDTA溶液中攪拌4h，8mol/L的LiCl溶液中攪拌16-24h，然后在52°C的水浴下加熱4-6h，再用6mol/L脲素溶液抽提36_48h，水洗后收集顆粒，并經(jīng)過凍干處理；其中，所用2mol/L的CaCl2溶液、0.5mol/L的EDTA溶液、8mol/L的LiCl溶液、6mol/L脲素溶液的體積為脫鈣處理后的骨顆粒質(zhì)量的2_3倍。
【文檔編號(hào)】A61L27/38GK103990180SQ201410225274
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月26日
【發(fā)明者】張智勇, 裴國獻(xiàn), 鄒繼偉 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)