一種用于弓形蟲感染預(yù)防的疫苗和制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明首先提供一種用于弓形蟲感染預(yù)防的核苷酸序列，其含有選自以下的核苷酸序列：1）序列表中SEQ?ID?No.1中所示的核苷酸序列；2）與1）中所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；3）對上述1）或2）所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾，并具有弓形蟲感染預(yù)防功能的核苷酸序列。本發(fā)明還提供一種疫苗，其包括上述的核苷酸序列，以及醫(yī)學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的質(zhì)粒DNA疫苗pVAX-ROP38可有效地預(yù)防和控制弓形蟲動物模型（昆明鼠）的感染，即可有效的延長小鼠的存活時(shí)間，減少腦包囊的荷蟲量。因此，質(zhì)粒pVAX-ROP38能作為DNA疫苗候選抗原抗弓形蟲的感染。
【專利說明】一種用于弓形蟲感染預(yù)防的疫苗和制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及一種用于弓形蟲感染預(yù)防的疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002]剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii,Τ.gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲,可引起人獸共患弓形蟲病。弓形蟲可感染包括人類在內(nèi)的幾乎所有的哺乳類動物，貓科動物是其主要傳染源。全世界約有1/3的成年人感染，我國人群的感染率為5%~20%，家畜動物感染率為10%~50%。作為一種機(jī)會致病因子，弓形蟲在正常宿主的機(jī)體中多呈隱性感染，無明顯臨床癥狀；但對于器官移植、艾滋病、惡性腫瘤患者等免疫缺陷或免疫抑制者，弓形蟲可能是致死因子之一；孕婦感染弓形蟲可導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎以及胎嬰先天性缺陷、發(fā)育畸形、腦炎及腦膜炎等。弓形蟲感染可 引起家畜發(fā)生高熱流產(chǎn)，并能和其他病原微生物協(xié)同作用，給全世界的畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。使用安全有效的疫苗接種被認(rèn)為可能是預(yù)防弓形蟲病的最佳預(yù)防措施。
[0003]常用于弓形蟲疫苗研究的候選抗原主要有微線體蛋白(microneme protein)、棒狀體蛋白(rhoptry proteins, ROPs)、膜表面抗原(surface antige, SAG)及致密顆粒蛋白(dense granule protein)。其中，微線體是頂復(fù)門(Phylum Apicomplexa)原蟲的一種細(xì)胞器，也是弓形蟲重要的具有分泌功能的細(xì)胞器，在蟲體入侵宿主細(xì)胞階段發(fā)揮重要作用。ROPs是速殖子頂端棒狀體分泌的對弓形蟲侵入宿主細(xì)胞起重要作用的蛋白質(zhì)，在蟲體入侵、納蟲空泡(parasitophorous vacuole, PV)的形成和修飾過程中起著重要作用，它是重要的入侵和毒力作用因子。弓形蟲膜表面蛋白I (major surface proteinl, SAGl)也是研究最多的疫苗候選分子之一。因此研究與弓形蟲入侵及相關(guān)毒力因子的疫苗候選抗原，對于抗弓形蟲疫苗的研究，以及弓形蟲病的預(yù)防和控制具有重大意義。
[0004]弓形蟲疫苗的研究經(jīng)歷了全蟲疫苗、蟲體特異組分疫苗、基因工程疫苗以及DNA疫苗，DNA疫苗又包括單基因疫苗和復(fù)合基因疫苗。目前，研究較多的是復(fù)合多價(jià)疫苗和核酸疫苗。各種疫苗均有其優(yōu)缺點(diǎn)。滅活疫苗的安全性較好，但其抗感染的能力弱；弱毒疫苗有著較好的保護(hù)性，但在安全性上一直存在著毒力返強(qiáng)及弓形蟲感染中間宿主后在體內(nèi)形成組織包囊等問題；基因工程疫苗生產(chǎn)過程復(fù)雜、技術(shù)難度大、且生產(chǎn)成本較高，其保護(hù)力及安全性還有待進(jìn)一步改進(jìn)；核酸疫苗具有無需使用佐劑、無需表達(dá)和純化重組抗原、且能產(chǎn)生CTL作用、免疫具有持續(xù)性及可制成多價(jià)疫苗等優(yōu)點(diǎn)而得到了廣泛的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用于弓形蟲感染預(yù)防的疫苗。為此，本發(fā)明還提供所述疫苗的制備方法及其應(yīng)用。
[0006]棒狀體蛋白38(R0P38)，是一種在不同蟲株間存在不同表達(dá)的活性酶，分布于棒狀體內(nèi)，與弓形蟲PVM的形成有關(guān)，而且是繼R0P16和GRA15之后，第三個(gè)被發(fā)現(xiàn)的能改變宿主信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白，因此，弓形蟲R0P38有望成為理想的疫苗候選抗原。
[0007]本發(fā)明提供一種用于弓形蟲感染預(yù)防的核苷酸序列，其含有選自以下的核苷酸序列:1)序列表中SEQ ID N0.1中所示的核苷酸序列；
[0008]2)與I)中所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；
[0009]3)對上述I)或2)所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾，并具有弓形蟲感染預(yù)防功能的核苷酸序列。
[0010]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種重組蛋白，其氨基酸序列由權(quán)利要求1所述的核苷酸序列編碼。
[0011]優(yōu)選地，所述氨基酸序列參見序列表中SEQ ID N0.2。
[0012]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種重組載體，其包括權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。[0013]本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種重組質(zhì)粒，其核苷酸序列為序列表中SEQ IDN0.3所示的核苷酸序列。
[0014]本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種疫苗，其包括權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，以及醫(yī)學(xué)上可接受的載體。
[0015]本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供上述的核苷酸序列、重組蛋白、重組載體、重組質(zhì)粒、疫苗在弓形蟲感染預(yù)防中的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供一種上述疫苗的制備方法，步驟如下:
[0017](I)提取弓形蟲RH株總RNA;
[0018](2) RT-PCR 擴(kuò)增 RH 株總 RNA ；
[0019](3)將步驟2中的擴(kuò)增產(chǎn)物與載體連接；
[0020](4) pVAX I質(zhì)粒的小量提??；
[0021](5)回收pVAX I載體及目的片段R0P38 ；
[0022](6)連接pVAX I載體與目的片段R0P38 ；
[0023](7)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至宿主菌中。
[0024]優(yōu)選地，所述RT-PCR擴(kuò)增RH株總RNA時(shí)所用引物為:
[0025]上游引物:5'-CGGGGTACCATGAAAAATACTCTGTTGTCA-3'；
[0026]下游引物:5'-CGCGGATCCTCAAAATTGATGCGTTCTTAT-3'。
[0027]優(yōu)選地，所述RT-PCR擴(kuò)增RH株總RNA時(shí)PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性 40sec，55°C復(fù)性 30sec ;72°C延伸 lmin35sec ；35 個(gè)循環(huán)，最后，72°C延伸 IOmin0
[0028]本發(fā)明質(zhì)粒DNA疫苗pVAX-R0P38可有效地預(yù)防和控制弓形蟲動物模型(昆明鼠)的感染，即可有效的延長小鼠的存活時(shí)間，減少腦包囊的荷蟲量。因此，質(zhì)粒PVAX-R0P38能作為DNA疫苗候選抗原抗弓形蟲的感染。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中:
[0030]圖1是pVAX-R0P38構(gòu)建路線；
[0031]圖2是弓形蟲RH株死亡情況；[0032]圖3 是 pMD18_T 質(zhì)粒；
[0033]圖4 是 pVAXI 質(zhì)粒。
【具體實(shí)施方式】
[0034]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0035]本發(fā)明中實(shí)驗(yàn)材料購自:
[0036]雌性KM鼠，6w齡左右，體重20±2g，購自蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。
[0037]宿主菌，弓形蟲RH、PRU株，pVAX I真核表達(dá)載體等材料，均為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所寄生蟲功能基因組學(xué)研究室保存并提供。
[0038]PrimeScript?One Step RT-PCR Kit Ver.2 (貨號:RR055B)、10XPCR Buffer(Mg2+free)>MgCl2 (25mmol/L)、dNTP Mixture (2.5mmol/L each)、Ex_Taq (5U/ μ L)(貨號:DDR100D)、pMD18-T Vector (貨號:D103A)、BamH I (貨號:D1010A)、XhoI (貨號:D1094A)、KpnI (貨號:D1068A)、PstI (貨號:D1073A)、XbaI (貨號:D1093A)、10XM BufferUOXKBuffer、10 X 6 X Loading Buffer:購自 TaKaRa 公司；
[0039]Wizard* SV Genomic DNA Purification System (貨號:A2360)、Tris_Cl、EDTA、IPTG、X-gal、T4DNA 連接酶:購自 Promega 公司；
[0040]RNAprep Pure Tissue Kit (貨號:DP431)、TIANprep Mini Plasmid Kit (貨號:DP103-02)、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(貨號:貨號:DP209_02)、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒(貨號:DP204-02):購自天根生化科技(北京)有限公司；
[0041]氨節(jié)青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、瓊脂糖:購自Sigma公司；
[0042]其他化學(xué)試劑如NaCl、、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純級產(chǎn)品。
[0043]一、弓形蟲PRU株pVAX-R0P38疫苗的制備方法如下:
[0044]1.弓形蟲PRU株總RNA的提取:將弓形蟲PRU株按20個(gè)包囊/只的劑量灌胃接種于KM鼠，4周后頸椎脫臼處死小鼠，在75%酒精中浸泡2~3min。取出并于超凈工作臺中，無菌采集腦組織并將其置于研缽中，加入ImL PBS進(jìn)行研磨，并搜集備用。用天根生化科技(北京)有限公司的試劑盒RNAprep Pure Tissue Kit提取弓形蟲PRU株總RNA，提取的具體方法和步驟參見說明書。
[0045]2.RT-PCR擴(kuò)增:以所提取的弓形蟲RH株總RNA為模板，用大連寶生物工程公司PrimeScript?One Step RT-PCR Kit Ver.2 試劑盒進(jìn)行 R0P38 基因的 RT-PCR 擴(kuò)增，使用方法參見說明書。其中，
[0046]上游引物:FR0P38:5' -CGGGGTACCATGAAAAATACTCTGTTGTCA-3'；
[0047]下游引物:RR0P38:5' -CGCGGATCCTCAAAATTGATGCGTTCTTAT-3'；
[0048]PCR 反應(yīng)條件為:94°C 預(yù)變性 5min，94°C變性 40sec，55°C 復(fù)性 30sec ;72°C 延伸lmin35sec ；35 個(gè)循環(huán)，最后，72°C延伸 IOmin0
[0049] 3.PCR純化產(chǎn)物的連接:將步驟2中的擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18連接，連接反應(yīng)使用TaKaRa公司pMD?18_T Vector，使用方法參見說明書，連接條件為16°C反應(yīng)2~4h或4°C連接過夜，連接產(chǎn)物標(biāo)記為PMD18-R0P38。
[0050]4.R0P38的序列測定:將經(jīng)菌液PCR和酶切鑒定均為陽性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司測序。測序結(jié)果參見序列表中SEQ ID N0.1中所示的核苷酸序列，其編碼的蛋白序列參見序列表中SEQ ID N0.2。
[0051]5.pVAX I質(zhì)粒的小量提取:用天根生化科技(北京)有限公司TIANprep MiniPlasmid Kit進(jìn)行pVAX I質(zhì)粒提取,使用方法參照說明書。
[0052]6.pVAX I載體(圖1所示)及目的片段R0P38的回收:用Kpn I和Xba I分別雙酶切pVAXI質(zhì)粒及pMD18-R0P38重組質(zhì)粒，并用天根生化科技(北京)有限公司普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收載體及目的片段，使用方法參照說明書。
[0053]7.pVAX I載體與目的片段R0P38的連接:將經(jīng)切膠回收純化得到的R0P38基因片段定向亞克隆至pVAX I載體中。16°C反應(yīng)4~6h或4°C連接過夜，產(chǎn)物標(biāo)記為pVAX-R0P38。其核苷酸序列參見序列表中SEQ ID N0.3，其中，橫線部分為R0P38基因片段。
[0054]8.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化與鑒定:將連接產(chǎn)物10 μ L轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α中，挑取若干單菌落作菌液PCR鑒定。產(chǎn)物標(biāo)記為pVAX-R0P38。pVAX_R0P38構(gòu)建路線見圖1。[0055]二、培養(yǎng)基和溶液的配制:
[0056]a、溶液的配制:
[0057](I) LB液體培養(yǎng)基
[0058]稱取LB粉末5.0g,加適量的去離子水溶解，并定容至200mL，121 V高壓滅菌20min，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0059](2) LB固體培養(yǎng)基
[0060]于LB液體培養(yǎng)基中加入2.0% (m/V)瓊脂粉，121°C高壓滅菌20min，待其冷卻到55°C~65 °C時(shí)傾注平板，待凝固后4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0061 ] (3) Kan+LB選擇液體培養(yǎng)基
[0062]待(I)中制備的LB液體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至50°C~55°C時(shí)，加入Kan (卡那霉素)(終濃度為1000IU/mL)，搖晃混勻后4°C保存。
[0063](4 ) Kan+LB固體選擇培養(yǎng)基
[0064]待(2)中制備的LB固體培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50°C~55°C時(shí)，加入Kan (終濃度為1000IU/mL)并輕輕搖動，混勻后迅速傾注平板，室溫凝固并于4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0065]b、質(zhì)粒大量提取時(shí)溶液的配制:
[0066](1)0.25mol/L Tris-Cl 溶液(ρΗ8.0)
[0067]稱取Tris-Cl粉末6.055g，并將其溶解到IOOmL ddH20中，調(diào)節(jié)pH值為8.0，定容到200mL，高壓滅菌后4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0068](2) 0.5mol/L EDTA 溶液(ρΗ8.0)
[0069]稱取Na2EDTA37.22g，溶于200mL ddH20中，振蕩混勻，調(diào)節(jié)pH值為8.0,高壓滅菌后4 C保存?zhèn)溆谩?br> [0070](3) TE 溶液(pH8.0)
[0071]先將(I)中制備的0.25mol/L Tris-Cl溶液和(2)中制備的0.5mol/L EDTA溶液(ρΗ8.0)稀釋，并分別吸取 10mmol/L Tris-Cl 1.0mL 與 lmmol/L EDTA0.2mL，加入無菌ddH20后定容到100mL，4°C保存?zhèn)溆?。[0072](4) 10%SDS 溶液(ρΗ7.2)
[0073]稱取SDS (十二烷基磺酸鈉)粉末10g，加入去離子水90mL后60°C水浴溶解，用濃HCl將其pH值調(diào)為7.2，并定容到IOOmL,現(xiàn)配現(xiàn)用，不宜長期保存。
[0074](5) 2moI/L NaOH 溶液
[0075]先于燒杯中加入去離子水160mL，稱取NaOH粉末16.0g并緩緩加入到去離子水中，邊加邊混勻，定容到200mL后于塑料瓶中4°C保存。
[0076](6) Solution I
[0077]取(I)中制備的0.25mol/L Tris-CllOmL，(2)中制備的 0.5mol/LEDTA2mL，加去離子水定容到lOOmL，高壓蒸汽滅菌后4°C保存。
[0078](7) Solution II
[0079]取2mol/L NaOHlOmL, 10%SDS10mL，加去離子水定容到IOOmL,現(xiàn)配現(xiàn)用，常溫保存，不宜長時(shí)間存放。
[0080](8) Solution III
[0081]稱取KAc粉末58.884g ，與冰乙酸23mL混合，加入適量去離子水溶解后定容到200mL，4°C 保存。
[0082](9) 3mol/L NaAc 溶液(ρΗ5.2)
[0083]稱取無水NaAc49.22g，加去離子水定容到200mL，高壓蒸汽滅菌后4°C保存。
[0084](10) 5mol/L LiCl 溶液
[0085]稱取無水LiC142.4g，加去離子水定容到200mL，高壓蒸汽滅菌后4°C保存。
[0086](11) 10mg/mL 溶菌酶
[0087]使用前，稱取IOmg的溶菌酶，加lOmmol/L的Tris-Cl (PH8.0)即刻溶解定容至ImL，-20°C保存。
[0088]三、大量制備質(zhì)粒
[0089]1.挑取步驟(一)和(二)中制備的已保存于_20°C的含有目的質(zhì)粒(pVAX I，
[0090]pVAX-R0P38)的陽性菌液于Kan+LB固體選擇培養(yǎng)基上劃線，37°C培養(yǎng)過夜。挑取板上的一個(gè)單菌落置于12mL Kan+LB液體選擇培養(yǎng)基中，搖床37°C，以180~220轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)12~16h。將上述培養(yǎng)菌液以體積比1:100的比例接種到裝有400mL Kan+LB液體選擇培養(yǎng)基的1000mL錐形瓶中，搖床37°C，在180~220轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)過夜。
[0091]2.將步驟I得到的細(xì)菌培養(yǎng)物置于冰中或4°C冰箱數(shù)分鐘，4°C，以9000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心5min，收集細(xì)菌培養(yǎng)物沉淀，棄上清(利用移液器小心吸出上清)，倒置離心管使上清盡量流出。用10mL4°C預(yù)冷的Solution I重懸菌體，旋渦振蕩，使細(xì)菌在Solution I中完全分散。(由于旋渦振蕩和Solution I的加入已足夠是菌液裂解分散，為了簡化操作，此處省去現(xiàn)有技術(shù)中進(jìn)一步裂解分散的步驟:加入ImL新配制的10mg/mL溶菌酶溶液(pH8.0),震蕩混勻)。
[0092]3.在步驟2得到的菌液中加入20mL新配制的Solution II，輕搖并上下顛倒混勻2~4次。再加入15mL4°C預(yù)冷的Solution III，立即輕搖混勻，以免產(chǎn)生局部沉淀。冰上或-20°C冰箱放置IOmin0加Solution II和Solution III的時(shí)間間隔控制在5min以內(nèi)，以免過分裂解。4°C或室溫，在11000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10min，利用4層紗布將上清過濾，轉(zhuǎn)移到兩個(gè)新50mL離心管中。[0093]4.將步驟3得到的上清與14_16mL異丙醇(現(xiàn)有技術(shù)中此處需加入0.6倍體積的異丙醇的方法，本 申請人:通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，異丙醇的加入量在0.6倍體積上下各Iml的范圍內(nèi)，是不影響產(chǎn)物的提取質(zhì)量和產(chǎn)量的)混勻，室溫放置lOmin。室溫下，在11000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10min，棄上清，將空管倒置于濾紙上數(shù)分鐘，除去殘余。加入3mL ddH20充分溶解，再加入3mL預(yù)冷的5mol/L LiCl溶液(此時(shí)需先加ddH20，后加LiCl，才能使沉淀充分溶解，顛倒步驟易造成沉淀溶解不充分或不溶解)，充分混勻，此處不可用吹打的方式混勻。吹打混勻易使提取的質(zhì)粒發(fā)生斷裂，兩只離心管合并為一管，冰中或_20°C冰箱放置lOmin。4°C或室溫，在11000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10min，將上清分別轉(zhuǎn)移到一新50mL離心管中，加入等體積(12mL)預(yù)冷的異丙醇，充分混勻，室溫放置lOmin。4°C或室溫，在11000轉(zhuǎn)/分鐘下離心lOmin，小心棄上清，倒置控干管內(nèi)液體，一般倒置10~15min即可。此時(shí)管壁會出現(xiàn)白色沉淀物即質(zhì)粒。
[0094]5.在步驟4制備的白色沉淀物中加入3mL ddH20或TE溶液(pH8.0)溶解沉淀，并加入30 μ L10mg/mL RNase A (Takara公司產(chǎn)品)，37°C水浴Ih除去RNA。加入2倍體積(8mL)無水乙醇和1/10體積(400 μ L)。用3mol/L NaAc溶液，充分混勻，冰中或_20°C冰箱放置20min。4°C，在11000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10min，小心將上清吸出(勿用傾倒的方式除去上清，易造成使吸附于管壁的沉淀分散，而非上清被倒出)，并將離心管倒置于濾紙上控干(主要控干殘余的試劑如:乙醇和NaAc，減少雜質(zhì)，提高質(zhì)粒的純度)。加入IOOyL ddH20或TE溶液(PH8.0)，充分洗脫質(zhì)粒沉淀。利用分光光度計(jì)測量所得質(zhì)粒的濃度并記錄，測出的濃度為10000mg/mL。因此，我們將以保存濃度為1000mg/mL (十倍稀釋)的量分裝于1.5mL離心管中，即每管保存有1000mg質(zhì)粒,體積為ImL,分裝封口后于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0095]四、質(zhì)粒DNA的純度檢測
[0096]以ddH20或TE (ρΗ8.0)為空白對照，用分光光度計(jì)測定波長260nm和280nm下的核酸溶液光密度(OD)值。雙鏈DNA純品的OD26tZOD28tl值為1.8，若樣品0D26(l/0D28(l值低于1.8，說明樣品可能被蛋白質(zhì)污染，需進(jìn)一步純化。
[0097]五、重組質(zhì)粒的免疫效果評價(jià)
[0098]1.KM鼠免疫與分組:為了降低應(yīng)激反應(yīng)，KM鼠買回后需飼養(yǎng)I周，然后將其隨機(jī)分為4個(gè)組，每組35只，具體分組見表1。
[0099]表1免疫實(shí)驗(yàn)分組情況
[0100]
【權(quán)利要求】
1.一種用于弓形蟲感染預(yù)防的核苷酸序列，其含有選自以下的核苷酸序列: 1)序列表中SEQID N0.1中所示的核苷酸序列； 2)與I)中所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列； 3)對上述I)或2)所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾，并具有弓形蟲感染預(yù)防功能的核苷酸 序列。
2.一種重組蛋白，其氨基酸序列由權(quán)利要求1所述的核苷酸序列編碼。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組蛋白，其特征在于:所述氨基酸序列參見序列表中SEQID N0.2。
4.一種重組載體，其包括權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
5.一種重組質(zhì)粒，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。
6.一種疫苗，其包括權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，以及醫(yī)學(xué)上可接受的載體。
7.權(quán)利要求1所述的核苷酸序列、權(quán)利要求2或3所述的重組蛋白、權(quán)利要求4所述的重組載體、權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒、權(quán)利要求6所述的疫苗在弓形蟲感染預(yù)防中的應(yīng)用。
8.—種權(quán)利要求6所述的疫苗的制備方法，步驟如下: (1)提取弓形蟲RH株總RNA;
(2)RT-PCR 擴(kuò)增 RH 株總 RNA ； (3)將步驟2中的擴(kuò)增產(chǎn)物與載體連接； (4)pVAXI質(zhì)粒的小量提取； (5)回收pVAXI載體及目的片段R0P38 ； (6)連接pVAXI載體與目的片段R0P38 ； (7)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至宿主菌中。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于:所述RT-PCR擴(kuò)增RH株總RNA時(shí)所用引物為: 上游引物:5' - CGGGGTACCATGAAAAATACTCTGTTGTCA -3'； 下游引物:5' - CGCGGATCCTCAAAATTGATGCGTTCTTAT -3'。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于:所述RT-PCR擴(kuò)增RH株總RNA時(shí)PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 40sec，55°C復(fù)性 30sec ;72°C延伸 lmin 35sec ；35個(gè)循環(huán)，最后，72°C延伸IOmin。
【文檔編號】A61K39/002GK103937818SQ201410135529
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月4日
【發(fā)明者】黃思揚(yáng), 徐穎, 張念章, 徐前明, 徐民俊, 宋慧群, 朱興全 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所