一種用于腦膠質(zhì)瘤的微量釓摻雜氧化錳納米粒的制作方法
【專利摘要】一種微量釓摻雜氧化錳納米粒，以釓摻雜的氧化錳納米粒為晶體內(nèi)核，晶體內(nèi)核的表面結(jié)合有硅烷化試劑；釓與錳的摩爾比為0.01-0.1。本發(fā)明還公開了制備微量釓摻雜氧化錳納米粒的方法。本發(fā)明的微量釓摻雜氧化錳納米?？梢栽诖殴舱癯上裰凶鳛閷?duì)比劑，以及應(yīng)用在藥物載體、細(xì)胞示蹤藥物和基因轉(zhuǎn)染中。
【專利說明】一種用于腦膠質(zhì)瘤的微量釓摻雜氧化錳納米粒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微量釓摻雜的氧化錳納米粒，更具體地涉及一種用于腦膠質(zhì)瘤的微量釓摻雜氧化錳納米粒。
[0002]本發(fā)明還涉及上述微量釓摻雜的氧化錳納米粒的制備方法。
[0003]本發(fā)明還涉及微量釓摻雜氧化錳納米粒在磁共振成像(MRI)中作為對(duì)比劑，以及在藥物載體、細(xì)胞示蹤藥物和基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0004]磁共振成像(MRI)中造影劑的使用能增強(qiáng)病理組織與正常組織的對(duì)比度。目前臨床使用的釓螯合物作為T1對(duì)比劑僅限用于沒有血腦屏障的腦瘤造影，而且存在著潛在的腎源性系統(tǒng)纖維化(NSF)的問題。功能化的超順磁氧化鐵納米粒(SPION)雖然能穿越血腦屏障，且具有良好的生物相容性。但由于SPION是T2造影劑，在腫瘤區(qū)域形成的是變暗圖像，肉眼觀察不敏感，且易出現(xiàn)磁敏感偽影，也難用于膠質(zhì)瘤的早期診斷，至今無(wú)法用于腦瘤的早期和小病灶診斷。2007年，Hyeon首次報(bào)道了氧化錳(MnO)納米?？捎糜谀X瘤的對(duì)比增強(qiáng)劑，獲得了明顯的對(duì)比增強(qiáng)效果。但弛豫率僅為0.1SmT1iT1,而且大多數(shù)文獻(xiàn)用熱分解法制備的氧化錳納米粒弛豫率也大都低于ZmT1s-1,明顯低于釓螯合物的弛豫率。那就意味著要獲得清晰的造影圖像需要注射更多劑量的對(duì)比劑。錳雖是體內(nèi)所需的微量元素，但過量錳也會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的毒性。故增加錳基造影劑的弛豫率，降低其劑量就成為迫切要解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種微量釓摻雜氧化錳納米粒。
[0006]本發(fā)明的又一目的在于提供制備上述微量釓摻雜氧化錳納米粒的方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的微量釓摻雜氧化錳納米粒，以釓摻雜的氧化錳納米粒為晶體內(nèi)核，晶體內(nèi)核的表面結(jié)合有硅烷化試劑；釓與錳的摩爾比為0.01-0.1。
[0008]所述的微量釓摻雜氧化錳納米粒中，摻雜的釓源為釓的無(wú)機(jī)金屬鹽；硅烷化試劑為具有-NH2、-SH、-COOH或-PEG官能團(tuán)的硅烷化試劑。
[0009]所述的微量釓摻雜氧化錳納米粒中，釓的無(wú)機(jī)金屬鹽為硝酸釓、氯化釓、硫酸釓或/和磷酸釓；硅烷化試劑為羧酸硅烷、巰基硅烷、氨基硅烷或/和PEG硅烷。
[0010]所述的微量釓摻雜氧化錳納米粒中，晶體內(nèi)核的直徑為10納米至100納米。
[0011]所述的微量釓摻雜氧化錳晶體內(nèi)核中，晶體內(nèi)核為規(guī)則或不規(guī)則的球形、菱形、六方體形、方形、啞鈴型以及橢圓形的顆粒狀。
[0012]本發(fā)明提供的制備上述微量釓摻雜氧化錳納米粒的方法:
[0013]I)將釓鹽與油酸鈉在水-乙醇-正己烷混合體系中于50_80°C反應(yīng)，得到油酸釓；
[0014]2)將錳鹽與油酸鈉在水-乙醇-正己烷混合體系中于50_80°C反應(yīng)，得到油酸錳；
[0015]3)將油酸釓和油酸錳溶于1-十八烯，于280-310°C熱分解反應(yīng)后用乙醇沉淀洗滌，得到油酸包裹的微量釓摻雜氧化錳納米粒；
[0016]4)將油酸包裹的微量釓摻雜氧化錳納米粒溶于無(wú)水甲苯中，加入硅烷化試劑，在50-90°C反應(yīng)，得到硅烷化的微量釓摻雜氧化錳納米粒，透析純化后冷凍干燥。
[0017]所述方法中，透析用的透析袋分子量3500Da。
[0018]本發(fā)明提供的微量釓摻雜氧化錳納米?？梢栽诖殴舱癯上裰凶鳛閷?duì)比劑，以及應(yīng)用在藥物載體、細(xì)胞示蹤藥物和基因轉(zhuǎn)染中。
[0019]本發(fā)明用高溫?zé)岱纸夥ㄖ苽淞擞退岚驳奈⒘酷彄诫s的氧化錳納米粒，再用硅烷羧酸配體交換油酸，得到了高度水分散的釓摻雜氧化錳納米粒，其弛豫率值為6.0843!!^1^,高于文獻(xiàn)報(bào)道值。并且，本發(fā)明的微量釓參雜氧化錳納米粒作為對(duì)比劑對(duì)腦膠質(zhì)瘤MRI成像顯示出明顯的對(duì)比增強(qiáng)效果，并能提供清晰的腫瘤邊界和延長(zhǎng)的成像時(shí)間。[0020]本發(fā)明將硅烷試劑修飾微量釓摻雜氧化錳納米粒，制備水分散，高弛豫性能微量釓摻雜氧化錳納米粒作為MRI T1成像對(duì)比劑。該納米粒表面由于覆蓋官能化的硅烷，可用于連接熒光分子或螯合劑，因此作為進(jìn)一步開發(fā)多模態(tài)對(duì)比劑的平臺(tái)，也可用于負(fù)載藥物或基因而具有成為藥物和基因轉(zhuǎn)染載體的潛力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是本發(fā)明微量釓摻雜氧化錳納米粒[GdxMn(1_x)O-TETT (x=0.01)]透射電子顯微鏡(TEM)圖。
[0022]圖2是本發(fā)明微量釓摻雜氧化錳納米粒[GdxMn(1_x)O-TETT (x=0.01)]粒徑分布(DLS)圖。
[0023]圖3是本發(fā)明微量釓摻雜氧化錳納米粒[GdxMn(1_x)O-TETT (x=0.01)]傅里葉轉(zhuǎn)換紅外(FTIR)圖。
[0024]圖4是本發(fā)明微量釓摻雜氧化錳納米粒[GdxMn(1_x)O-TETT (x=0.01)]的弛豫率值。
[0025]圖中的橫坐標(biāo)是GdxMn(1_x)O-TETT (x=0.01)的濃度，縱坐標(biāo)為橫向弛豫時(shí)間(!\)的倒數(shù)，線性擬合后的斜率則為弛豫率0-ι)。
[0026]圖5是裸鼠尾靜脈注射前及注射GdxMn(1_x)O-TETT (x=0.01) 30分鐘、60分鐘、120分鐘及24小時(shí)后腦部的T1加權(quán)成像掃描圖。
[0027]圖6是正常小鼠與尾靜脈注射GdxMn(1_x)O-TETT (x=0.01)30天后小鼠的腦、肝、脾、肺、腎組織切片HE染色結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0028]本發(fā)明的微量釓摻雜氧化錳納米粒，主要由微量釓摻雜的氧化錳晶體內(nèi)核和表面硅烷化試劑組成；
[0029]其中微量釓摻雜的氧化錳晶體的釓源為釓金屬鹽類；
[0030]對(duì)核外表面的修飾劑包括具有-NH2、-SH、-C00H、-PEG硅烷化試劑。
[0031]所述微量釓摻雜的氧化錳納米粒，其中釓金屬鹽類包括但不限于硝酸釓、氯化釓、硫酸釓和磷酸釓。
[0032]所述微量釓摻雜的氧化錳納米粒，其中硅烷化試劑包括但不限于羧酸硅烷，巰基硅烷，氨基硅烷和PEG硅烷。
[0033]所述微量釓摻雜的氧化錳納米粒，其中微量釓摻雜的氧化錳晶體內(nèi)核GdxMn(1_x)0的釓摻雜量(X)為0.01-0.1。
[0034]所述微量釓摻雜的氧化錳晶體內(nèi)核，其中微量釓摻雜的氧化錳晶體內(nèi)核的直徑為10納米至100納米。
[0035]所述微量釓摻雜的氧化錳晶體內(nèi)核，其中微量釓摻雜的氧化錳晶體內(nèi)核為規(guī)則或不規(guī)則的球形、菱形、六方體形、方形、啞鈴型以及橢圓形的顆粒狀。
[0036]所述的微量釓摻雜的氧化錳納米粒的方法，其主要步驟為:
[0037]1)將釓鹽與油酸鈉在水-乙醇-正己烷混合體系中加熱反應(yīng)3-5小時(shí)，得到油酸釓。[0038]2)將錳鹽與油酸鈉在水-乙醇-正己烷混合體系中加熱反應(yīng)3-5小時(shí)，得到油酸釓。
[0039]3)將油酸釓和油酸錳溶于1-十八烯，高溫?zé)岱纸夂笥靡掖汲恋?，洗滌，得到油?OA)包裹的 GdxMn (1_x) O-OA。
[0040]4)將GdxMn(1_x)0-0A溶于無(wú)水甲苯中，加入硅烷化試劑，在50-90°C下反應(yīng)24_72小時(shí)，得到硅烷化的GdxMn(1_x)0納米粒，透析，冷凍干燥。
[0041]本發(fā)明提供了微量禮摻雜氧化猛納米粒,將其用GdxMn(1_x)0-silane (x=0.01-0.1)表示，silane代表官能化硅烷試劑。
[0042]微量釓摻雜氧化錳納米粒，由于在GdxMn(1_x)0納米粒外面修飾了官能化的硅烷試劑，這類納米粒在水溶液中具有好的分散性、穩(wěn)定性和生物相容性。表面的硅烷官能團(tuán)可用于共價(jià)或物理結(jié)合藥物、DNA等，因此可用作藥物和基因載體。同時(shí)而且由于其具有良好的弛豫性能，能夠?qū)崿F(xiàn)體內(nèi)外組織或細(xì)胞的標(biāo)記和MRI。
[0043]本發(fā)明制備微量釓摻雜氧化錳納米粒的方法中:
[0044]采用高溫分解法制備油酸包裹的微量釓摻雜的氧化錳納米粒:將油酸錳和油酸釓溶于1-十八烯中，在280-310°C攪拌10-60分鐘，經(jīng)純化制得油酸包裹的微量釓摻雜的氧化猛納米粒。
[0045]采用配體交換法制備的硅烷修飾的微量釓摻雜的氧化錳納米粒GdxMn (1_x)O-TETT(x=0.01-0.1):將油酸包裹的微量釓摻雜的氧化錳納米粒溶于無(wú)水甲苯中，加入醋酸，超聲后加入硅烷試劑，在60-90°C下攪拌反應(yīng)24-72小時(shí)，得到硅烷修飾的納米粒。
[0046]本發(fā)明提供的微量禮摻雜的氧化猛納米粒GdxMn(1_x)0-silane (x=0.01-0.1),由于微量釓的摻雜，使得其弛豫率明顯高于氧化錳納米粒。同時(shí)，由于在納米粒表面共價(jià)結(jié)合了官能化硅烷試劑，有效的提高了 GdxMn(1_x)0在水中的分散性及穩(wěn)定性。
[0047]本發(fā)明提供的GdxMn(1_x)0-silane (x=0.01-0.1)納米粒,尾靜脈注射后，能明顯增強(qiáng)腫瘤區(qū)域的對(duì)比，清楚的顯示腫瘤邊緣，并延長(zhǎng)了成像時(shí)間，有潛力成為一種新型的T1造影劑。
[0048]以下舉例說明本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。
[0049]實(shí)施例1:GdxMn(1_x)O-OA 的制備
[0050]I)油酸禮的制備:將20mmol GdCl3, 60mmol油酸鈉，30mL蒸懼水，40mL乙醇，70mL正己烷加入到三口瓶中，其中GdCl3與油酸鈉的摩爾比為1:3，在701:反應(yīng)4小時(shí)。冷卻至室溫，靜置分液，有機(jī)層用蒸餾水洗三次。干燥，即可得到油酸釓。
[0051]2)油酸猛的制備:將20mmol MnCl2, 40mmol油酸鈉，30mL蒸懼水，40mL乙醇，70mL正己烷同時(shí)加入到三口瓶中，其中MnCl2與油酸鈉的摩爾比為1:2。在70°C下反應(yīng)4小時(shí)。冷卻至室溫，靜置分液，有機(jī)相用蒸餾水洗三次。干燥，得油酸錳。
[0052]3)GdxMn(1_x)O-OA的制備:將2.4mmol油酸禮和9.6mmol油酸猛溶于150mLl_十八烯中，在氮?dú)夥諊蜋C(jī)械攪拌下升溫至100°c，抽真空15分鐘，充氮?dú)?，繼續(xù)升溫至200°C，并維持20分鐘，再升溫至280°C，保持10分鐘，升溫至300-310°C回流反應(yīng)10分鐘。然后冷卻至室溫，加入40mL無(wú)水乙醇，離心，所得沉淀分別用無(wú)水乙醇和丙酮各洗三次，得到油酸(OA)包裹的GdxMn(1_x)0納米粒(GdxMn(1_x)0-0A)，分散在正己烷中保存?zhèn)溆谩?br> [0053]實(shí)施例2:GdxMn(1_x)0 - TETT (x=0.01)的制備[0054]采用配體交換法制備水分散的微量釓摻雜氧化錳納米粒GdxMn (1_x)O - TETT (x=0.01):將 IOOmg GdxMn(1_x)0-0A 溶于 60mL 無(wú)水甲苯中，加入 60 μ L 醋酸，超聲 15分鐘，加入0.6mL硅烷羧酸(TETT)，70°C下反應(yīng)48小時(shí)。所得GdxMn(1_x)0_TETT(x=0.01)用甲苯和無(wú)水甲醇各洗3次，透析24小時(shí)，冷凍干燥。
[0055]本發(fā)明產(chǎn)品GdxMn(1_x)O-TETT(x=0.01)的透射電鏡，粒徑分布及傅里葉紅外的表征見圖1、2、3。
[0056]實(shí)施例3:GdxMn(1_x)O-TETT (x=0.01)弛豫率的測(cè)定
[0057]稱取一定量GdxMn(1_x)O-TETT (x=0.01)，分散于1%的瓊脂糖凝膠，分別配制成濃度為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125毫摩爾(Mn)/升的溶液。使用7T核磁共振儀，選定 RARE-TJT2Iiap 序列，各項(xiàng)參數(shù)設(shè)置如下:TR/TE=3000/45ms (T2)，TR/TE=500/9ms (T1)，F(xiàn)0V=4.0X4.0cm2及slice thickness=lmm,對(duì)所配溶液進(jìn)行T1加權(quán)成像掃描,將所得橫向弛豫時(shí)間(T1)的倒數(shù)與濃度進(jìn)行線性擬合，所得斜率即為弛豫率。其擬合曲線見圖4。
[0058]實(shí)施例4
[0059]DMRI實(shí)驗(yàn):選取腦膠質(zhì)瘤模型BALB/C裸鼠，以6%水合氯醛0.lml/20g，腹腔注射麻醉。使用7T核磁共振儀，各項(xiàng)參數(shù)設(shè)置如下:TR/TE=1000/8ms，matrix size=256X 256，field of view=2.5X2.5cm2, slice thickness=0.8mm 對(duì)小鼠腦部進(jìn)行 T1 加權(quán)成像掃描。將GdxMn(1_x)O-TETT (x=0.01)納米粒通過尾靜脈以10mg/kg的劑量注入小鼠內(nèi)，分別在注射30分鐘、60分鐘、120分鐘及24小時(shí)后，以同樣序列對(duì)小鼠進(jìn)行MRI掃描。所得T1加權(quán)圖像見圖5。從圖5中可以看出，GdxMn(1_x)O-TETT(x=0.01)對(duì)腦膠質(zhì)瘤具有明顯的MRI對(duì)比增強(qiáng)效果。
[0060]2)取臟器組織及后固定:選取ICR小鼠(20g)，將GdxMn(1_x)0-TETT(X=0.01)納米粒通過尾靜脈以24mg/kg的劑量注入小鼠內(nèi)，30天后以6%水合氯醛0.lmL/20g，腹腔注射麻醉，仰臥固定，沿胸廓下沿打開胸腔，將灌注針由左心室插入總動(dòng)脈，固定灌注針，在心尖處用眼科剪剪一小開口，打開灌注泵，以30mL/分鐘灌注生理鹽水，同時(shí)按摩肝臟，待肝臟發(fā)白后，以5mL/分鐘的速度灌注多聚甲醛溶液直至各組織發(fā)硬為止(約30分鐘)，取出肝臟、脾、肺、腎內(nèi)臟置于多聚甲醛中過夜，棄去多聚甲醛，換30%的蔗糖溶液后固定至組織沉于瓶底。
[0061]3)組織切片:將組織從蔗糖溶液中取出，蒸餾水洗凈，用石蠟包埋組織，冷卻后進(jìn)行切片，切片厚度為5 μ m，展于載玻片上，脫蠟后進(jìn)行染色。[0062]4)切片組織的HE染色:將組織切片入蒸餾水后，放入Harris蘇木精染液中染色15分鐘，自來水沖洗20分鐘返藍(lán),后置于鹽酸酒精分色液中10秒進(jìn)行分色，自來水沖洗5分鐘后入蒸餾水，然后置于1%伊紅染色10秒，自來水沖去浮色，依次入70%、95%、100%酒精上行脫水I分鐘后置入二甲苯中透明2分鐘，以中性樹膠封片。
[0063]5)分析:于倒置顯微鏡下觀察各臟器組織切片，見圖6。從圖6中可以看出，GdxMn(1_x)O-TETT(x=0.01)不具有明顯的組織毒性，表明其生物相容性良好。
【權(quán)利要求】
1.一種微量釓摻雜氧化錳納米粒，以釓摻雜的氧化錳納米粒為晶體內(nèi)核，晶體內(nèi)核的表面結(jié)合有硅烷化試劑；釓與錳的摩爾比為0.01-0.1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量釓摻雜氧化錳納米粒，其中，摻雜的釓源為釓的無(wú)機(jī)金屬鹽；硅烷化試劑為具有-NH2、-SH、-COOH或-PEG官能團(tuán)的硅烷化試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微量釓摻雜氧化錳納米粒，其中，釓的無(wú)機(jī)金屬鹽為硝酸釓、氯化釓、硫酸釓或/和磷酸釓；硅烷化試劑為羧酸硅烷、巰基硅烷、氨基硅烷或/和PEG硅燒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量釓摻雜氧化錳納米粒，其中，晶體內(nèi)核的直徑為10納米至100納米。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的微量釓摻雜氧化錳晶體內(nèi)核，其中，晶體內(nèi)核為規(guī)則或不規(guī)則的球形、菱形、六方體形、方形、啞鈴型以及橢圓形的顆粒狀。
6.一種制備權(quán)利要求1所述的微量釓摻雜氧化錳納米粒的方法: 1)將釓鹽與油酸鈉在水-乙醇-正己烷混合體系中于50-80°C反應(yīng)，得到油酸釓； 2)將錳鹽與油酸鈉在水-乙醇-正己烷混合體系中于50-80°C反應(yīng)，得到油酸錳； 3)將油酸釓和油酸錳溶于1-十八烯，于280-310°C熱分解反應(yīng)后用乙醇沉淀洗滌，得到油酸包裹的微量釓摻雜氧化錳納米粒； 4)將油酸包裹的微量釓摻雜氧化錳納米粒溶于無(wú)水甲苯中，加入硅烷化試劑，在50-90°C反應(yīng)，得到硅烷化的微量釓摻雜氧化錳納米粒，透析純化后冷凍干燥。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其中，透析用的透析袋分子量3500Da。
8.權(quán)利要求1所述的微量釓摻雜氧化錳納米粒在磁共振成像中作為對(duì)比劑的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的微量釓摻雜氧化錳納米粒在藥物載體、細(xì)胞示蹤藥物和基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K49/18GK103830751SQ201410122491
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】葉玲, 邵晨, 李帥, 顧微, 宮寧強(qiáng), 鄧云龍, 肖寧 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)