在胃腸系統(tǒng)中具有鎮(zhèn)痛特性的嗜酸乳桿菌菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及嗜酸乳桿菌的至少一株菌株在制備制劑中的用途，該制劑以在胃腸系統(tǒng)的鎮(zhèn)痛目的給藥予人類或動物。
【專利說明】在胃腸系統(tǒng)中具有鎮(zhèn)痛特性的嗜酸乳桿菌菌株
[0001]本申請是申請日為2005年9月21日、申請?zhí)枮?00580031540.5、發(fā)明名稱為“在
胃腸系統(tǒng)中具有鎮(zhèn)痛特性的嗜酸乳桿菌菌株”的發(fā)明專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發(fā)明的主題是嗜酸乳桿菌的至少一株菌株在制備制劑中的用途，該制劑以在胃腸系統(tǒng)的鎮(zhèn)痛目的給藥予人類或動物。
【背景技術】
[0003]在微生物特別是細菌當中，有一些對免疫系統(tǒng)具有積極影響，特別是乳桿菌和雙歧桿菌，它們被稱為“益生”細菌或菌株。 [0004]通常，益生菌或菌株是指一種非病原微生物，其被活的攝取，對宿主的健康或生理具有有利作用。這些益生菌株通常能夠活著通過消化道上部。它們是非致病非毒性的，一方面通過與消化道中的常居菌群的生態(tài)相互作用，另一方面通過它們以積極途徑由“GALT”(消化道相關的淋巴組織)影響免疫系統(tǒng)的能力，而發(fā)揮它們對健康的有利作用。取決于益生菌的定義，當數(shù)量足夠時，這些細菌能夠活著通過腸，然而它們不能穿越腸屏障，因此它們主要影響于胃腸道腔和/或壁中。然后在給藥期間，它們成為常居菌群的一部分。這種集群現(xiàn)象(或暫時集群現(xiàn)象)允許益生菌發(fā)揮有利作用，例如對存在于菌群中的潛在的病原性微生物的抑制，以及與腸免疫系統(tǒng)的相互影響。
[0005]大多數(shù)所使用的益生菌，特別是乳制品中所使用的益生菌，主要是以下屬的細菌和酵母:乳酸菌spp.,鏈球菌屬spp.,腸球菌spp.,雙歧桿菌屬.，和釀酒酵母spp.。上述這些細菌的益生作用中，可提到的例如改善乳糖耐受性、預防或治療胃腸和泌尿生殖器感染、減少腫瘤、降低血膽固醇水平。然而，必須強調，如果就單獨的一株菌株來說，并不是如上所述的所有屬的菌株都具有這些作用，僅僅只是它們中的一些具有這些作用，這些菌株必須慎重選擇。
[0006]為滿足工業(yè)化的需要，必需發(fā)現(xiàn)有效的菌株或菌株混合物，并可以提供一種減少在胃腸水平中體驗的疼痛的方案，這種胃腸疼痛通常表現(xiàn)為腸不適，特別是過敏性腸綜合征(IBS)，或胃腸水平的由炎癥所引起的疼痛，特別是在結腸炎或腹瀉過程中。

【發(fā)明內容】

[0007]因此，本發(fā)明要解決的問題是提供一種具有鎮(zhèn)痛特性的益生菌。
[0008]為此目的，本發(fā)明提供嗜酸乳桿菌的至少一株菌株在制備制劑中的用途，該制劑以在胃腸系統(tǒng)的鎮(zhèn)痛目的給藥予人類或動物。
[0009]本發(fā)明還提供一種選擇一種微生物來制備制劑的方法，該制劑以在胃腸系統(tǒng)的鎮(zhèn)痛目的給藥予人類或動物，該方法包含以下步驟:
[0010]i)使要試驗的微生物與至少一個上皮細胞接觸；
[0011]ii)檢測至少一個上皮細胞中阿片樣物質受體和/或大麻素受體的表達；[0012]本發(fā)明的優(yōu)勢在于提供確實的、將擴大有用菌株范圍的優(yōu)點。
[0013]本發(fā)明的另一個優(yōu)勢在于本發(fā)明的益生菌能用于胃腸系統(tǒng)的治療或預防目的。
[0014]當本發(fā)明的益生菌以胃腸系統(tǒng)的治療或預防目的給藥予人類或動物，特別是減少在過敏性腸綜合征中體驗的疼痛或減少在由炎癥反應所引起的疼痛，或調節(jié)腸炎時，本發(fā)明是特別有利的。
[0015]由于本發(fā)明的益生菌可以通過調整分泌和消化motricity而調節(jié)腸運輸，因此當它以治療或預防目的給藥予人類或動物時，本發(fā)明也是有利的。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)勢還在于，當該益生菌引入藥學可接受制劑或引入食品時，它可保留所有其特性。
[0017]通過閱讀以下說明和實施例，將更清楚地了解本發(fā)明的其他優(yōu)勢和特征，實施例僅僅是說明性而非限制性的。
[0018]本發(fā)明的主題是嗜酸乳桿菌的至少一株菌株在制備制劑中的用途，該制劑以在胃腸系統(tǒng)的鎮(zhèn) 痛目的給藥予人類或動物。
[0019]根據(jù)本發(fā)明，所使用的嗜酸乳桿菌是一種革蘭氏陽性菌株。有利地，它是過氧化氫酶陰性的菌株，以同型發(fā)酵的代謝作用引起乳酸的產生。
[0020]根據(jù)本發(fā)明，所使用的嗜酸乳桿菌還可以產生細菌素，例如lactacin，活性對抗其他微生物。
[0021]優(yōu)選地，它是一種能夠在酸性pH環(huán)境下很好地耐胃蛋白酶、耐胰酶和耐膽汁鹽的嗜酸乳桿菌。
[0022]優(yōu)選地，使用被稱為“疏水”的嗜酸乳桿菌，即，一種對極性的或非極性的疏水有機溶劑具有強烈的親合性的嗜酸乳桿菌。疏水的有機溶劑例如為η-癸烷、氯仿、十六烷或二甲苯。
[0023]根據(jù)本發(fā)明，嗜酸乳桿菌菌株優(yōu)選嗜酸乳桿菌ΡΤΑ-4797和嗜酸乳桿菌NCFM。根據(jù)布達佩斯條約，嗜酸乳桿菌的嗜酸乳桿菌ΡΤΑ-4797菌株已由法國Rhodia Chimie, 26, quaiAlphonse Le GaI1l92512B0UL0GNE_BILLANC0URT Cedex在美國典型菌種保藏中心(ATCC)注冊，其中它的注冊號為PTA-4797。該菌株在W02004052462中公開。
[0024]在根據(jù)本發(fā)明的用途的范圍內，胃腸系統(tǒng)中的鎮(zhèn)痛有利地通過阿片樣物質受體和/或大麻素受體來調節(jié)。
[0025]所述的阿片樣物質受體總共有三種:δ、K和μ。它們屬于G蛋白偶聯(lián)受體總科，其由七個跨膜螺旋組成。該受體的胞內部分與G蛋白接觸，該G蛋白與受體相關，并可隨著所使用的拮抗劑的種類而改變，蛋白質的主要順序為Ga i3 > Ga ?2 > Ga il。
[0026]該阿片樣物質受體，特別是μ受體，具有若干功能。主要的一個功能是鎮(zhèn)痛作用，該作用通過利用β -內啡呔-或嗎啡-型拮抗劑與該受體特定結合，通過血腦屏障而得到證實。該受體在消化道中的第二個功能是通過抑制分泌和消化motricity減少腸運輸。最后，該阿片樣物質受體還涉及調節(jié)腸炎。
[0027]該阿片樣物質μ受體存在于中樞和外周神經系統(tǒng)中。已在大部分人體的重要器官中檢測到它的存在:脾臟、肝臟、腎臟、小腸和結腸，特別是在粘膜下和腸系膜叢神經元中的腸神經系統(tǒng)中，以及，在體外的淋巴細胞、單核細胞/巨噬細胞和上皮細胞中。
[0028]大麻素受體，稱為CBl和CB2，屬于G蛋白偶聯(lián)受體總科，其由七個跨膜螺旋組成。CBl主要通過中樞和外周神經系統(tǒng)表達，CB2主要通過免疫反應細胞表達。在人類，這些大麻素受體具有兩種內原性配位體，其通常由腸上皮細胞生成。
[0029]由腸神經系統(tǒng)表達的大麻素受體CBl減緩胃和小腸的蠕動并抑制胃液分泌。推測大麻素受體具有其他的抗-diarrhoetic和抗癌功能。
[0030]在根據(jù)本發(fā)明的用途的范圍內，胃腸系統(tǒng)中的鎮(zhèn)痛優(yōu)選通過阿片樣物質μ受體和/或CBl受體和/或CB2受體調節(jié)。
[0031]本發(fā)明中所使用的制劑優(yōu)選藥學可接受的制劑或食品。
[0032]藥學可接受的制劑尤其是指一種壓制片、片劑、膠囊劑、軟膏、栓劑或可飲用溶液形式的制劑。 [0033]優(yōu)選地，本發(fā)明所用的制劑是食品，例如食品增補劑、酒或基于奶的粉末。它優(yōu)選是動物或植物來源的乳制品。
[0034]乳制品是指含有動物和/或植物來源的奶的介質?？商峒暗膭游飦碓吹哪虨榕Ｄ?、綿羊奶、山羊奶或水牛奶。可提及的植物來源的奶為任何可根據(jù)本發(fā)明使用的植物來源的發(fā)酵性物質，特別是源自大豆、大米或谷類。
[0035]根據(jù)本發(fā)明，所使用的更優(yōu)選的制劑是發(fā)酵奶或母乳化牛奶。
[0036]用于制備本發(fā)明制劑的嗜酸乳桿菌菌株可以為細菌懸液、冷凍前后形式，濃縮形式，或者為干燥的、凍干的或凍結形式。無論使用哪種形式，菌株可以冷凍。
[0037]用于制備本發(fā)明制劑的嗜酸乳桿菌菌株可以包含不同的添加劑，所述添加劑在菌株的干燥或凍干過程中添加。
[0038]本發(fā)明所使用的嗜酸乳桿菌菌株可包含從IO6到IO12CFU的細菌/克載體，更優(yōu)選從IO8到IO12CFU的細菌/克載體。CFU代表“菌落形成單位”。克載體優(yōu)選指食品或藥學可接受的載體，對于凍干形式，優(yōu)選IO9到1012CFU/g。
[0039]用于制備本發(fā)明制劑的嗜酸乳桿菌菌株可以是與乳桿菌的混合物形式。根據(jù)本發(fā)明，所述乳桿菌是適宜的，包括通常用于農食品或制藥工業(yè)的所有乳桿菌。
[0040]用于引導，最常使用于和存在于發(fā)酵劑中的所述乳桿菌是那些屬于乳球菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬、白聯(lián)珠菌屬、小球菌屬、雙歧桿菌屬、短頸細菌屬、肉食桿菌屬、腸球菌屬、微球菌屬、漫游球菌屬、葡萄球菌屬、桿菌屬、克氏庫克菌屬、節(jié)核細菌屬、Proprionibacterium和棒桿菌屬。這些乳桿菌單獨使用或混合使用。該列表是非窮舉的。
[0041]本發(fā)明的主題還涉及一種選擇一種微生物來制備制劑的方法，該制劑以在胃腸系統(tǒng)的鎮(zhèn)痛目的給藥予人類或動物，該方法包含以下步驟:
[0042]i)使要試驗的微生物與至少一個上皮細胞接觸；
[0043]ii)檢測至少一個上皮細胞中阿片樣物質受體和/或大麻素受體的表達；
[0044]步驟i)或ii)中使用的上皮細胞優(yōu)選選自細胞株ATCC HTB-38，其通常稱為HT-29株，或選自細胞株Caco-2。這些是結腸癌細胞系。上皮細胞還可以是從人類活組織切片中分離和純化出來的細胞。
[0045]步驟i)優(yōu)選在使用從IO8到IO12CFU的要試驗的微生物和至少一個上皮細胞下進行。
[0046]步驟i)過程中的接觸時間可以從O小時到24小時，優(yōu)選3小時。
[0047]通常，根據(jù)步驟i)，在本領域技術人員所熟知的標準溫度、氣調和無菌環(huán)境之下進行與細胞的接觸，特別是在體外上皮細胞培養(yǎng)環(huán)境下。
[0048]根據(jù)本發(fā)明選擇的方法，步驟ii)優(yōu)選在檢測阿片樣物質μ受體(MOR)和/或CBl受體和/或CB2受體的表達下進行。通常，僅可檢測一種受體的表達:僅M0R、R CBl受體僅或CB2受體?；蛘?，可檢測兩種受體的表達:M0R和CBl受體；M0R和CB2受體；CB1受體和CB2受體。或者，可檢測三種受體的表達:M0R、CBl受體和CB2受體。
[0049]根據(jù)本發(fā)明選擇的方法，步驟ii)優(yōu)選檢測阿片樣物質受體和/或大麻素受體的信使RNA的表達以及任選其水平，例如由PCR，尤其由定量PCR或由免疫組織化學進行檢測。也可使用本領域技術人員熟知的其他信使RNA的檢測和它的測量技術。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0050]圖1表示阿片樣物質μ受體的信使RNA作為時間函數(shù)的表達動力學，在由4種不同微生物刺激過程中 ，在ATCC ΗΤΒ-38上皮細胞中進行表達。
[0051]圖2表示CBl受體的信使RNA作為時間函數(shù)的表達動力學，在由3種不同微生物刺激過程中，在ATCC ΗΤΒ-38上皮細胞中進行表達。
[0052]圖3表示CB2受體的信使RNA作為時間函數(shù)的表達動力學，在由3種不同微生物刺激過程中，在ATCC ΗΤΒ-38上皮細胞中進行表達。
[0053]圖4表示在不同環(huán)境下MOR的信使RNA的表達。
[0054]圖5表示結腸TNF的alpha信使RNA在未經處理的老鼠和經L.acidophilus處理過的老鼠中的表達。
[0055]圖6表示結腸KC的信使RNA在未經處理的老鼠和經L.acidophilus處理過的老鼠中的表達。
[0056]圖7表示結腸IL-1 β的信使RNA在未經處理的老鼠和經L.acidophilus處理過的老鼠中的表達。
[0057]圖8、10、12表示免疫染色的上皮細胞。圖9、11、13表示免疫染色的上皮細胞的百分比。
【具體實施方式】
[0058]以下實施例是為解釋本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。
[0059]實施例1
[0060]1.上皮細胞的制備
[0061]在含有5% CO2的氣氛、37°C下，分別用20和10%胎兒小牛血清，在DMEM介質中培養(yǎng)結腸癌細胞株HT-29(ATCC HTB-38)。ATCC HTB-38細胞株與要試驗的不同菌株接觸I ;3 ;4 ;8 ;18或24小時?；厥誂TCC HTB-38上皮細胞并浸于液氮中，以量化阿片樣物質μ受體和/或大麻素受:體的彳目使RNA和蛋白質。
[0062]2.阿片樣物質μ受體和/或大麻素受體的信息RNA的檢測和量化:
[0063]實時PCR
[0064]培養(yǎng)基中的上皮細胞株的全部RNA通過使用柱萃取元件(Macherey-Nagel)分離出來。簡言之，將細胞碾碎在含I % β-硫氫基-乙醇的溶解緩沖液中，然后通過第一柱，以取出所有殘渣。用去氧核糖核酸酶(DNAse)處理后，由PCR實時(ABPrism7000，Perkin)在60°C的雜交溫度下，使用阿片樣物質μ受體或大麻素受體特定的引物將RNA轉錄成互補DNA:
[0065]-對于阿片樣物質μ 受體(MOR)(正義:ATgCCAgTgCTCATCATTAC，反義:gATCCTTCgAAgATTCCTgTCCT)，對于參照基因:β-肌動蛋白(正義:TCACCCACACTgTgCCCATCTACgA,反義:CAgCggAACCgCTCATTgCCAATg)；
[0066]-對于CBl 大麻素受體，正義 CCT AGA TGG CCT TGC AGA TAC C;CB1 反義 TGT CATTTG AGC CCA CGT ACA G ;CB2 正義 GCT AAG TGC CCT GGA GAA CGT ;反義 TCA GCC CCA GCCAAG CT0
[0067]3.結果
[0068]結果列于圖到3中。該結果由靶基因(β -肌動蛋白)/阿片樣物質μ受體(MOR)和/或大麻素受體(CBl，CB2)之間的比例所表達。
[0069]阿片樣物質μ受體和/或大麻素受體在ATCC ΗΤΒ-38上皮細胞株中表達(圖1到3)。
[0070]一些微生物例如乳桿菌屬菌株能夠誘導阿片樣物質μ受體和/或大麻素受體的信使RNA的表達。
[0071]該結果顯示了阿 片樣物質μ受體和/或大麻素受體的受培養(yǎng)基中上皮細胞的顯著誘導。
[0072]使用嗜酸乳桿菌菌株時，這種誘導特別強烈。
[0073]圖1和2顯示，用嗜酸乳桿菌培養(yǎng)上皮細胞3小時之后，觀察到阿片樣物質μ受體(圖1)和CBl (圖2)的信使RNA的基礎表達水平增加了約1000倍。
[0074]圖3顯示，用嗜酸乳桿菌培養(yǎng)上皮細胞3小時之后，觀察到CB2 (圖3)的信使RNA的基礎表達水平增加了約100倍。
[0075]反之，使用共生大腸桿菌菌株(圖1)，則沒有檢測到阿片樣物質μ受體的誘導。由嗜酸乳桿菌菌株得到的阿片樣物質受體和/或大麻素受體的誘導與由劑量為10ng/ml的TNF-α得到的誘導為同一數(shù)量級。
[0076]實施例2
[0077]1.原料和方法
[0078]菌株。
[0079]根據(jù)本發(fā)明，在37°C下，在 deMan Rogosa, Sharpe (MRS)肉湯(Becton Dickinson)中厭氧產生嗜酸乳桿菌NCFM菌株過夜。對于體外實驗，使用達到指數(shù)生長期的細菌。在動物接種之前，用革蘭氏染色法評估培養(yǎng)基的純度。
[0080]動物和實驗性的感染。
[0081]根據(jù)政府指南,在來自Lille的Institut Pasteur,在公認設施中進行動物試驗。12小時的白天周期下，每個籠子中安放五個Balb/c老鼠，老鼠可自由使用標準老鼠食物和自來水。在十四天中，一天一次，通過胃強飼法使動物接受再懸浮在0.5 % CMC (羧甲基纖維素，Sigma)中的IO9CFU的嗜酸乳桿菌菌株。通過頸脫臼法處死動物。切除動物身上的所有結腸并切成兩部分。一部分固定在4%酸性多聚甲醛中過夜并埋入石蠟中。另一部分結腸用于my-阿片樣物質受體(MOR)、大麻素受體(CBl和CB2)和炎性細胞因子TNF a、KC和IL-1 β的mRNA的量化。[0082]TNBS結腸炎的誘導和研究設計。因為MOR的表達由炎癥調節(jié)(Philippe D等人，JCI2003 ；Pol O et al，MoI Pharmaco12001 ；Pol O et al,Curr Top Med Chem2004)，我們使用TNBS-誘導的結腸炎作為正調控。根據(jù)政府指南，在來自Lille的lnstitut Pasteur,在公認設施中進行動物試驗。每個籠子中安放五個Balb/c老鼠，老鼠可自由使用標準老鼠食物和自來水。對于結腸炎誘導，使老鼠麻醉90-120分鐘，并接受TNBS的直腸內給藥(40 μ 1,150mg/kg)，所述TNBS溶解在0.9% NaCl: 100%乙醇為1:1的混合物內。對照組老鼠使用相同的技術接受0.9% NaCl: 100%乙醇為1:1的混合物或鹽溶液。TNBS給藥后4天處死動物。
[0083]定量實時PCR
[0084]根據(jù)廠家說明書，用Rneasy 兀件(Macherey Nagel, Hoerdt, France)將全部 RNA從整個結腸組織中分離出來。用分光光度測定法進行RNA的量化。在37C下用20-50單元的無 RNase 的 DNase I (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN,USA)處理 30分鐘后，用寡-dT 探針(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA)接合單股cDNA。在 GeneAmpAbiprism7000 (Applera, Courtaboeuf, France)里，用帶特定的老鼠寡聚核苷酸(見表 I)的 SYBR green Master Mix (Applera, Courtaboeuf, France)量化 mRNAs。每個試驗包括定刻度標準對照和無模板對照。每個樣本重復做三次。用Abiprism7000SDSsoftware (Applera, Courtaboeuf, France)分析SYBR綠色染料強度。所有結果標準化到未受影響的看家基因肌動蛋白。
[0085]表1
[0086]
【權利要求】
1.嗜酸乳桿菌菌株在制備在患有過敏性腸綜合征的人類或動物的胃腸系統(tǒng)中獲得鎮(zhèn)痛的載體中的用途，其中所述鎮(zhèn)痛通過大麻醇類受體和/或阿片受體來介導。
2.如權利要求1所述的用途，其中所述載體含有IO6到IO12CFU的細菌/克載體。
3.如權利要求1或2所述的用途，其中所述的嗜酸乳桿菌菌株為以注冊號為PTA-4797注冊在ATCC的菌株即嗜酸乳桿菌NCFM。
4.如權利要求1或2所述的用途，其中所述載體是藥學可接受的載體或食品。
5.如權利要求1或2所述的用途，其中所述載體是動物或植物來源的乳制品。
6.選擇益生菌來制備給藥予人類或動物用于胃腸系統(tǒng)的鎮(zhèn)痛目的的載體的方法，該方法包括以下步驟: i)將待測試益生菌與至少一個上皮細胞接觸； ?)檢測至少一個上皮細胞中阿片受體和/或大麻醇類受體的表達， 其中，如果所述待測試益生菌誘導阿片受體和/或大麻醇類受體的表達，則選擇該待測試益生菌。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟i)或ii)中的至少一個上皮細胞來自細胞株ATCC HTB-38或細胞株Caco-2。
8.如權利要求6或7所述的方法，其特征在于，步驟ii)通過檢測μ阿片受體和/或CBl受體和/或CB2受體來進行。
9.如權利要求6或7所述的方法，其特征在于，步驟ii)通過檢測阿片受體和/或大麻醇類受體的信使RNA的表達而進行。
【文檔編號】A61K35/74GK103961377SQ201410119530
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2005年9月21日 優(yōu)先權日:2004年9月21日
【發(fā)明者】皮埃爾·德勒莫, 迪迪埃·卡爾卡諾 申請人:杜邦營養(yǎng)生物科學有限公司