一種蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉的制備方法，所述方法為：將蘄蛇干燥、粉碎，制成蘄蛇粉末，將蘄蛇粉末與水以質量比1：5～20混合，在60～100℃密閉煎煮20～60分鐘，將提取液離心，取上清液冷卻至0℃，然后緩慢加入固體硫酸銨至飽和度為40%～60%，4℃靜置2小時，離心，收集沉淀，將沉淀加水溶解后以超純水為透析液進行透析，更換透析液至透過液中不含硫酸銨，取截留液，過濾，濾餅冷凍干燥，獲得蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉；本發(fā)明制備工藝條件簡單，條件溫和，所得蘄蛇凍干粉有效成分含量高，能夠更好地被人體吸收，同時發(fā)揮更大的藥效作用；通過硫酸銨沉淀能夠提取到純度較高的可溶性粗蛋白，同時保持較高的蛋白活性。
【專利說明】一種蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉的制備方法
(-)【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蛋白凍干粉的制備方法，特別涉及一種蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉的制備方法。
(二)【背景技術】
[0002]類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以侵蝕性關節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫病。主要臨床表現(xiàn)為對稱性、持續(xù)性關節(jié)腫脹和疼痛，常伴有晨僵，受累關節(jié)以近端指間關節(jié)，掌指關節(jié)，腕、肘和足趾關節(jié)最為多見，部分患者可出現(xiàn)發(fā)熱、貧血、皮下結節(jié)及淋巴結腫大等關節(jié)外表現(xiàn)。該病好發(fā)于中年女性，致殘率較高，發(fā)病I年內(nèi)致殘率可高達20%，10年內(nèi)可達60%左右。在中國，RA患病率為0.3-0.6%，而在發(fā)達國家成人中的發(fā)病率高達0.5%-1%?，F(xiàn)代醫(yī)學對于RA的藥物治療主要包括非甾體抗炎藥(NSAIDs)、病情改善抗風濕藥(DMARDs)、糖皮質激素以及生物制劑，但效果個體差異明顯，毒副作用較大，這是臨床使用抗風濕藥面臨的主要問題。[0003]類風濕關節(jié)炎屬中醫(yī)“痹證”范疇，多由正氣不足，感受風、寒、濕、熱之邪所致，常呈慢性進行性過程，病程長，其證多頑固難已。清代葉天士指出:“風寒濕三氣合而為痹，經(jīng)年累月，外邪留著，氣血俱傷，化為敗瘀凝痰，混處經(jīng)絡，須用蟲類搜剔，以動藥使血無凝著，氣可宣通?！碧I蛇是常用的蟲類藥，又名白花蛇，乃蝰科動物五步蛇的干燥體，味甘、咸，性、溫。有毒，入肝脾二經(jīng)，能搜風通絡、攻毒定驚。善行而無處不到，外達皮膚，內(nèi)通經(jīng)絡，且透骨搜風之力尤強，被稱為截風要藥，對于治療痹證有著顯著效果。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，蘄蛇能促進垂體前葉促腎上腺皮質激素的合成與釋放，使血中的這種激素濃度升高，產(chǎn)生抗炎、消腫鎮(zhèn)痛作用，且無激素樣的副作用。但是，蘄蛇現(xiàn)已被列為國家二級瀕危保護動物，藥材名貴，價格較高，而且來源有限，人工養(yǎng)殖較困難，因此，如何最大程度利用蘄蛇的藥用價值，是臨床使用蘄蛇急需解決的問題。
[0004]本發(fā)明人認為應當利用現(xiàn)代先進的科學技術發(fā)掘傳統(tǒng)藥物的特效成分，制成簡便易服、易推廣的劑型，同時使藥物更好的被人體吸收，以較少的藥材發(fā)揮最大的作用，進而充分發(fā)揮其對類風濕關節(jié)炎的治療作用。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]傳統(tǒng)中藥多以煎劑、散劑入藥，存在藥物有效成分吸收欠佳、不易保存及療效不穩(wěn)固等不足。本發(fā)明旨在克服以上不足，改進蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉的制作工藝，制成可以良好吸收、長久保存及療效穩(wěn)定的凍干粉劑型，從而確保了傳統(tǒng)中藥的有效利用和臨床推廣。同時，通過不同劑型的動物實驗比較，證實其無毒、無副作用，且療效較傳統(tǒng)煎劑和散劑更優(yōu)。
[0006]本發(fā)明采用的技術方案是:
[0007]本發(fā)明提供一種蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉的制備方法，所述方法為:將蘄蛇(優(yōu)選蘄蛇飲片)干燥、粉碎，制成蘄蛇粉末，將蘄蛇粉末與水以質量比1:5~20混合，在60~100°C條件下密閉煎煮20~60分鐘(優(yōu)選60°C煎煮30min)，將提取液離心，取上清液冷卻至0°C，然后緩慢加入固體硫酸銨至飽和度為40%~60%，4°C靜置2小時，離心，收集沉淀，將沉淀加水溶解后以超純水(優(yōu)選MiliQ超純水)為透析液進行透析，更換透析液至透過液中不含硫酸銨，取截留液，過濾，濾餅冷凍干燥，獲得蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉。
[0008]進一步，優(yōu)選所述水均為MiliQ超純水。
[0009]進一步，優(yōu)選所述蘄蛇粉末與水的質量比為1:15~20，更優(yōu)選1:20。
[0010]進一步，優(yōu)選所述濾餅冷凍干燥的條件為:-50~_70°C 1:冷凍干燥24~48h，更優(yōu)選_60°C冷凍干燥48h。
[0011]更進一步，本發(fā)明所述蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉的制備方法推薦按如下步驟進行:將蘄蛇干燥、粉碎至粒徑為60~100目，制成蘄蛇粉末，將蘄蛇粉末與MiliQ超純水以質量比1:20混合，在60°C密閉煎煮30min，將煎煮液在4°C、1200Xg條件下離心10min，取上清液冷卻至0°C，然后緩慢加入固體硫酸銨至飽和度為60%，4°C靜置2小時，離心，收集沉淀，將沉淀加MiliQ超純水溶解后以MiliQ超純水為透析液進行透析，更換透析液至透過液中不含硫酸銨，取截留液，用0.45 μ m濾膜過濾，濾餅在-50~_70°C冷凍干燥24~48h，獲得蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉；所述透析是在截留分子量1000的透析袋中進行。
[0012]本發(fā)明首先將提取蘄蛇水溶性總蛋白，然后凍干成凍干粉；建立II型膠原誘導的關節(jié)炎大鼠模型；分別用提取的蘄蛇凍干粉高、低劑量，蘄蛇煎劑高、低劑量，蘄蛇散劑高、低劑量喂養(yǎng)CIA模型；采用足趾容積測量法檢測CIA大鼠模型用藥前后雙足踝關節(jié)腫脹程度，并且進行關節(jié)炎指數(shù)評分；對大鼠足部進行X線照射，觀察其組織形態(tài)的變化；通過ELISA法檢測大鼠血清中IL-1 β的濃度；制作踝關節(jié)病理切片，HE染色觀察其病理改變。
[0013]本發(fā)明所述蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉在制備治療風濕性藥物中的劑量推薦為1.72g/kg。
[0014]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明提供一種制備蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉的制備方法，該制備工藝條件簡單，條件溫和，所得蘄蛇凍干粉有效成分含量高，能夠更好地被人體吸收，同時發(fā)揮更大的藥效作用；本發(fā)明通過硫酸銨沉淀能夠提取到純度較高的可溶性粗蛋白，同時能夠保持其生物活性，為后續(xù)的提純分離加工步驟提供可靠原料，此法對比三氟乙酸/丙酮沉淀提取方案，不僅減少總蛋白損失，同時保持較高的蛋白活性。
(四)【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為蘄蛇不同劑型對CIA大鼠關節(jié)炎指數(shù)的影響。
[0016]圖2為各組大鼠踝關節(jié)X線攝片比較，A為空白組，B為模型組，C為煎劑低計量組，D為煎劑高劑量組，E為凍干粉低計量組，F(xiàn)為凍干粉高劑量組，G為散劑低計量組，H為散劑高劑量組。
[0017]圖3為各組大鼠踝關節(jié)病理組織的HE染色照片，A為正常對照組(HE染色，20X )，B為模型組(HE染色，20 X )，C為煎劑低劑量組(HE染色，20 X )，D為煎劑高劑量組(HE染色，20 X )，E為凍干粉低劑量組(HE染色，20 X )，F(xiàn)為凍干粉高劑量組(HE染色，20 X )，G為散劑低劑量組(HE染色，20 X )，H為散劑高劑量組(HE染色，20 X )。
[0018]圖4為不同溫度下獲得的蘄蛇水溶性總蛋白的電泳圖，a為分子量Mark，b和c為實施例1獲得的提取液，d和e為實施例2獲得的提取液，f和g為實施例3獲得的提取液。
[0019]圖5為不同時間下獲得的蘄蛇水溶性總蛋白的電泳圖，a為70°C提取20分鐘獲得的提取液；b為70°C提取40分鐘獲得的提取液；c為70°C提取60分鐘獲得的提取液。
(五)【具體實施方式】
[0020]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:
[0021 ] 實施例1:蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉
[0022]稱取蘄蛇飲片(購自浙江中醫(yī)藥大學飲片廠)5g，粉碎，過100目，制成蘄蛇粉末，60°C烘干30分鐘，實際重量為4.976g，置于密閉容器，加入100mLMiliQ超純水，混勻，60°C煎煮40分鐘，將提取液轉移至離心管(50ml)，4°C、1200Xg離心10min，取上清即得粗蛋白；將粗蛋白冷卻到0°C，逐步加入固體硫酸銨至飽和度60%，4°C靜置2小時，1200Xg離心30分鐘，收集沉淀，MiliQ超純水重新溶解沉淀，裝入透析袋(截留分子量1000)中，以MiliQ超純水為透析液，4°C透析脫鹽，多次更換透析液至透過液測不到硫酸銨，得蛋白提取物(SP截留液)，用0.45 μ m濾膜過濾除菌，濾餅在-60°C凍干48h，獲得蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉0.198g，備用。
[0023]實施例2
[0024]將實施例1中的煎煮溫度改為80°C，其他操作同實施例1，獲得蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉0.207g。
[0025]實施例3
[0026]將實施例1中的煎煮溫度改為100°C，其他操作同實施例1，獲得蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉0.213g。
[0027]利用BCA蛋白濃度檢測法，將實施例1-3煎煮結束后獲得的提取液進行蛋白濃度的檢測(SDS-PAGE銀染)，不同溫度獲得提取液統(tǒng)一上樣濃度為5mg/ml，具體為:(1)固定:室溫下，10%冰醋酸固定液(冰醋酸:150ml ;雙蒸水:1350ml，震蕩30min左右)。(2)洗膠:把經(jīng)固定的膠板置于盛有1.5L雙蒸水的塑料盤中，清洗兩次，每次2-4min。(3)染色:染色液(硝酸銀:1.5g (0.lwt%)>37wt%甲醇2.25ml,加雙蒸水至1.5L)震蕩30min左右。(4)顯色:顯色液(碳酸鈉:45g(終濃度0.03g/ml)，體積濃度37%甲醛水溶液2.25ml (終濃度0.15%)，硫代硫酸鈉300 μ I (終濃度10mg/ml)，加雙蒸水至1.5L)。(5)終止顯色:雙蒸水清洗。
[0028]使用儀器:Min1-PROTEAN? Tetra Cell凝膠電泳儀，其中b、d、f上樣量為1μ l，c、e和g上樣量為2μ 1，結果見圖4所示。60°C提取液(b，c)在66-116KD區(qū)間有多條明顯大分子蛋白條帶；80°C提取液(d，e)在25kD左右的蛋白含量較高；100°C提取液(f，g)在25kD左右的蛋白含量較高，在18.4kD處條帶含量增加。
[0029]結論:升高溫度使蘄蛇水溶性總蛋白分解為小分子蛋白多肽。
[0030]實施例4:提取時間對蘄蛇水溶性總蛋白的影響
[0031]將實施例1煎煮溫度改為70°C，煎煮時間依次為20分鐘、40分鐘和60分鐘，獲得3份提取液，將提取液分別進行蛋白濃度測定，結果見圖5所示。煎煮時間對提取液中可溶性總蛋白的影響(銀染，上樣量2μ I):隨提取時間延長，相同位置蛋白條帶顏色加深，表明含量增加(40分鐘對比20分鐘)，提取時間繼續(xù)增加，小分子條帶出現(xiàn)，表明持續(xù)受熱對蛋白的分解作用(60分鐘對比40分鐘)。
[0032]實施例5:蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉對類風濕關節(jié)炎大鼠的干預效應
[0033](一)材料與方法
[0034]1.實驗動物
[0035]Wistar大鼠，雌性，體重160±20g，共70只，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號=SYXK (浙)2008-0115。全封閉SPF狀態(tài)下隔離飼養(yǎng)，室溫20°C，相對濕度40~60%，每日光照12h，自由攝食、飲水。
[0036]2.實驗藥品
[0037]蘄蛇購自浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片廠，干燥藥材250g。
[0038]3.實驗試劑
[0039]牛II型膠原購自Chondrex公司；弗氏完全佐劑、弗式不完全佐劑購自Sigma公司；大鼠白介素_1β (IL-Ιβ )ELISA試劑盒購自R&D公司；大鼠抗牛II型膠原抗體ELISA試劑盒購自Chondrex公司。
[0040]4實驗儀器
[0041 ] YLS-7A足趾容積測量儀(安合盟科技發(fā)展有限公司)、多功能酶標儀(ThermoScientific公司)、小動物成像儀、病理切片、顯微鏡。
[0042]5.實驗方法
[0043]5.1造模方法
[0044]選取SPF級健康雌性wistar大鼠70只，適應性喂養(yǎng)一周。參照《CurrentProtocols in Immunology》中CIA大鼠的造模方法，具體如下:牛II型膠原8ml,溶于
0.05mol/L、pH3.2冰醋酸水溶液中，造模前一天配制，4°C冰箱振蕩過夜。第二天，與等體積的完全弗氏佐劑混合，用注射器法反復乳化，制成含牛II型膠原1.0mg/mL的乳化液(gp膠原乳劑)。隨機選取8只作為空白對照組，余下62只大鼠均進行初次免疫，分多點于大鼠尾根部皮下注射膠原乳劑，0.2mL/只。初次免疫I周后，再次配置膠原乳劑，將完全弗氏佐劑換成不完全弗氏佐劑，其余方法同上，然后于大鼠尾根部不同點注射含有牛II型膠原1.0mg/mL的膠原乳劑進行加強免疫，0.15mL/只。初次及加強免疫時，空白對照組8只大鼠皮下注射等量的生理鹽水。
[0045]5.2藥物制備
[0046]蘄蛇煎劑:將43g蘄蛇飲片置于300ml蒸餾水中，100°C煎煮濃縮至100ml，得到濃度為0.43g/ml的蘄蛇水煎劑；將86g蘄蛇飲片置于300ml蒸餾水中，100°C煎煮濃縮至100ml，得到濃度為0.86g/ml的蘄蛇水煎劑。
[0047]蘄蛇散劑:將蘄蛇飲片磨成散劑，100目過篩，溶于蒸餾水，分別配制0.145g/ml和
0.29g/ml的蘄蛇混懸液。
[0048]5.3分組及給藥
[0049]初次免疫后20天，56只實驗大鼠關節(jié)炎指數(shù)超過6分(包括6分)，即造模成功，然后將造模成功的大鼠根據(jù)雙后足腫脹程度用隨機區(qū)組法分成蘄蛇煎劑低劑量組、蘄蛇煎劑高劑量組、蘄蛇散劑低劑量組、蘄蛇散劑高劑量組、蘄蛇凍干粉低劑量組、蘄蛇凍干粉高劑量組、模型組共7組，每組8只。[0050]分組后開始灌胃給藥觀察，灌胃劑量為2ml/只，每天I次，共給藥24天。根據(jù)實驗動物藥物劑量換算出藥物濃度:蘄蛇煎劑低劑量組0.86g/kg、蘄蛇煎劑高劑量組
1.72g/kg、蘄蛇凍干粉低劑量組0.25g/kg、蘄蛇凍干粉高劑量組0.50g/kg、蘄蛇散低劑量組0.29g/kg、蘄蛇散高劑量組0.58g/kg?？瞻讓φ战M和模型組用等量蒸餾水灌胃。
[0051]6.觀察指標及方法
[0052]6.1 一般情況
[0053]造模、給藥前后觀察大鼠體重變化、活動形態(tài)、體毛色澤、飲食變化、排泄狀況等。
[0054]6.2足趾腫脹度
[0055]用足趾容積測量儀測量大鼠雙后足的腫脹度，以大鼠雙后足的足容積量作為足腫脹的指標。初次免疫前測量I次，之后每周測量I次。
[0056]腫脹度(％)=(造模后足容積一造模前足容積)/造模前足容積
[0057]6.3關節(jié)炎指數(shù)(Al)
[0058]初次免疫后開始觀察并記錄大鼠四肢關節(jié)病變程度，每7dl次。參照5級評分法評價:0分:無關節(jié)炎；1分:小趾關節(jié)輕度腫脹；2分:小趾關節(jié)和足跖腫脹；3分:踝關節(jié)以下的足爪腫脹；4分:包括踝關節(jié)在內(nèi)的全部關節(jié)腫脹。累積得分6分及以上者造模成功，最高為16分。
[0059]6.4血清IL-1 β、抗牛II型膠原抗體檢測
[0060]給藥35天后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動脈取血,3000r/分鐘離心后采集血清，分裝保存。嚴格按照試劑盒說明書檢測IL-1 β、抗牛II型膠原抗體含量。
[0061]6.5小動物成像系統(tǒng)
[0062]給藥35天后，麻醉處死大鼠，取雙側踝關節(jié)，置于小動物成像儀上，設置好參數(shù)，X線拍攝，觀察其改變。
[0063]6.6踝關節(jié)病理觀察
[0064]X線拍攝后，及時將關節(jié)放入10%福爾馬林中，固定一周，石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下觀察病理變化。
[0065]6.7統(tǒng)計學處理
[0066]計量資料用平均數(shù)土標準差表示；多組間比較采用方差分析法，方差齊性時組間兩兩比較采用LSD-t法，方差不齊時采用Kruskal-wallis H檢驗。均采用雙側檢驗，P< 0.05者認為有統(tǒng)計意義，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。
[0067](二)結果
[0068]1.各組大鼠治療前后雙側足趾腫脹度檢測結果
[0069]造模后，模型組與正常對照組相比，左后足腫脹度明顯增加(P〈0.01);給藥二周后，與模型組相比，各組均呈下降趨勢，其中煎劑低劑量組、凍干粉高劑量組、散劑低、高劑量組左后足腫脹度下降具有統(tǒng)計學意義(P〈0.05，P<0.01);給藥三周后，與模型組相比，各組左后足腫脹度繼續(xù)下降，其中煎劑低、高劑量組、凍干粉高劑量組、散劑低、高劑量組下降具有明顯差異(p〈0.05，P〈0.01)。(見表1)
[0070]表1蘄蛇不同劑型對CIA大鼠左后肢足腫脹度的影響G 士S，%，n=8)
【權利要求】
1.一種蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉的制備方法，其特征在于所述方法為:將蘄蛇干燥、粉碎，制成蘄蛇粉末，將蘄蛇粉末與水以質量比1:5~20混合，在60~100°C密閉煎煮20~60分鐘，將提取液離心，取上清液冷卻至0°C，然后緩慢加入固體硫酸銨至飽和度為40%~60%，4°C靜置2小時，離心，收集沉淀，將沉淀加水溶解后以超純水為透析液進行透析，更換透析液至透過液中不含硫酸銨，取截留液，過濾，濾餅冷凍干燥，獲得蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉。
2.如權利要求所述蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉的制備方法，其特征在于所述水均為MiliQ超純水。
3.如權利要求所述蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉的制備方法，其特征在于所述蘄蛇粉末與水的質量比為1:20。
4.如權利要求所述蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉的制備方法，其特征在于所述濾液冷凍干燥的條件為:-50~_70°C冷凍干燥24~48h。
5.如權利要求所述蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉的制備方法，其特征在于所述方法按如下步驟進行:將蘄蛇干燥、粉碎至粒徑為60~100目，制成蘄蛇粉末，將蘄蛇粉末與MiliQ超純水以質量比1:20混合，在60°C密閉煎煮30分鐘，將提取液在4°C、1200Xg條件下離心lOmin，取上清液冷卻 至0°C，然后緩慢加入固體硫酸銨至飽和度為60%，4°C靜置2小時，離心，收集沉淀，將沉淀加MiliQ超純水溶解后以MiliQ超純水為透析液進行透析，更換透析液至透過液中不含硫酸銨，取截留液，用0.45 μ m濾膜過濾，濾餅在-50~_70°C冷凍干燥24~48h，獲得蘄蛇水溶性總蛋白凍干粉；所述透析是在截留分子量1000的透析袋中進行。
【文檔編號】A61P19/02GK103919810SQ201410119382
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年3月27日 優(yōu)先權日:2014年3月27日
【發(fā)明者】謝志軍, 包潔, 孫靜, 林晨, 范永升 申請人:浙江中醫(yī)藥大學