半胱氨酸功能化的透明質(zhì)酸結(jié)合物及其合成方法以及在可注射原位形成的水凝膠中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了半胱氨酸功能化的透明質(zhì)酸結(jié)合物及其合成方法以及在制備可注射原位形成的水凝膠中的應(yīng)用。該方法是通過(guò)修飾透明質(zhì)酸的羥基，得到具有穩(wěn)定醚鍵的半胱氨酸功能化的透明質(zhì)酸結(jié)合物，在此反應(yīng)過(guò)程中引入了四丁基氫氧化銨這種新方法增加了透明質(zhì)酸的溶解度并且提高了反應(yīng)效率，所得到的半胱氨酸功能化的透明質(zhì)酸結(jié)合物具有巰基活性基團(tuán)，不但增加了透明質(zhì)酸的粘附性，還可繼續(xù)功能化，且本發(fā)明運(yùn)用所制備的半胱氨酸功能化的透明質(zhì)酸結(jié)合物與聚乙二醇結(jié)合物通過(guò)自然化學(xué)連接反應(yīng)或邁克爾加成反應(yīng)生成了可注射原位形成的水凝膠，經(jīng)流變學(xué)研究具有良好的流變學(xué)性質(zhì)，并且凝膠性能可控，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】半胱氨酸功能化的透明質(zhì)酸結(jié)合物及其合成方法以及在可注射原位形成的水凝膠中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種半胱氨酸功能化的透明質(zhì)酸結(jié)合物及其合成方法，以及其在制備可注射原位形成的水凝膠中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】[0002]水凝膠(Hydrogel)是親水性的聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可以吸收和保留大量的水分，在水溶液中高度膨脹，具有良好的生物相容性。它們?cè)卺t(yī)藥生物領(lǐng)域廣泛地應(yīng)用于外科封閉劑和粘合劑、藥物釋放、組織填充、組織修復(fù)和組織工程。水凝膠被用于創(chuàng)傷敷料時(shí)與人體組織直接接觸，可防止體外微生物感染，有效地防止體液的損失，促進(jìn)傷口愈合，還能將藥物包裹在水凝膠中，藥物即可透過(guò)凝膠緩慢釋放到受傷部位。例如有文獻(xiàn)研究用藻酸韓纖維制成的Sorbalgon水凝膠,用于創(chuàng)傷敷料促進(jìn)創(chuàng)面愈合【Hajek Μ,Sedlarik K M, Advantages of alginate bandages for coverage of extensive andpoorly healing wounds, RozhiChir, 1992, 71 (324): 152】。也有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)水凝膠被用于藥物釋放的載體，即將藥物包裹在水凝膠內(nèi)，通過(guò)注射或者移植入生物體后，維持長(zhǎng)時(shí)間緩慢可控的釋放出藥物，長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮藥物作用，例如Miyata等制備了抗原_抗體敏感性水凝膠，用于藥物釋放載體，起到特異性藥物緩釋的作用?！維chmedlen R H, Masters K S,West J L.Photocrosslindable polyvinyl alcohol-jydrogels that call be modifiedwith celladhision peptides for use in tissue engineering.Biomaterials,2002,23: 4325】。同時(shí)由于水凝膠優(yōu)良的物理性質(zhì)與生物學(xué)特性，還可應(yīng)用于美容、皮膚移植是皮片的固、腹腔手術(shù)后防止粘連以及顱腔手術(shù)的封閉等方面，此方面的應(yīng)用研究越來(lái)越受學(xué)者們的關(guān)注。
[0003]雖然其在醫(yī)藥中的應(yīng)用取得了巨大的進(jìn)展，發(fā)展?jié)M足臨床需要的在溫和條件下不使用有毒試劑的可注射原位形成的共價(jià)交鏈的水凝膠仍然面臨著挑戰(zhàn)。大部分在組織工程方面的應(yīng)用的主要缺陷就是需要外科手術(shù)。然而，可注射原位形成的水凝膠則具有顯著的優(yōu)勢(shì):不經(jīng)過(guò)手術(shù)而通過(guò)針管注射，以最小程度地對(duì)機(jī)體組織侵入，能填充任意形狀的缺損，且能與治療藥物混合，起到藥物緩釋的作用。
[0004]在生物界，硫酯類化合物(Thioesters)是廣泛存在的中間體，比如乙酰輔酶A。在酶的催化下，硫酯類化合物參與生物體內(nèi)重要成分的合成，比如多肽激素和脂類。在體外，硫酯類化合物與一級(jí)氨類化合物的化學(xué)反應(yīng)相對(duì)地不活潑。然而，人們發(fā)現(xiàn)，硫酯類化合物和N-末端半光氨酸的化合物在生理?xiàng)l件下(磷酸鹽緩沖溶液，PH7-9)混合后，半光氨酸的巰基和硫酯類化合物的硫醇發(fā)生交換，形成一個(gè)五圓環(huán)的中間體后自發(fā)地重排，產(chǎn)生一個(gè)新的酰胺鍵，稱為自然化學(xué)連接(Native Chemical Ligation,NCL)。這個(gè)化學(xué)反應(yīng)己用于多肽，蛋白質(zhì)，酶類的人工合成，也用于多肽自組裝產(chǎn)生重復(fù)序列的多肽。有報(bào)道是使用NCL反應(yīng)把短多肽自主裝的水凝膠通過(guò)延長(zhǎng)多肽長(zhǎng)度而增加了預(yù)先組裝多肽水凝膠的硬度，也有文獻(xiàn)中用NCL反應(yīng)把分枝的聚乙二醇結(jié)合物交鏈形成共價(jià)交鏈的水凝膠。作為水凝膠共價(jià)交鏈的方法，NCL有幾個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn):①具有化學(xué)選擇性，硫脂只與半胱氨酸、或N-末端半光氨酸的化合物反應(yīng)形成新的酰胺鍵，不受其他硫醇和巰基存在的干擾；②在溫和的條件下，不使用催化劑、引發(fā)劑等可能有毒的化合物而高效反應(yīng)；③與其它使用巰基的化學(xué)連接反應(yīng)形成的水凝膠不同，自然化學(xué)連接反應(yīng)在形成新的酰胺鍵的同時(shí)，還在骨架上產(chǎn)生一個(gè)巰基基團(tuán)。那么，這個(gè)巰基可以根據(jù)不同的目的用來(lái)進(jìn)一步在骨架上功能化水凝膠。而且，巰基化(硫醇化)的聚合物具有更好的生物黏附性。④另外，硫脂結(jié)構(gòu)中的硫醇在NCL反應(yīng)時(shí)釋放到溶液中，那么，在設(shè)計(jì)硫脂的時(shí)候，有可能把這個(gè)硫醇設(shè)計(jì)為巰基化的藥物和細(xì)胞生長(zhǎng)因子的前體，從而在水凝膠形成的同時(shí)，釋放這些藥物和生長(zhǎng)因子到水凝膠中。因此，利用NCL反應(yīng)的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)得到的可注射原位形成的共價(jià)交鏈的水凝膠具有顯著的優(yōu)越性。例如:有文獻(xiàn)以聚乙二醇為主體，末端硫酯或半胱氨酸功能化，通過(guò)自然化學(xué)連接反應(yīng)得到聚乙二醇水凝膠【B1-Huang Hu, Jing Su, and Phillip B.Messersmith, Hydrogelscross-linked by native chemical ligation, Biomacromolecules2009,10, 2194-2200】。
[0005]透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid, HA)廣泛分布于人體各部位,為關(guān)節(jié)腔滑液的主要成分，為軟骨基質(zhì)的成分之一，它在關(guān)節(jié)間減少組織間的磨擦，發(fā)揮潤(rùn)滑作用。HA是一種直鏈的高分子多糖類聚合物，由N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸雙糖單位組成。在細(xì)胞外基質(zhì)中，透明質(zhì)酸通過(guò)與細(xì)胞和其他成分特異和非特異的結(jié)合，發(fā)揮著重要的組織作用，比如，透明質(zhì)酸是細(xì)胞表面受體CD44的配體，而CD44受體參與多種細(xì)胞過(guò)程，比如細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移和增值。由于其重要的生理作用，機(jī)體或創(chuàng)面直接注射透明質(zhì)酸后可明顯減輕并消除組織的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面與傷口愈合。但是，由于透明質(zhì)酸在體內(nèi)快速地被清除，這樣的緩解作用也是短暫的，所以可注射原位形成的共價(jià)交聯(lián)的透明質(zhì)酸水凝膠就顯示出了它的優(yōu)越性。
[0006]共價(jià)交鏈的透明質(zhì)酸的水凝膠主要是通過(guò)其羧基的反應(yīng)制備可以發(fā)生交鏈的衍生物得到透明質(zhì)酸水凝膠。例如:有文獻(xiàn)是修飾透明質(zhì)酸的羧基，得到通過(guò)酰胺鍵結(jié)合并且末端有游離巰基的透明質(zhì)酸結(jié)合物，再通過(guò)與聚乙二醇衍生物交聯(lián)形成可注射的透明質(zhì)酸水凝膠【Xiao Zheng Shu, Yanchun Liu, Fabio S.Palumbo, Yi Luo,Glenn D.Prestwich, In situ crosslinkable hyaluronan hydrogels for tissueengineering, Biomaterials2004，25，1339-1348】。也有文獻(xiàn)通過(guò)己二酸二酸餅修飾，并且加入EDC與HOBt作為耦合劑與催化劑，修飾透明質(zhì)酸的羧基，得到透明質(zhì)酸結(jié)合物再通過(guò)交聯(lián)形成透明質(zhì)酸凝膠【Yoon Yeo, Christopher B.Highley，Evangelia Bellas，Taichi Ito，Robert Marmi, Robert Langer, Daniel S.Kohane, In situ cross-linkablehyaluronic acid hydrogels prevent post-operative abdominal adhesions in arabbit model，Biomaterials2006，27，4698-4705】。也有通過(guò)與透明質(zhì)酸的羥基反應(yīng)形成水凝膠的交鏈化學(xué)反應(yīng)，交鏈化合物主要是1，4_ 丁二醇二縮水甘油醚，聚乙二醇二縮水甘油醚和二乙烯基砜，也有先用縮水甘油醚和透明質(zhì)酸的羥基反應(yīng)，再進(jìn)行光聚合反應(yīng)形成水凝膠。例如:中國(guó)專利申請(qǐng)201010250802.X《一種大分子光交聯(lián)劑制備透明質(zhì)酸凝膠的方法》，其用透明質(zhì)酸為主體，大分子光交聯(lián)劑為交聯(lián)劑，在紫外光的照射下制備透明質(zhì)酸水凝膠。再例如:中國(guó)專利申請(qǐng)03156633.2《一種透明質(zhì)酸凝膠及其制備方法》與中國(guó)專利申請(qǐng)200610024700.X《一種交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠制劑及其制備工藝》分別用縮水甘油醚與二乙烯基砜對(duì)透明質(zhì)酸的羥基進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，得到透明質(zhì)酸凝膠。并且也有文獻(xiàn)通過(guò)光照反應(yīng)修飾透明質(zhì)酸的羥基，得到通過(guò)酯鍵連接的透明質(zhì)酸修飾物，再通過(guò)交聯(lián)反應(yīng)得到透明質(zhì)酸水凝膠【JimmyMergy, Audrey Fournier, Emilie Hachet, Rachel Auz_ely-Velty,Modification of polysaccharides via thiol—ene chemistry ； a versatile route tofunctional biomaterials.J.Polym.Sc1.Part A: Polym.Chem.2012.50,4019-3028】。這些交聯(lián)的透明質(zhì)酸保留在體內(nèi)的時(shí)間都有明顯延長(zhǎng)。
[0007]存在于人體內(nèi)具有重要生理功能的透明質(zhì)酸經(jīng)過(guò)交鏈后形成的水凝膠應(yīng)該是比較理想的生物材料，它克服了天然透明質(zhì)酸半衰期短的缺點(diǎn)。但是，通過(guò)透明質(zhì)酸的羧基制備的交鏈的水凝膠，可能會(huì)產(chǎn)生一些副作用。細(xì)胞CD44受體據(jù)認(rèn)為是通過(guò)透明質(zhì)酸的負(fù)電荷與透明質(zhì)酸作用【Morra, M., Engineering of biomaterials surfaces by hyaluronan,Biomacromolecules2005,6: 1205-1223.】。而減少透明質(zhì)酸的負(fù)電荷則會(huì)影響細(xì)胞CD44受體與透明質(zhì)酸的作用，從而會(huì)降低細(xì)胞修復(fù)損傷的能力【M B Herrera, B.B., S Brumo,L Morandol, G Mauriello-Romanazzi, F Sanavio3, I Stamenkovic, L Biancone and GCamussi, Exogenous mesenchymal stem cells localize to the kidney by means ofCD44following acute tubular injury, Kidney Int.2007,72: 430-441.】。而通過(guò)其輕基反應(yīng)得到透明質(zhì)酸水凝膠往往需要通過(guò)光照反應(yīng)或是用其他方法已經(jīng)預(yù)先形成的水凝膠，這樣就不能實(shí)現(xiàn)原位注射。因此，本發(fā)明以透明質(zhì)酸為原料，通過(guò)其羥基反應(yīng)(不改變其負(fù)電荷)，制備具有良好生物相容性、能夠通過(guò)自然化學(xué)連接反應(yīng)得到的可原位注射的共價(jià)交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠具有顯著地優(yōu)越性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種半胱氨酸功能化的透明質(zhì)酸結(jié)合物。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供一種半胱氨酸功能化的透明質(zhì)酸結(jié)合物的合成方法。
[0010]本發(fā)明的再一目的在于提供半胱氨酸功能化的透明質(zhì)酸結(jié)合物在制備可注射原位形成的水凝膠中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
[0012]一種半胱氨酸功能化的透明質(zhì)酸結(jié)合物，其結(jié)構(gòu)式為:[0013]η) n為
【權(quán)利要求】
1.一種半胱氨酸功能化的透明質(zhì)酸結(jié)合物，其結(jié)構(gòu)式為:
2.權(quán)利要求1所述一種半胱氨酸功能化的透明質(zhì)酸結(jié)合物的制備方法，其特征在于:包括以下步驟:
1)取結(jié)構(gòu)式為
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種半胱氨酸功能化的透明質(zhì)酸結(jié)合物的制備方法，其特征在于: 其制備方法具體包括以下步驟: 1)化合物2的制備:取化合物I半胱氨酸鹽酸鹽，加入干燥丙酮回流2~10h，減壓濃縮至不多于總反應(yīng)液體積三分之一的體積，放入冰箱不少于0.5h，析出結(jié)晶，過(guò)濾取濾渣，得到化合物2，其中丙酮與化合物I的體積質(zhì)量比不小于20 ； 2)化合物3的制備:把化合物2用乙腈溶解，加入二碳酸二叔丁酯，混勻后逐滴加入N，N-二異丙基乙胺，15°C~37°C攪拌反應(yīng)24~72h，減壓濃縮溶劑，再加入乙醚或環(huán)己烷繼續(xù)減壓濃縮，再加入乙醚或環(huán)己烷，用硅藻土過(guò)濾，濾液依次用0.01~0.1mol / L HCl溶液、H20、飽和NaCl萃取，干燥，減壓濃縮，得到化合物3，其中二碳酸二叔丁酯、N，N- 二異丙基乙胺的物質(zhì)的量獨(dú)立為化合物2的1.1~3倍； 3)化合物4的制備:將化合物3和N-羥基琥珀酰亞胺用四氫呋喃溶解，O~4°C冰浴，往其中滴加N，N' - 二環(huán)己基碳二亞胺的四氫呋喃溶液，混合均勻后反應(yīng)3~12h，至反應(yīng)液用薄層色譜檢測(cè)反應(yīng)完全，放入O~4°c冰箱靜置0.5~12h，過(guò)濾取濾液，經(jīng)減壓濃縮溶劑，異丙醇重結(jié)晶，得到化合物4，其中N-羥基琥珀酰亞胺、N，N' -二環(huán)己基碳二亞胺的物質(zhì)的量獨(dú)立為化合物2的1.05~1.5倍； 4)化合物5的制備:用水溶解摩爾量相當(dāng)于化合物4摩爾量0.525~0.6倍的胱胺二鹽酸鹽，用水溶解摩爾量相當(dāng)于胱胺二鹽酸鹽摩爾量4倍的碳酸鈉，滴加在胱胺二鹽酸鹽水溶液中，冰浴，攪拌均勻；用四氫呋喃溶解化合物4，滴加入上述反應(yīng)液中，15°C~37°C反應(yīng)6~24h，直至薄層色譜檢測(cè)反應(yīng)完全；減壓濃縮溶劑，調(diào)節(jié)pH為3~7，再用乙酸乙酯或二氯甲烷萃取，有機(jī)相用0.01~0.lmol/LHCl溶液、H20、飽和NaCl萃取，干燥，減壓濃縮，得到化合物5 ； 5)化合物6的制備:將化合物5的乙醇溶液中，再加入0.5~1.0倍體積的水，冰浴攪拌均勻，再緩慢加入硼氫化鈉，待不再有氣泡冒出，置于15~37°C攪拌反應(yīng)4~12h，至薄層色譜檢測(cè)反應(yīng)完全，再加入相對(duì)反應(yīng)液體積2~4倍的水終止反應(yīng)；調(diào)節(jié)pH為3~5，二氯甲烷萃取，水洗，通氬氣，封口干燥，過(guò)濾，加壓濃縮得到化合物6，其中，硼氫化鈉的物質(zhì)的量為化合物5的5~10倍； 6)化合物7的制備:往聚乙二醇類化合物的乙腈溶液中加入碳酸氫鈉的水溶液，15~37°C攪拌均勻，通氬氣，再往其中滴加化合物6的乙腈溶液，滴加完后通氬氣，反應(yīng)液中乙腈:水的體積比為(2: 3)~(3: 2)，封口，15~37°C攪拌反應(yīng)6~24h，直至薄層色譜檢測(cè)反應(yīng)完全、Ellamn試劑顯色不顯黃色為止，減壓濃縮溶劑，用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用水洗后干燥，過(guò)濾取濾液，減壓濃縮得到化合物7，其中，碳酸氫鈉、化合物6的物質(zhì)的量分別為聚乙二醇類化合物的I~2倍、1.1~1.5倍； 7)化合物8的制備:稱取其分子量為10萬(wàn)~100萬(wàn)的透明質(zhì)酸，加入四丁基氫氧化銨水溶液，得到透明質(zhì)酸反應(yīng)液，其中透明質(zhì)酸反應(yīng)液質(zhì)量濃度為5%~20%，分I~4次加入化合物7的乙腈溶液，15~37°C攪拌反應(yīng)6~72h，用0.01~lmol / L HCl溶液中和反應(yīng)液，透析，凍干，飽和氯化鈉乙醇溶液洗滌，干燥，得到化合物8，其中，四丁基氫氧化銨、化合物7的物質(zhì)的量分別為透明質(zhì)酸伯醇基的0.5~2倍、0.5~10倍，乙腈體積為四丁基氫氧化銨水溶液的0.5~2.5倍； 8)化合物9的制備:將化合物8加入體積百分?jǐn)?shù)為80~100%的三氟乙酸水溶液中，使化合物8的濃度為5~20g / L，15~37°C攪拌反應(yīng)3~6h，減壓濃縮，加入體積濃度為45~55%的乙醇溶液，30~40°C減壓濃縮3~10次，用Ellman試劑檢測(cè)顯黃色后，用飽和氯化鈉乙醇溶液析出產(chǎn)物，洗滌干凈，干燥，得到產(chǎn)物化合物9，即半胱氨酸功能化的透明質(zhì)酸結(jié)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種半胱氨酸功能化的透明質(zhì)酸結(jié)合物的制備方法，其特征在于:步驟4)和5)中所述調(diào)節(jié)pH的調(diào)節(jié)劑為體積濃度為0.1 %~2% HCl溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種半胱氨酸功能化的透明質(zhì)酸結(jié)合物的制備方法，其特征在于:步驟7)中所述透析用到的透析液為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)0.1~1.5%氯化鈉和體積百分?jǐn)?shù)30~80%乙醇的水溶液，至少透析48小時(shí)，至少換透析液4次。
6.權(quán)利要求1所述的一種半胱氨酸功能化的透明質(zhì)酸結(jié)合物在制備可注射原位形成的水凝膠中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:其具體的應(yīng)用為可注射原位形成的水凝膠由權(quán)利要求1權(quán)利所述的半胱氨酸功能化的透明質(zhì)酸結(jié)合物與聚乙二醇結(jié)合物通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)或自然化學(xué)連接反應(yīng)生成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的聚乙二醇結(jié)合物選自結(jié)構(gòu)式為
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的聚乙二醇硫酯結(jié)合物選自3-巰基丙酸乙酯與聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯結(jié)合物、N-乙酰-L-半胱氨酸與聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯結(jié)合物、2-巰基乙烷磺酸鈉與聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯結(jié)合物、4-巰基苯基乙酸與聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯結(jié)合物、2-二甲氨基乙硫醇與聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯結(jié)合中一種，其中聚乙二醇硫酯結(jié)合物的聚合度為50~500，支鏈個(gè)數(shù)為2~8。
【文檔編號(hào)】A61L27/20GK103910886SQ201410110610
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月24日
【發(fā)明者】張歆, 胡碧煌 申請(qǐng)人:海南大學(xué)