工程化cd20靶向性的nkt細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用，該細(xì)胞是嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細(xì)胞，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如序列表中SEQID?NO.1所示。其制備方法包括：首先構(gòu)建嵌合抗原受體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，然后感染NKT細(xì)胞，進(jìn)行體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞。在進(jìn)展期CD20陽性惡性腫瘤治療中采用工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞可以明顯的延長免疫細(xì)胞在患者體內(nèi)的存活時(shí)間，增強(qiáng)免疫細(xì)胞靶向識(shí)別腫瘤抗原的能力，加強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。
【專利說明】工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于腫瘤生物制品領(lǐng)域，涉及過繼免疫治療中的一種工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞(CAR20-NKT細(xì)胞)、其制備及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]臨床將^^-…^^^^人⑶化人^^+淋巴樣細(xì)胞鑒定為爾丁細(xì)胞。NKT細(xì)胞既表達(dá)T細(xì)胞表面標(biāo)志，又表達(dá)NK細(xì)胞的表面標(biāo)志，NKT細(xì)胞能夠識(shí)別和殺傷突變的腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞，而對(duì)正常自身組織細(xì)胞無細(xì)胞毒作用。NKT細(xì)胞通過自身表面的CD16與特異性抗體的 Fe 段結(jié)合，發(fā)揮 ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)作用。但是，在抗體介導(dǎo)的ADCC作用過程中，抗體能與靶細(xì)胞上的相應(yīng)抗原表位特異性結(jié)合，可殺傷任何已與抗體結(jié)合的靶細(xì)胞，抗體與靶細(xì)胞上的抗原結(jié)合是特異性的，NKT細(xì)胞等對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用是非特異性的。通常情況下，輸注的NKT細(xì)胞在患者體內(nèi)半衰期一般為2周左右，有效期短暫，需要反復(fù)多次輸注。另外，NKT細(xì)胞本身缺少非特異性抗體，不足以在腫瘤周圍或者瘤巢中富集，制約了 NKT細(xì)胞對(duì)進(jìn)展期惡性腫瘤的靶向治療。
[0003]嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)是由抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域(配體或單鏈抗體)和胞內(nèi)的一系列信號(hào)結(jié)構(gòu)域依次連接而成，具體包括抗原特異性的受體(如單鏈抗體ScFv),間隔序列(spacer),跨膜序列(TM Domain)和胞內(nèi)共刺激信`號(hào)分子。在體內(nèi)CAR修飾的淋巴細(xì)胞能夠通過其單鏈抗體特異的識(shí)別相關(guān)腫瘤表面抗原，然后通過胞內(nèi)共刺激信號(hào)分子將識(shí)別的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，激活細(xì)胞的殺傷性，靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。
[0004]CD20單克隆抗體療法在治療B細(xì)胞淋巴瘤中已取得了令人滿意的效果，但是很多患者最終會(huì)產(chǎn)生耐藥性。⑶20分子是一種B細(xì)胞分化抗原，僅表達(dá)于前B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞表面，表達(dá)于95%以上的B細(xì)胞性淋巴瘤，而在造血干細(xì)胞、漿細(xì)胞和其他正常組織細(xì)胞中不表達(dá)。重要的是，CD20分子在膜上比較暴露，容易接近，與單克隆抗體結(jié)合后無顯著內(nèi)化及脫落，也不會(huì)因?yàn)榕c抗體的結(jié)合而發(fā)生抗原調(diào)變，故成為治療B細(xì)胞淋巴瘤的理想靶點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種的工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞及其制備方法，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞在制備用于治療腫瘤制劑中的應(yīng)用。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0007]一種工程化⑶20靶向性的NKT細(xì)胞，該細(xì)胞是嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ修飾的NKT細(xì)胞，該嵌合抗原受體由CD20ScFv、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3 ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成。
[0008]如上所述的工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞，優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的核苷酸序列如序列表中SEQID N0.2所示。
[0009]一種如上所述NKT細(xì)胞的制備方法，該方法包括以下步驟:通過RT-PCR從NKT細(xì)胞cDNA中分別擴(kuò)增⑶8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)，以及⑶137和⑶3 ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，酶切、膠回收后通過T4DNA連接酶連接到載體pWPT-GFP，構(gòu)建得到PWPT-ra8-rai37_ra3 ζ ；再通過全基因合成技術(shù)合成編碼大鼠生長激素信號(hào)肽和CD20ScFv的核苷酸序列，酶切、膠回收后克隆到pWPT-ra8-rai37-ra3 ζ，測序驗(yàn)證序列正確性，得到pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ ;然后包裝成攜帶 pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137_CD3 ζ 編碼基因的慢病毒；利用該慢病毒感染NKT細(xì)胞，使NKT細(xì)胞表達(dá)該嵌合抗原受體。
[0010]一種如上所述NKT細(xì)胞的制備方法，優(yōu)選地，該方法包括以下步驟:
[0011]1) NKT細(xì)胞的制備:分離靜脈血中的單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)獲得NKT細(xì)胞；
[0012]2)重組質(zhì)粒pWPT-CD8-CD137-CD3 ζ的構(gòu)建:以提取步驟I培養(yǎng)后NKT細(xì)胞cDNA為模板，利用引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得CD8基因的hinge區(qū)和跨膜區(qū)，核苷酸序列如序列表中SEQID N0.3所示，兩端分別含有MluI和Bgl II酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基；利用引物P3、P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得基因CD137胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，核苷酸序列如序列表中SEQID N0.4所示，兩端分別含有Bgl II和EcoRI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基；利用引物P5、P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增基因CD3 4的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，核苷酸序列如序列表中SEQID N0.5所示，兩端分別含有EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，將獲得的PCR產(chǎn)物電泳分離純化后分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后與Mlul/Sall雙酶切后的慢病毒表達(dá)載體pWPT-GFP通過T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Transl-TlPhage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞,感受態(tài)細(xì)胞大量培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pWPT-ra8-rai37-ra3 ζ ；
[0013]3)嵌合抗原受體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的構(gòu)建:將含有大鼠生長激素信號(hào)肽和CD20ScFv的質(zhì)粒pGS1-CD20ScFv進(jìn)行Bgl II /MluI雙酶切，回收DNA片段；其中，該大鼠生長激素信號(hào)肽核苷酸序列如序列表中SEQID N0.6, 5’端含有Bgl I1、kozak序列，該CD20ScFv核苷酸序列如序列表中SEQID N0.7，其3，端含有MluI酶切位點(diǎn)；將步驟2回收的重組質(zhì)粒pWPT-ra8-rai37-ra3 ζ進(jìn)行BamHI/MluI雙酶切，回收載體片段；將酶切后的DNA片段和質(zhì)粒載體片段連接后轉(zhuǎn)入Transl-TlPhage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞大量擴(kuò)增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒即為嵌合抗原受體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ ；
[0014]4)嵌合抗原受體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ修飾NKT細(xì)胞:慢病毒表達(dá)質(zhì)粒 pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 與輔助質(zhì)粒 psPAX2、pMD2.G 按 4:2:1 的質(zhì)量比共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h、72h時(shí)收集病毒上清，離心并用4.5 μ m濾器過濾，在濾液中添加1/4體積的5XPEG6000-NaCl進(jìn)行混勻，離心后棄上清，沉淀用4°C預(yù)冷的無菌PBS溶解，獲得病毒濃縮液；
[0015]5)嵌合抗原受體 pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 修飾 NKT 細(xì)胞:取I X 107-5 X IO7NKT細(xì)胞，棄掉舊的培養(yǎng)液，加入2-4mL新鮮GT-T551培養(yǎng)液，加入200-400 μ L步驟4)得到的病毒濃縮液、2-4 μ LI X 10_6單位魚精蛋白、終濃度為1000U/mLIL-2，置于37°C，5%C02孵箱中感染12-16小時(shí)后，棄培養(yǎng)液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)至未包被的培養(yǎng)瓶中，加入20-50mL的GT-T551培養(yǎng)基，于37°C，5%C02孵箱繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)8_15天后，感染獲得嵌合抗原受體⑶20ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ修飾的NKT細(xì)胞，該嵌合抗原受體的成熟蛋白氨基酸序列如序列表中SEQID N0.1所示。
[0016]如上所述工程化⑶20靶向性的制備方法，優(yōu)選地，所述步驟5)轉(zhuǎn)染后的NKT細(xì)胞用終濃度為1000U IL-2的GT-T551培養(yǎng)液進(jìn)行體外誘導(dǎo)，待細(xì)胞量占培養(yǎng)瓶80-90%時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)袋中，隔2天加入終濃度為1000U/mL IL-2的新鮮GT-T551培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，待細(xì)胞擴(kuò)增到IXlO9左右后，采用流式細(xì)胞儀對(duì)感染的細(xì)胞群體進(jìn)行鑒定。
[0017]一種工程化⑶20靶向性的NKT細(xì)胞，優(yōu)選地，該細(xì)胞是采用如上所述的方法制備的。
[0018]如上所述的工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞在制備用于治療腫瘤制劑中的應(yīng)用。
[0019]如上所述的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述腫瘤是指進(jìn)展期⑶20陽性惡性腫瘤。
[0020]本發(fā)明的研究者發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)展期⑶20陽性惡性腫瘤免疫治療中，工程化⑶20靶向性的NKT細(xì)胞比NKT細(xì)胞具有更突出的優(yōu)勢，包括特異的靶向性，CD20嵌合抗原受體依賴的腫瘤殺傷活性以及輸注后的長效性。工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞所擁有的這些特性，源于嵌合抗原受體的功能結(jié)構(gòu)，主要包含抗體識(shí)別區(qū)域以及細(xì)胞激活區(qū)域，抗體識(shí)別區(qū)域使工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞靶向于進(jìn)展期CD20陽性惡性腫瘤，另外，細(xì)胞內(nèi)激活區(qū)能延長細(xì)胞在患者體內(nèi)的存活時(shí)間?？梢姡こ袒疌D20靶向性的NKT細(xì)胞為治療進(jìn)展期CD20陽性惡性腫瘤提供一個(gè)新的選擇。
[0021]本發(fā)明的有 益效果在于:本發(fā)明的工程化⑶20靶向性的NKT細(xì)胞可特異性結(jié)合⑶20，在進(jìn)展期⑶20陽性惡性腫瘤治療中采用工程化⑶20靶向性的NKT細(xì)胞明顯的延長免疫細(xì)胞在患者體內(nèi)的存活時(shí)間，增強(qiáng)免疫細(xì)胞靶向識(shí)別腫瘤抗原的能力，加強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。此外，本發(fā)明通過優(yōu)化制備工藝，提供一種高效制備CD20靶向性NKT細(xì)胞的方法，該方法制備的NKT細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)染率，并可規(guī)?；a(chǎn)，具有良好的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為流式細(xì)胞術(shù)對(duì)分離培養(yǎng)的NKT細(xì)胞表型分析結(jié)果。
[0023]圖2為本發(fā)明所述慢病毒表達(dá)載體pWPT-CD8-CD137-CD3 ζ的限制性內(nèi)切酶MluI/SalI雙酶切片段電泳鑒定圖。
[0024]圖3為本發(fā)明所述嵌合抗原受體的慢病毒表達(dá)載體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的限制性內(nèi)切酶BamHI/Sal I雙酶切片段電泳鑒定圖。
[0025]圖4為本發(fā)明所述的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，逆時(shí)針序列為正向基因片度，順時(shí)針為反向基因片段。
[0026]圖5為流式細(xì)胞術(shù)檢測對(duì)CAR20-NKT細(xì)胞表型鑒定結(jié)果。
[0027]圖6為流式細(xì)胞術(shù)檢測含有CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的病毒濃縮液對(duì)NKT細(xì)胞的感染效率。
[0028]圖7 為 PT-PCR 檢測 CD20ScFv-CD8-CD137_CD3 ζ 在 NKT 細(xì)胞中的表達(dá)效率。
[0029]圖8為本發(fā)明所述的CAR20-NKT細(xì)胞對(duì)人腫瘤細(xì)胞的殺傷作用的細(xì)胞毒性分析圖。
[0030]圖9為本發(fā)明所述的CAR20-NKT細(xì)胞對(duì)⑶20陽性的B細(xì)胞惡性腫瘤患者的治療效果。
[0031]圖10為本發(fā)明所述的CAR20-NKT細(xì)胞治療前(上圖)與治療后I月CT的對(duì)比圖。
[0032]圖11為本發(fā)明所述的CAR20-NKT治療前后患者病變淋巴結(jié)增速圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0033]本發(fā)明提供一種工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞，它是在NKT細(xì)胞基礎(chǔ)上構(gòu)建而成的一種工程化細(xì)胞，是由嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ修飾的NKT細(xì)胞。嵌合抗原受體前體蛋白由信號(hào)肽、CD20ScFv、⑶8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、⑶137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和⑶3 ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成，蛋白質(zhì)翻譯后在細(xì)胞內(nèi)粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)切除信號(hào)肽后成為成熟嵌合抗原受體蛋白，分泌輸出后并定位于NKT細(xì)胞的細(xì)胞膜上。該嵌合抗原受體的成熟蛋白氨基酸序列如序列表中SEQID N0.1所示，其對(duì)應(yīng)的基因編碼序列如序列表中SEQID N0.2所示。該嵌合抗原受體特異地識(shí)別⑶20的胞外區(qū)LOOP環(huán)44個(gè)氨基酸的一段，其氨基酸序列如序列表中SEQID N0.8所示。該嵌合抗原受體以基因⑶8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及⑶137和⑶3 ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列如序列表中SEQID N0.9所示，其對(duì)應(yīng)的基因編碼序列如序列表中SEQID N0.10所不。
[0034]利用該嵌合抗原受體修飾的NKT細(xì)胞，能夠通過識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的CD20抗原，消除CD20抗原陽性的腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行腫瘤治療。
[0035]本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式是通過RT-PCR從人NKT細(xì)胞cDNA中分別擴(kuò)增⑶8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及⑶137和⑶3 ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，酶切、膠回收后通過T4DNA連接酶連接到載體pWPT-GFP，構(gòu)建得到pWPT-⑶8-⑶137-⑶3 ζ，再通過全基因合成技術(shù)合成編碼大鼠生長激素信號(hào)肽和CD20ScFv的核苷酸序列，酶切、膠回收后克隆到PWPT-CD8-CD137-CD3 ζ，測序驗(yàn)證序列正確性，得到 pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137_CD3 ζ。然后包裝成攜帶PWPT-⑶20ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ編碼基因的慢病毒。利用該慢病毒感染NKT細(xì)胞，使NKT細(xì)胞表達(dá)該嵌合抗原受體。通過細(xì)胞毒性分析實(shí)驗(yàn)證明該嵌合抗原受體修飾的NKT細(xì)胞對(duì)CD20陽性的腫瘤細(xì)胞具有特異殺傷作用。因此本發(fā)明所述的工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞可應(yīng)用于CD20陽性的腫瘤治療。
[0036]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以下所舉實(shí)施例是為便于更好地理解本發(fā)明，但并不用來限定本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明做各種修改或改動(dòng)，這些等價(jià)形式同樣落于本申請權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0037]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到。
[0038]本發(fā)明的實(shí)施例中所用的試劑如下:
[0039]GT-T551細(xì)胞培養(yǎng)基，TaKaRa公司
[0040]淋巴細(xì)胞分離液，TBD公司
[0041]NK 細(xì)胞培養(yǎng)基 GT-T551、CD3 單克隆抗體、retronectin，TAKORA 公司
[0042]重組人蛋白干擾素-Y、重組人白介素2，protech公司
[0043]總RNA 提取試劑盒 RNAi so Reagent、高保真 DNA 聚合酶(PrimeS I A R" HS DNAPolymerase)、T4DNA 連接酶，TaKaRa 公司
[0044]RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas 公司
[0045]Bgl I1、EcoR1、Mlu1、BamHI, Fermentas 公司
[0046]瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普 通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒,天根生化科技有限公司
[0047]pWPT-GFP, Addgene 公司
[0048]Transl-TlPhage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞,北京全式金生物技術(shù)有限公司
[0049]Lipofectamine?2000Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑，Invitrogen 公司
[0050]羧基熒光素琥珀酰亞胺酯，圣地亞哥，CA，USA
[0051]膜聯(lián)蛋白V-RPE試劑盒，南方生物技術(shù)，AL，USA
[0052]實(shí)施例1 NKT細(xì)胞的制備
[0053](I)取人靜脈血于含肝素的真空管中。采用淋巴細(xì)胞分離液，密度梯度離心方法分離獲得單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs )。
[0054](2) PBMCs洗三次后，采用含有0.6%常規(guī)血清的NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551調(diào)整細(xì)胞終濃度為2X IO6CelVmL ;將細(xì)胞接種于預(yù)先經(jīng)過終濃度為5 μ g/m!XD3單克隆抗體及終濃度為10 μ g/mL的retronectin (購自TAKORA公司)包被的75厘米細(xì)胞培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)基里加入終濃度為1000U/mL的重組人蛋白干擾素- Y和1000U/mL的重組人白介素2，37°C，飽和濕度為5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0055](3)第四天，向瓶中補(bǔ)加IOOmL含有0.6%常規(guī)血清的NKT細(xì)胞培養(yǎng)基，加入終濃度為1000U/mL的重組人白介素2。于37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，得到NKT細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)NKT細(xì)胞表型進(jìn)行分析。結(jié)果見圖1，其中CD3:98.76% ;CD3CD4:26.03% ;CD3CD8:68.65% ；CD3CD56:4.73% ;CD8CD56:3.33%。
[0056]實(shí)施例2:嵌合抗原受體(pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ )慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建`
[0057](I) NKT 細(xì)胞 cDNA 的制備
[0058]離心沉淀實(shí)施例1培養(yǎng)的NKT細(xì)胞，用總RNA提取試劑盒RNAiso Reagent提取細(xì)胞的總RNA，_80°C保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉目俁NA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAicTFirst Strand cDNASynthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄得NKT細(xì)胞cDNA, _20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0059](2)慢病毒質(zhì)粒 pWPT-CD8-CD137_CD3 4 的制備
[0060]所用引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，引物序列如下(其中，下劃線標(biāo)記為保護(hù)堿基，方框?yàn)槊盖形稽c(diǎn)):
[0061]Pl (SEQiDN0.1l) t GATC^CGCGT^TGAGCAACTCCATCATGTACTTC

M/ul
P2 CSEQID N0.12) ’.MIC^GATCiGCAGTAAAGGGTGATAACCAGTGA


Bg/ II
P3 (SEQ1DN0.13): GATCkGATCT^AACGGGGCAGAAAGAAACTCC


BgIII
P4 (SEQID N0.14); GA!CCiA \.l..1.(....(:AGTTCACATCCTCCTTCTTCTTCT


Ecoi?I
P5 (SEQID N0.1 5 ': GATdGAATTC^GAGTGAAGTrI ( \( iC A( r( i,\( i( (I

EcoRl
P6 ( SEQlD N0.16): GA TCbTCGAC|rTAGCGAOOGGGCAGGGC


Sail
[0062]以步驟(1)中NKT細(xì)胞cDNA為模板，用引物PU P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長287bp的⑶8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)，核苷酸序列如序列表中SEQID N0.3所示；兩端分別含有MluI和Bgl II酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，用引物P3、P4進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增長146bp的⑶137胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，核苷酸序列如序列表中SEQID N0.4所示，兩端分別含有Bgl II和EcoRI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基；用引物P5、P6進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增CD3 ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，核苷酸序列如序列表中SEQID N0.5所示，兩端分別含有EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。各步PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系相同，以擴(kuò)增CD137胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域?yàn)槔?，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件參照PrimeSTAR" HS DNA Polymerase 的說明書，反應(yīng)體系(50 μ L)如下:
[0063]雙蒸水:32.5yL
[0064]5 X 反應(yīng) buffer: 10 μ L
[0065]dNTP Mixture (2.5mM each):4 μ L
[0066]P3 (IOmM):1 μ L
[0067]P4 (IOmM):1 μ L
[0068]NKT 細(xì)胞 cDNA (200ng/ul):1 μ L
[0069]PrimeSTARi； HS DNA Polymerase:0.5 μ L
[0070]將上述PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行DNA片段回收。得到片段分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒回收備用。
[0071 ] 慢病毒表達(dá)載體pWPT-GFP用Mlul/SalI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收大的載體片段，然后與之前回收的CD8、CD137、CD3 ζ片段通過T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Transl-TlPhage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，37 °C培養(yǎng)16h后挑取單克隆，37 V，250rpm培養(yǎng)12h后質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶MluI和SalI雙酶切鑒定，鑒定電泳圖見圖2，其中，I泳道:DNA分子量標(biāo)記D2000 ；2泳道:質(zhì)粒pWPT-GFP的酶切片段(835bp) ；3泳道:質(zhì)粒pWPT-⑶8-⑶137-⑶3ζ的酶切片段(756bp)。將鑒定正確的質(zhì)粒送北京天一輝遠(yuǎn)科技有限公司對(duì)插入的融合基因片段進(jìn)行測序。將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為PWPT-CD8-CD137-CD3 ζ。
[0072](3)慢病毒質(zhì)粒 pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 的制備
[0073]全基因合成編碼大鼠生長激素信號(hào)肽和CD20ScFv的核苷酸序列，序列如序列表中SEQID N0.6所示，由天一輝遠(yuǎn)科技有限公司合成，其5’端含有Bgl I1、kozak序列，3’端含有MluI酶切位點(diǎn)，克隆在質(zhì)粒pGSI中，命名為pGS1-CD20ScFv。質(zhì)粒經(jīng)Bgl II /MluI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段備用。
[0074]pWPT-ra8-rai37-ra3 4質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI/MluI進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收載體片段備用。然后與回收的含有大鼠生長激素信號(hào)肽和⑶20ScFv的DNA片段通過T4DNA連接酶進(jìn)行連接，具體方法見說明書。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Transl-TlPhage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)16h后挑取單克隆，37°C，250rpm培養(yǎng)12h后，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI/MluI雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖3所示，其中，I泳道:DNA分子量標(biāo)記D15000 ；2泳道:質(zhì)粒pWPT-CD8-CD137-CD3 ζ的酶切片段(756bp);3泳道:質(zhì)粒pWPT-GFP的酶切片段(835bp) ；4 泳道:質(zhì)粒 pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 的酶切片段(1305bp)。將鑒定正確的質(zhì)粒送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司對(duì)插入的融合基因片段進(jìn)行測序。將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ，亦稱為CAR-CD20，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖4所示，其中包括信號(hào)肽、抗⑶20單鏈抗體、⑶8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及⑶137和CD3 4的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。
[0075]實(shí)施例3嵌合抗原受體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ修飾的NKT細(xì)胞的制
備`
[0076]( I)慢病毒的包裝和濃縮
[0077]用質(zhì)粒小提試劑盒分別提取慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ和輔助質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G。分光光度計(jì)測定質(zhì)粒濃度，三種質(zhì)粒以4:2:1的質(zhì)量比用Lipofectamine?2000Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞。分別在轉(zhuǎn)染48h、72h時(shí)收集病毒上清于EP管中，4°C，2000g離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清至新EP管中，用
4.5 μ m濾器過濾病毒上清；過濾的病毒上清與5XPEG6000-NaCl按照4:1的體積比混勻，4°C靜置2h，然后4°C，1000Og離心20min，棄上清，沉淀用4°C預(yù)冷的無菌PBS溶解，即得病毒濃縮液，進(jìn)行分裝，_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0078](2)慢病毒感染NKT細(xì)胞及感染后細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)
[0079]取實(shí)施例1在25cm2培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)的I X IO7NKT細(xì)胞，棄掉舊的培養(yǎng)液，加入2mL新鮮GT-T551培養(yǎng)液，200 μ L病毒液，2 μ LI X 10-6單位魚精蛋白，終濃度為1000U/mL IL-2,置于37°C，5%C02孵箱中感染12小時(shí)后，棄培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)置含GFP綠色熒光標(biāo)記的嵌合抗原受體病毒濃縮液對(duì)對(duì)照組NKT細(xì)胞進(jìn)行同步感染，用于計(jì)算該病毒的感染效率。將感染后的細(xì)胞轉(zhuǎn)至未包被的75cm2培養(yǎng)瓶中，加入20mL的培養(yǎng)基，于37°C，5%C02孵箱繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。該嵌合抗原受體病毒濃縮液對(duì)NKT細(xì)胞的感染效率，設(shè)置含GFP綠色熒光標(biāo)記的嵌合抗原受體病毒濃縮液對(duì)對(duì)照組NKT細(xì)胞進(jìn)行同步感染，用流式細(xì)胞術(shù)檢測并計(jì)算該病毒的感染效率，結(jié)果如圖6所示，感染效率為33.63%。
[0080](3)體外誘導(dǎo)擴(kuò)增成富含⑶3⑶56雙陽性的CAR20-NKT細(xì)胞群
[0081]將感染后的NKT細(xì)胞應(yīng)用含有終濃度為1000U/mL IL-2的GT-T551培養(yǎng)液對(duì)CART細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)、待細(xì)胞量占培養(yǎng)瓶80-90%時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)袋中，隔2天加入終濃度為1000U/mL IL-2的GT-T551培養(yǎng)液擴(kuò)增培養(yǎng)，待細(xì)胞擴(kuò)增到I X IO9左右后，采用流式細(xì)胞儀對(duì)感染的細(xì)胞群體進(jìn)行鑒定，細(xì)胞表型一般達(dá)到:⑶3陽性細(xì)胞比例> 90%;⑶3⑶8陽性細(xì)胞比例>70% ；CD3CD56雙陽性細(xì)胞比例>5%，結(jié)果見圖5，CD3:96.9%; CD3CD4:20.93%;CD3CD8:70.52%;CD3CD56:6.24%;CD8CD56:5.09%。
[0082](4)流式細(xì)胞術(shù)檢測嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ在NKT細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)
[0083]分別收集I X IO6 感染 pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ NKT 細(xì)胞(即 CAR20-NKT 細(xì)胞)及未感染病毒對(duì)照組細(xì)胞(ΝΚΤ)，用2%多聚甲醛固定，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR檢測基因的表達(dá)，檢測結(jié)果如圖7，圖中陽性參照物(陽參)指單獨(dú)pWPT-ra20ScFv-ra8-rai37-ra3 ζ重組質(zhì)粒；ΝΚΤ 為未感染 pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 重組質(zhì)粒的 NKT 細(xì)胞；CAR20_NKT 為感染pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ重組質(zhì)粒的NKT細(xì)胞。結(jié)果表明，嵌合抗原受體在NKT細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，該嵌合抗原受體的氨基酸序列如序列表中SEQID N0.1所示。
[0084]實(shí)施例4 CAR20-NKT細(xì)胞對(duì)人腫瘤細(xì)胞殺傷作用的細(xì)胞毒性分析
[0085]分別取實(shí)施例3中制備的CAR20-NKT細(xì)胞和實(shí)施例1中培養(yǎng)的NKT細(xì)胞接種于96孔板，用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)進(jìn)行染色，與Molt-4，K562，K562-CD20+和Reji細(xì)胞以1:1,5:1,10:1,20:1比率進(jìn)行共培養(yǎng)，經(jīng)過24小時(shí)的共培養(yǎng)后，將細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白V-RPE試劑盒染色。流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測，細(xì)胞死亡的量根據(jù)下面的公式計(jì)算:死亡率=(對(duì)照-樣品)/對(duì)照X 100%),對(duì)照為未加CAR20-NKT的腫瘤細(xì)胞；樣本為加入效靶比(殺傷細(xì)胞:靶細(xì)胞)為20:1的CAR20-NKT的腫瘤細(xì)胞，見圖8。嵌合抗原受體⑶20ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ修飾的NKT細(xì)胞對(duì)高表達(dá)⑶20的腫瘤細(xì)胞具有特異殺傷活性。
[0086]實(shí)施例5 CAR20-NKT細(xì)胞對(duì)⑶20陽性的惡性腫瘤患者的治療效果
[0087]取5Χ108個(gè)CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 4修飾的NKT淋巴細(xì)胞，連續(xù)三天靜脈回輸?shù)紺D20陽性的腫瘤患者體內(nèi)，治療一個(gè)月后進(jìn)行分析。
[0088]如圖9所示，免疫組化檢測工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)的歸巢情況，結(jié)果顯示，淋巴結(jié)活檢顯示靶向免疫細(xì)胞治療后大量CD3，CD20陽性細(xì)胞出現(xiàn)在腫瘤組織，說明CD20靶向性的NKT細(xì)胞能夠歸巢到病灶部位發(fā)揮殺傷作用。
[0089]如圖10所示，CT顯示工程化⑶20靶向性的NKT細(xì)胞對(duì)⑶20惡性腫瘤患者的治療效果，結(jié)果表明靶向免疫細(xì)胞治療前(上圖)與治療后I月CT (下圖)對(duì)比:腫大淋巴結(jié)縮小(具體見箭頭所示)。
[0090]如圖11所示，工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞治療后患者病變淋巴結(jié)增速較前明顯減慢，并于治療3周后，腫大淋巴結(jié)開始自行消退(圖中以腫大的鎖骨上淺表淋巴結(jié)最長經(jīng)為代表)。
【權(quán)利要求】
1.一種工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ修飾的NKT細(xì)胞，該嵌合抗原受體由CD20ScFv、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD 137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3 ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成。
2.如權(quán)利要求1所述的工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞，其特征在于，所述嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的核苷酸序列如序列表中SEQID N0.2所示。
3.—種如權(quán)利要求1所述NKT細(xì)胞的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟:通過RT-PCR從NKT細(xì)胞cDNA中分別擴(kuò)增⑶8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)，以及⑶137和⑶3 ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，酶切、膠回收后通過T4DNA連接酶連接到載體pWPT-GFP，構(gòu)建得到pWPT-ra8-rai37-ra3 ζ ;再通過全基因合成技術(shù)合成編碼大鼠生長激素信號(hào)肽和⑶20ScFv的核苷酸序列，酶切、膠回收后克隆到pWPT-ra8-rai37-ra3 ζ，測序驗(yàn)證序列正確性，得到pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ ;然后包裝成攜帶 pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137_CD3 ζ 編碼基因的慢病毒；利用該慢病毒感染NKT細(xì)胞，使NKT細(xì)胞表達(dá)該嵌合抗原受體。
4.一種如權(quán)利要求3所述NKT細(xì)胞的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 1)NKT細(xì)胞的制備:分離靜脈血中的單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)獲得NKT細(xì)胞； 2)重組質(zhì)粒pWPT-CD8-CD137-CD3ζ的構(gòu)建:以提取步驟I培養(yǎng)后NKT細(xì)胞cDNA為模板，利用引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得CD8基因的hinge區(qū)和跨膜區(qū)，核苷酸序列如序列表中SEQID N0.3所示，兩端分別含有MluI和Bgl II酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基；利用引物P3、P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得基因CD137胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，核苷酸序列如序列表中SEQID N0.4所示，兩端分別含有Bgl II和EcoRI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基；利用引物P5、P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增基因CD3 ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，核苷酸序列如序列表中SEQID N0.5所示，兩端分別含有EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，將獲得的PCR·產(chǎn)物電泳分離純化后分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后與Mlul/Sall雙酶切后的慢病毒表達(dá)載體pWPT-GFP通過T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Transl-TlPhage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞大量培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為PWPT-CD8-CD137-CD3 ζ ； 3)嵌合抗原受體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的構(gòu)建:將含有大鼠生長激素信號(hào)肽和CD20ScFv的質(zhì)粒pGS1-CD20ScFv進(jìn)行Bgl II /MluI雙酶切，回收DNA片段；其中，該大鼠生長激素信號(hào)肽核苷酸序列如序列表中SEQID N0.6，5’端含有Bgl I1、kozak序列，該CD20ScFv核苷酸序列如序列表中SEQID N0.7，其3，端含有MluI酶切位點(diǎn)；將步驟2回收的重組質(zhì)粒pWPT-ra8-rai37-ra3 ζ進(jìn)行BamHI/MluI雙酶切，回收載體片段；將酶切后的DNA片段和質(zhì)粒載體片段連接后轉(zhuǎn)入Transl-TlPhage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞大量擴(kuò)增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒即為嵌合抗原受體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ ； 4)嵌合抗原受體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾NKT細(xì)胞:慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 與輔助質(zhì)粒 psPAX2、口]\?2.6按4:2:1 的質(zhì)量比共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h、72h時(shí)收集病毒上清，離心并用4.5 μ m濾器過濾，在濾液中添加1/4體積的5XPEG6000-NaCl進(jìn)行混勻，離心后棄上清，沉淀用4°C預(yù)冷的無菌PBS溶解，獲得病毒濃縮液； 5)嵌合抗原受體pWPT-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 修飾 NKT 細(xì)胞:取I X 107-5 X IO7NKT細(xì)胞，棄掉舊的培養(yǎng)液，加入2-4mL新鮮GT-T551培養(yǎng)液，加入200-400 μ L步驟4)得到的病毒濃縮液、2-4 μ LI X 10_6單位魚精蛋白、終濃度為1000U/mLIL-2，置于37°C，5%C02孵箱中感染12-16小時(shí)后，棄培養(yǎng)液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)至未包被的培養(yǎng)瓶中，加入20-50mL的GT-T551培養(yǎng)基，于37°C，5%C02孵箱繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)8_15天后，感染獲得嵌合抗原受體⑶20ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ修飾的NKT細(xì)胞，該嵌合抗原受體的成熟蛋白氨基酸序列如序列表中SEQID N0.1所示。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟5)轉(zhuǎn)染后的NKT細(xì)胞用終濃度為1000U IL-2的GT-T551培養(yǎng)液進(jìn)行體外誘導(dǎo)，待細(xì)胞量占培養(yǎng)瓶80-90%時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)袋中，隔2天加入終濃度為1000U/mL IL-2的新鮮GT-T551培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，待細(xì)胞擴(kuò)增到IXlO9左右后，采用流式細(xì)胞儀對(duì)感染的細(xì)胞群體進(jìn)行鑒定。
6.一種工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是采用權(quán)利要求3-5中任意一項(xiàng)所述的方法制備的。
7.權(quán)利要求1或6所述的工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞在制備用于治療腫瘤制劑中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其`特征在于，所述腫瘤是指進(jìn)展期CD20陽性惡性腫瘤。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103820393SQ201410062069
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月24日
【發(fā)明者】韓為東, 韓慶旺, 王瑤, 付小兵 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院