干擾sirt1表達試劑在制備抑制肝癌干細胞干性轉(zhuǎn)錄因子表達的試劑中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于化學領域，具體公開了干擾SIRT1表達試劑在制備抑制肝癌干細胞干性轉(zhuǎn)錄因子表達的試劑中的應用，通過抑制肝癌干細胞中干性轉(zhuǎn)錄因子的表達，降低肝癌干細胞的增殖能力、克隆形成能力和成球能力，從而抑制肝癌干細胞的自我更新；因此可以將干擾SIRT1表達試劑用于制備靶向治療肝癌的藥物。
【專利說明】干擾SIRT1表達試劑在制備抑制肝癌干細胞干性轉(zhuǎn)錄因子表達的試劑中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于化學領域，特別涉及干擾SIRTl表達試劑在制備抑制肝癌干細胞干性轉(zhuǎn)錄因子表達的試劑中的應用。
【背景技術】
[0002]腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)是存在于腫瘤中的一小部分具有干細胞性質(zhì)的細胞群體，具有無限增殖、自我更新和多向分化潛能的細胞，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的根源。大量的研究表明，干細胞產(chǎn)生后通過本身固有的多能轉(zhuǎn)錄因子如0ct4，S0X2和Nanog調(diào)節(jié)外在的信號，從而使干細胞寄居在能夠維持“干性”特性的微環(huán)境(niche)中，進而維持自我更新能力，這些多能轉(zhuǎn)錄因子對于維持干細胞的潛在多能性和介導細胞增殖等作用具有至關重要的作用。研究證實，多能轉(zhuǎn)錄因子0ct4, S0X2和Nanog三者之間形成一個反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，活化并促進干細胞生長和自我更新，同時抑制分化基因的表達，但對于上述轉(zhuǎn)錄因子激發(fā)干細胞形成機制尚不明確。此外，研究發(fā)現(xiàn)多個蛋白編碼基因，它們的產(chǎn)物參與了腫瘤干細胞“干性”維持和腫瘤的發(fā)生。因此，研究這些基因與多能轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，對于研究腫瘤干細胞自我更新的作用機制具有重要的作用。
[0003]在細胞內(nèi)修飾組蛋白的酶類往往也是修飾轉(zhuǎn)錄因子的酶類，維持多能性的重要轉(zhuǎn)錄因子也受到翻譯后修飾的調(diào)控。去乙?；窼IRTl通過調(diào)芐基因的功能和轉(zhuǎn)錄從而決定細胞的命運，其調(diào)芐基因的功能和轉(zhuǎn)錄主要以表觀遺傳的方式調(diào)節(jié)組蛋白活性(主要是H4K16和H3K9位點)和乙酰化修飾調(diào)節(jié)非組蛋白的表達特別是一些關鍵的轉(zhuǎn)錄因子如p53，F(xiàn)OXO, c-MYC, HIFl a、HIF2 α等。新近研究發(fā)現(xiàn)，SIRTl在維持鼠胚胎干細胞(ESC)和人胚胎干細胞(HSC)自我更新作用中具有重要的作用。SIRTl通過乙?；饔糜讦?3，從而調(diào)節(jié)干細胞的多能轉(zhuǎn)錄因子Nanog、0ct4和S0X2的表達。在人和鼠造血干細胞中，SIRTl可通過能量代謝的改變調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，`進而維持造血干細胞的自我更新。然而，關于SIRTl在實體腫瘤干細胞中調(diào)節(jié)多能轉(zhuǎn)錄因子維持干細胞自我更新的作用尚未見文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供干擾SIRTl表達試劑的新用途，為肝癌的靶向
治療具有重要意義。
[0005]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術方案:
[0006]干擾SIRTl表達試劑在制備抑制肝癌干細胞干性轉(zhuǎn)錄因子表達的試劑中的應用。
[0007]優(yōu)選的，所述干擾SIRTl表達試劑為干擾SIRTl表達的慢病毒或Tenovin-6。
[0008]更優(yōu)選的，所述Tenovin-6的濃度為2.5~10 μ M。
[0009]優(yōu)選的，所述干擾SIRTl表達的慢病毒由Lv-sh-SIRTl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后，經(jīng)包裝、純化而得。
[0010]優(yōu)選的，所述干性轉(zhuǎn)錄因子為S0X2、0ct4、C-MyC或Nanog。[0011]優(yōu)選的，所述干性轉(zhuǎn)錄因子為S0X2或Nanog。
[0012]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明公開了干擾SIRTl表達試劑在制備抑制肝癌干細胞干性轉(zhuǎn)錄因子表達的試劑中的應用，通過抑制肝癌肝細胞中干性轉(zhuǎn)錄因子，從而抑制肝癌干細胞的增殖、克隆形成、成球能力以及皮下移植瘤形成率，延緩體內(nèi)腫瘤生長，抑制肝癌干細胞的自我更新。因此可以將干擾SIRTl表達試劑用于靶向治療肝癌，對延長肝癌生存時間具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]為了使本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
[0014]圖1為干擾SIRTl表達后檢測各干性轉(zhuǎn)錄因子的表達。
[0015]圖2為干擾SIRTl表達后不同時間檢測干性轉(zhuǎn)錄因子的表達。
[0016]圖3為不同濃度TV-6處理細胞檢測Nanog和S0X2的表達。
[0017]圖4為5 μ M TV-6處理肝癌干細胞后不同時間點檢測Nanog、S0X2的表達。
[0018]圖5為在肝癌組織和肝癌細胞系中SIRTl與S0X2的表達。
[0019]圖6為干擾SIRTl過表達S0X2的蛋白表達情況(A:western-blot檢測；B:免疫熒光檢測)。
[0020]圖7為干擾SIRTl過 表達S0X2對肝癌干細胞克隆形成和成球能力的影響。
[0021]圖8為干擾SIRTl過表達S0X2對N0D/SCID小鼠移植瘤的影響(A:移植瘤觀察結果:移植瘤的重量和體積)。
[0022]圖9為免疫熒光和免疫組化分別檢測移植瘤中GFP或SIRTl和S0X2的表達。
[0023]圖10為NanogP°s的肝癌干細胞中干擾SIRTl再過表達S0X2影響Nanog的表達(A:western-blot檢測在Nanogp°s的肝癌干細胞中干擾SIRTl再過表達S0X2的細胞中GFP的表達；B:western-blot檢測在干擾SIRTl再過表達S0X2的移植瘤中GFP的表達)。
[0024]圖11為在NanogP°s的肝癌干細胞中干擾SIRTl再過表達S0X2的細胞中用螢光素酶報告系統(tǒng)中檢測Nanog啟動子的表達變化。
[0025]圖12為NanogP°s的肝癌干細胞中干擾SIRTl再過表達S0X2的細胞通過CHIP檢測S0X2結合Nanog的表達。
【具體實施方式】
[0026]下面將結合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，Shan et al.2012, hepatology, 56:1014-1014所述的條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0027]本發(fā)明使用的肝癌干細胞模型由本實驗室構建，該模型含有Nanog啟動子調(diào)控GFP報告基因構建的慢病毒表達載體(Nanog/GFP報告系統(tǒng))，其構建方法參見Shan etal.2012, hepatology, 56:1014-1014 ；Lv-sh-ScrambIe 質(zhì)粒和 Lv-sh-SIRTl 質(zhì)粒、AD-GFP由本實驗室構建，具體參見 Shan et al.2012，hepatology, 56:1014-1014 ；HEK293 細胞由本實驗室保存。AD-SIRTl由朱衛(wèi)國教授惠贈，其構建方法見Liu et al.2011，Proc NatlAcad Sci USA.108:1925-1930。[0028]人原發(fā)性肝癌細胞系PLC/PRF/5和肝癌細胞系Huh7購自中國科學院上海細胞所；抗SIRTl抗體購自美國Santa Cruz公司，抗Albumin抗體購自美國Abcam公司。Envision?和DAB顯色液購自丹麥DAKO公司；pNAN0G-Luc和Lv_0ver_S0X2質(zhì)粒購自美國Addgene公司；轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國QIGEN公司；S0X2抗體和CHIP級別兔抗人S0X2購自美國Milliopore 公司。
[0029]TV-6 (Tenovin-6)溶液的配置:使用DMSO溶解TV-6干粉分別配置成20 μ M的儲存液，待處理細胞時使用完全培養(yǎng)基配置成0.5 μ Μ、2.5 μ Μ、5.0 μ Μ、7.5 μ M和10 μ M的工作液。
[0030]實施例1
[0031]一、SIRTl的表達影響“干性” 轉(zhuǎn)錄因子S0X2的表達
[0032]取人原發(fā)性肝癌細胞系PLC/PRF/5、肝癌細胞系Huh7和肝癌細胞T1224，用流式細胞儀分別分選Nanog陽性肝癌干細胞(記為NanogP°s)和Nanog陰性非肝癌干細胞(記為NanogNeg)。
[0033]慢病毒Lv-sh-SIRTl和Lv-sh-Scramble的包裝:在IOcm的培養(yǎng)皿中鋪2~5 X IO6個293T細胞(最好是20代之前的，細胞的狀態(tài)必需良好，生長速度較快，否則對病毒產(chǎn)量影響很大)，培養(yǎng)液含10%FBS的DMEM (v/v)，待細胞匯合至70%時，換新鮮的含10%FBS的DMEM (v/v)培養(yǎng)液，3-4h后用于轉(zhuǎn)染。
[0034]取15-20 μ g的Lvsh-SIRTl或Lv-sh-Scramble慢病毒表達質(zhì)粒，分別滴加50μ L2.5Μ的CaCl2混勻，向混合液中分別加入無菌水至總體積450 μ L，混勻后加入500 μ L2XHBS緩沖液(2XHBS緩沖液使用前于渦旋振蕩器上震蕩)，然后置于渦旋振蕩器上震蕩IOs以上，滴加結束后，繼續(xù)震蕩，室溫放置5分鐘后，將液體加入培養(yǎng)的293Τ中，加完后前后左右晃動混勻，加入后6-12小時換新鮮的10%FBS的DMEM (v/v)培養(yǎng)液。
[0035]慢病毒Lv-sh-SIRTl和Lv-sh-Scramble的收集和純化:自轉(zhuǎn)染開始后48小時、72小時各收集一次細胞培養(yǎng)液，48小時收集后，再補充15mL的培養(yǎng)液，將收集的病毒在1000rpm條件下離心IOmin去除細胞碎片，收集上清，并用0.45 μ m的濾膜過濾,濾液轉(zhuǎn)移A Millopore的濃縮柱,在5000rpm離心至上層凹槽內(nèi)的液體體積濃縮至ImL(可分多次加入)。將濃縮液分裝，置于-80°C低溫冰箱保存。
[0036]在NanogP°s 的肝癌干細胞感染 Lv-shRNA-SIRTl 或 Lv-shRNA-Scramble 慢病毒:取人原發(fā)性肝癌細胞系PLC/PRF/5、肝癌細胞系Huh7和肝癌細胞T1224，通過流式細胞儀分選Nanogpt5s的肝癌干細胞，然后接種在6孔板內(nèi)，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞長至5X IO5時，吸出孔內(nèi)液體，加ImL的10%FBS/DMEM (v/v)培養(yǎng)液，然后每孔以10個MOI值，加入Lv-shRNA-SIRTl或Lv-shRNA-Scramble慢病毒，空白對照組不加入慢病毒，再于37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6-8小時后，吸出孔內(nèi)液體，加2mL的10%FBS/DMEM培養(yǎng)液，72h后，檢測Nanogpos細胞中干性轉(zhuǎn)錄因子S0X2、Nanog、0ct4和c_Myc的表達情況,檢測結果如圖1所示。結果顯示，干擾SIRTl表達后，S0X2下調(diào)的趨勢最顯著，其次為Nanog和0ct4，而c_Myc下調(diào)不明顯。
[0037]按照相同的方法將Lv-shRNA-SIRTl慢病毒感染PLC/PRF/5的NanogP°s細胞，分別于感染后O小時、12小時、24小時和36小時收集細胞，檢測Nanogpt5s細胞干性轉(zhuǎn)錄因子S0X2、Nanog、0ct4和c_Myc的表達情況，結果如圖2所示。結果顯示，在干擾SIRTl表達24h時，S0X2蛋白表達顯著性地下調(diào)；干擾SIRTl表達36h時，c_Myc蛋白的表達顯著下調(diào)，而Nanog、0ct4蛋白表達隨時間變化不明顯。
[0038]將分選的PLC/PRF/5NanogP°s和Huh7NanogP°s分別種植在6孔板內(nèi)，待細胞長至80%左右，分別滴加濃度為0.0 μ M、0.5 μ M、2.5 μ M、5.0 μ M、7.5 μ M、10 μ M的TV-6培養(yǎng)48小時后，然后收集蛋白利用western-blot方法檢測S0X2和Nanog的表達，同時以GAPDF為內(nèi)參，檢測結果如圖3所示。結果顯示，在加SIRTl的抑制劑TV-6后，5μΜ的TV-6作用對肝癌干細胞中S0X2蛋白的下調(diào)顯著。
[0039]將分選的PLC/PRF/5NanogP°s種植在6孔板內(nèi)，待細胞長至80%左右，滴加濃度為
5.(^]?的17-6，分別收集滴加后011、411、811、1211、2411和 36h 的蛋白，western-blot檢測 S0X2和Nanog的表達，同時以GAPDF為內(nèi)參，其結果如圖4所示。結果顯示，5.0 μ M的TV-6作用4小時后S0X2蛋白的表達量急劇下降，而Nanog蛋白在5.0 μ M的TV-6作用36小時后表達量才出現(xiàn)下降。
[0040]上述結果顯示，在肝癌干細胞中，干擾SIRTl的表達不但能顯著抑制S0X2的表達，而且是早期發(fā)生事件。
[0041]二、檢測肝癌細胞系和臨床肝癌組織樣本中SIRTl和S0X2蛋白表達的相關性
[0042]取6例肝癌細胞系和22例臨床肝癌組織樣本，通過Western blot檢測SIRTl與S0X2的表達量,然后計 算Person值，結果如圖5所示。結果顯示,在6例肝癌細胞系中，SIRTl與S0X2的相關性即Person值為0.708 ;在22例臨床肝癌樣本中，其Person值為
0.825，表明SIRTl與Sox2具有著正相關性。上述結果表明在肝癌干細胞中，SIRTl可能通過激活S0X2的表達進而維持肝癌干細胞自我更新。
[0043]實施例2
[0044]一、在肝癌干細胞中干擾SIRTl同時過S0X2對克隆形成、成球以及成瘤能力的影響
[0045]為明確在S0X2在SIRTl調(diào)控肝癌干細胞自我更新過程中的關鍵作用，將分選的Huh7NanogPos感染慢病毒Lv-sh-SIRTl的同時，轉(zhuǎn)染Lv-0ver-S0X2慢病毒(其制備方法與慢病毒Lv-sh-SIRTl相同)，在共同作用24h、48h、72h后，檢測SIRTl和S0X2蛋白的表達量，然后通過免疫熒光檢測共同作用48h后SIRTl和S0X2蛋白的表達情況，結果如圖6所示。由圖6可知，在干擾SIRTl同時過表達S0X2共同作用48h時，S0X2的蛋白表達呈增加的趨勢。
[0046]然后在Lv-sh-SIRTl慢病毒和LV-0Ver-S0X2慢病毒共同作用72h后觀察肝癌干細胞的克隆形成能力和成球能力，結果如圖7所示。結果顯示，與對照組相比，在干擾SIRTl同時過表達S0X2，其克隆形成(p=0.0009)和成球形成呈顯著性增加(p=0.0054)，具有顯著
性差異。
[0047]二、在肝癌干細胞中干擾SIRTl同時過表達S0X2對移植瘤成瘤能力的影響
[0048]在N0D/SCID鼠體內(nèi)進行皮下分別注射I X IO6數(shù)量的control (只轉(zhuǎn)染慢病毒，不含表達質(zhì)粒)、shSIRTl (干擾SIRT1)以及shSIRT+S0X2 (干擾SIRTl同時過表達S0X2)的PLC/PRF/5Nanog陽性肝癌干細胞，每只注射I X IO6細胞數(shù)，分10個點注射，待四周后，處死小鼠，剝離腫瘤，觀察其成瘤情況，然后統(tǒng)計腫瘤的重量和體積，結果如圖8所示。結果顯示，control 組成瘤率為 100% (10/10)，shSIRTl 組成瘤率為 60.0% (6/10)，shSIRT+S0X2組成瘤率為83%(10/12);相比shSIRTl組，shSIRT+SOX2組其移植瘤瘤體重量和植移瘤體積呈顯著上升。然后將移植瘤用石蠟包埋并切片，經(jīng)免疫組化染色后用激光共聚焦顯微鏡觀察。具體方法為:將固定的NOD/SCID鼠皮下移植瘤，脫水并用石蠟包埋，H&E染色并連續(xù)切片，每張4-5 μ m厚，用免疫組化玻片裱片，常溫放置備用，然后將切片用烤片儀烘烤切片20min,放入二甲苯中，脫蠟10-20min，再用體積分數(shù)為70%_100%梯度酒精水化，蒸餾水漂洗切片3次，每次5min，接著將切片置于由41mL檸檬酸和9mL檸檬酸鈉并定容至為500mL的pH為6.0的枸櫞酸鈉溶液中，在800W條件下微波修復3.30min至溶液沸騰后，再在150W條件下16min維持沸騰狀態(tài)，修復完畢后至冷水中冷卻至室溫，蒸餾水漂洗切片3次，每次5min，然后按50 μ L/片滴加質(zhì)量分數(shù)3%的H2O2溶液，37°C孵育20min，用雙蒸水漂洗5min后，再用PBS漂洗切片2次，每次5min ;用滴加1:300 (v/v)稀釋的兔抗SIRTl抗體，4°C孵育過夜；次日取出用PBS漂洗切片3次，每次5min，然后按50 μ L/片滴加EnVision? 二抗，37°C孵育30min，PBS漂洗切片3次，每次5min，漂洗后滴加DAB顯色液，自來水終止反應，接著用蘇木素襯染45s，鹽酸酒精分化，自來水沖洗、藍化，最后用體積分數(shù)70%-100%梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，結果如圖9所示。結果顯示，相比shSIRTl組，過表達S0X2組的GFP表達呈顯著性增強，免疫組織化學方法同樣表明在移植瘤中過表達S0X2能增加S0X2的表達。以上結果顯示，不管在體內(nèi)或體外，過表達S0X2不但能恢復干擾SIRTl后對肝癌干細胞的克隆形成、成球能力，而且也能增加成瘤能力。因此，干細胞轉(zhuǎn)錄因子S0X2在SIRTl維持肝癌干細胞自我更新的作用中發(fā)揮著關鍵的作用。
[0049]實施例3
[0050]一、在肝癌干細胞和移植瘤中干擾SIRTl同時過表達S0X2影響Nanog的表達
[0051]在實施例1的研究發(fā)現(xiàn),干擾SIRTl不僅能下調(diào)S0X2的表達,而且也能下調(diào)Nanog的表達。為了進一步研究SIRTl在維持肝癌干細胞自我更新過程中Nanog所起的作用，首先在肝癌干細胞中檢測干擾SIRTl過表達S0X2后能否恢復Nanog表達，具體為，control(只轉(zhuǎn)染慢病毒，不含表達質(zhì)粒)、shSIRTl (干擾SIRT1)以及shSIRT+S0X2 (干擾SIRTl同時過表達S0X2)的PLC/PRF`/5Nanog和Huh7Nanogp°s陽性肝癌干細胞中轉(zhuǎn)染，以GAPD為內(nèi)參，結果如圖10中A所示。結果顯示，在干擾SIRTl同時過表達S0X2能顯著促進GFP的表達上調(diào)。將干擾SIRTl同時過表達S0X2的肝癌干細胞移植至N0D/SCID小鼠皮下，每只注射I X IO6細胞數(shù)，分10個點注射，待四周后，處死小鼠，然后檢測移植瘤中GFP的表達量，并以GAPD為內(nèi)參，結構如圖10中B所示。結果顯示，在干擾SIRTl同時過表達S0X2的NOD/SCID小鼠移植瘤組織中檢測也證實了體外的結果，即促進了 Nanog或GFP的表達。這些結果表明了，在肝癌干細胞中，Nanog在SIRTl維持肝癌干細胞自我更新作用中同樣占有重要地位。
[0052]二、在肝癌干細胞，干擾SIRTl同時過表達S0X2影響Nanog啟動子活性
[0053]多能轉(zhuǎn)錄因子0ct4，S0X2和Nanog是調(diào)節(jié)與干細胞有關的一系列基因表達的重要轉(zhuǎn)錄因子。為了進一步研究Nanog在SIRTl維持肝癌干細胞自我更新的作用，將流式細胞儀分選的Nanogpt5s細胞種植在6孔板內(nèi)，待細胞長至60%左右，分別感染Lv-shRNA-SIRTl和Lv-0ver-S0X2，然后在37°C、5%C02的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)36h，消化、離心細胞，并種植在24孔板培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法為依次向細胞中加入加入PBS，熒光素酶報告基因載體PGL31.Ομ g，內(nèi)參質(zhì)粒Renillia0.5 μ g，共計50 μ L，然后于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48h后使用Dual-1uciferase報告基因檢測系統(tǒng)(購自美國Promega公司)檢測報告基因活性和檢測Nanog啟動子活性，檢測方法參見說明書進行，檢測結果如圖11所示。結果顯示，在干擾SIRTl同時過表達S0X2的情況下，熒光素酶活性增強，表明Nanog啟動子活性增強。然后設計Nanog引物，利用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術檢測(試劑盒美國Promega公司)S0X2結合到Nanog啟動子區(qū)的能力，檢測方法按試劑盒說明書進行，引物的具體序列為:Nanogl:上游引物:gggatagacaagaaaccaaac (SEQ ID N0.1);下游引物:caactagctccattttcctc (SEQ ID N0.2) ；Nanog2:上游引物:cggcctcccaatttactg(SEQ ID N0.3);下游引物:tctaggttcaccacgtttc (SEQ ID N0.4) ;Nanog3:上游引物:tggaaacgtggtgaacctag (SEQ ID N0.δ);下游引物:agtctcaccaaggccattg (SEQ ID N0.6)
[0054]然后進行結果分析，
[0055](I)首先標準化 DNA 的量(Normalize DNA)
[0056]Δ Ctfnormalized CHIP]=Ct[chIP]-(Ct[Input]-Lg(2X Input Diluttion Factor))
[0057]Input Dilution Factor=(fraction of the input control chromationsaved) 1
[0058](2)計算ChIP樣品中的DNA片段占Input Control中的百分比0/o
[0059]Input=2 (_Act[normalized CHIP])
[0060]分析結果如圖12所示。結果顯示，干擾SIRTl的表達能夠降低S0X2結合到Nanog啟動子區(qū)的能力；相應地過表達S0X2后可顯著增強S0X2結合到Nanog啟動子區(qū)的能力。[0061 ] 以上結果表明，在肝癌干細胞中，SIRTl通過維持S0X2表達從而增強其對Nanog的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進而維持肝癌干細胞自我更新的特性。但是，SIRTl在肝癌干細胞中如何調(diào)節(jié)S0X2的表達及其分子機制仍不清楚。
`[0062]最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權利要求書所限定的范圍。
【權利要求】
1.干擾SIRTl表達試劑在制備抑制肝癌干細胞干性轉(zhuǎn)錄因子表達的試劑中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于:所述干擾SIRTl表達試劑為干擾SIRTl表達的慢病毒或Tenovin-6。
3.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于:所述Tenovin-6的濃度為2.5~10 μ M。
4.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于:所述干擾SIRTl表達的慢病毒由Lv-sh-SIRTl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后，經(jīng)包裝、純化而得。
5.根據(jù)權利要求1-4任一項所述的應用，其特征在于:所述干性轉(zhuǎn)錄因子為SOX2、0ct4、c-Myc 或 Nanog。
6. 根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于:所述干性轉(zhuǎn)錄因子為S0X2或Nanog。
【文檔編號】A61P35/00GK103751806SQ201410032609
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權日:2014年1月23日
【發(fā)明者】錢程, 劉麗梅, 劉春剛, 沈俊杰, 單娟娟 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院