對(duì)cars的抗腫瘤活性的毒性管理的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于治療患者中的癌癥的組合物和方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法包括第一線治療，該第一線治療包括給予對(duì)其有需要的患者表達(dá)CAR的遺傳修飾的T細(xì)胞，其中CAR包括抗原結(jié)合域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號(hào)傳遞區(qū)、和CD3ζ信號(hào)傳導(dǎo)域，并且監(jiān)測(cè)T細(xì)胞輸注后患者中的細(xì)胞因子水平，以根據(jù)患者中CAR T細(xì)胞的存在的結(jié)果，確定適合治療患者的第二線治療的類型。
【專利說(shuō)明】對(duì)CARS的抗腫瘤活性的毒性管理
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年7月13日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/671，482和2013年 3月14日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/782, 982的優(yōu)先權(quán)，各案通過(guò)引用以其全文并入于 此。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 患有復(fù)發(fā)的并且化療難治的急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL)的患者具有不良的預(yù) 后，盡管使用了積極治療，例如異源造血干細(xì)胞移植（Barrett (巴雷特）等人，N Engl J Med(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志）331:1253-8 ;Gokbuget (格克比蓋特）等人，2012, Blood(血 液）120:2032-41)和雙特異性CD19抗體片段（Bargou(巴戈）等人，2008, Science (科 學(xué)）321:974-7)。已經(jīng)報(bào)道，在患有CLL和B細(xì)胞淋巴瘤的成年人中，靶向種系特異性抗原 CD19和CD20的嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞是有效的（Till (提爾）等人，2008, Blood (血 液）112:2261-71 ;Kochenderfer(考琴德佛）等人，2010, Blood(血液）116:4099-102 ; Brentjens (布倫蒂安斯）等人，2011，Blood(血液）118:4817-28 ;Porter (波特）等人， 2011，N Engl J Med(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志）365:725-33 ;Kalos(卡洛斯）等人，2011，Science Translational Medicine (科學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)）3:95ra73;Savoldo (薩沃爾托）等人，2011，J Clin Invest(臨床研宄雜志）121:1822-5)。然而，仍未充分研宄，CAR T細(xì)胞對(duì)ALL母細(xì) 胞，一種具有更快速進(jìn)展的更不成熟的白血病的作用。
[0005] 已經(jīng)報(bào)道，腫瘤溶解綜合征的延遲發(fā)作和細(xì)胞因子分泌，與有力的體內(nèi)嵌合抗 原受體T細(xì)胞擴(kuò)張組合（Porter (波特）等人，2011，N Engl J Med(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜 志）365:725-33 ;Kalos(卡洛斯）等人，2011，Science Translational Medicine(科學(xué)轉(zhuǎn) 化醫(yī)學(xué)）3:95ra73)。然而，仍未充分研宄，細(xì)胞因子分泌的作用和與體內(nèi)嵌合抗原受體T細(xì) 胞擴(kuò)張關(guān)聯(lián)的失調(diào)。
[0006] 因此，在本領(lǐng)域中，對(duì)用于使用CAR治療癌癥并且解決CAR的毒性的組合物和方法 存在迫切需要。本發(fā)明解決了這一需要。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明提供了治療患有與提尚的腫瘤抗原表達(dá)關(guān)聯(lián)的疾病、失調(diào)或病癥的患者的 方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法包括給予對(duì)其有需要的患者第一線治療和第二線治療，其 中該第一線治療包括給予患者有效量的遺傳修飾以表達(dá)CAR的細(xì)胞，其中CAR包括抗原結(jié) 合域、跨膜結(jié)構(gòu)域、和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域。
[0009] 在一個(gè)實(shí)施方式中，在給予第一線治療后，監(jiān)測(cè)患者中的細(xì)胞因子水平，以確定待 給予至患者的第二線治療的適當(dāng)類型，并且給予對(duì)其有需要的患者適當(dāng)?shù)牡诙€治療。
[0010] 在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞因子水平的增加鑒定待給予至對(duì)其有需要的患者的細(xì)胞 因子抑制治療的類型。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞因子選自 IL-I 0、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、 IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-IRa、IL-2R、IFN-a、IFN-y、MIP-I a、MIP-I 0、MCP-1、 TNFa、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、CXCR 因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、EGF、HGF、FGF-0、 ⑶40、⑶40L、鐵蛋白、以及它們的任何組合。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞因子抑制治療選自小干擾RNA(SiRNA)、微RNA、反義核 酸、核酶、編碼反式顯性負(fù)性突變體的表達(dá)載體、抗體、肽、小分子、細(xì)胞因子抑制藥物、以及 它們的任何組合。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)檢測(cè)來(lái)自患者的生物樣品中的細(xì)胞因子的蛋白水平來(lái)監(jiān) 測(cè)細(xì)胞因子水平。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)檢測(cè)來(lái)自患者的生物樣品中的細(xì)胞因子的核酸水平來(lái)監(jiān) 測(cè)細(xì)胞因子水平。
[0015] 本發(fā)明提供了減少或避免與給予遺傳修飾以表達(dá)CAR的細(xì)胞關(guān)聯(lián)的不良作用的 方法，其中CAR包括抗原結(jié)合域、跨膜結(jié)構(gòu)域、以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域，該方法包括監(jiān)測(cè)患 者中細(xì)胞因子的水平以確定待給予至患者的細(xì)胞因子治療的適當(dāng)類型并且給予適當(dāng)?shù)募?xì) 胞因子治療至患者。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞因子水平的增加鑒定待給予至患者的細(xì)胞因子抑制治療 的類型。
[0017] 在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞因子選自 IL-I 0、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、 IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-IRa、IL-2R、IFN-a、IFN-y、MIP-I a、MIP-I 0、MCP-1、 TNFa、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、CXCR 因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、EGF、HGF、FGF-0、 ⑶40、⑶40L、鐵蛋白、以及它們的任何組合。
[0018] 在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞因子抑制治療選自小干擾RNA(SiRNA)、微RNA、反義核 酸、核酶、編碼反式顯性負(fù)性突變體的表達(dá)載體、細(xì)胞內(nèi)抗體、肽、小分子、細(xì)胞因子抑制藥 物、以及它們的任何組合。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)檢測(cè)來(lái)自患者的生物樣品中的細(xì)胞因子的蛋白水平來(lái)監(jiān) 測(cè)細(xì)胞因子水平。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)檢測(cè)來(lái)自患者的生物樣品中的細(xì)胞因子的核酸水平來(lái)監(jiān) 測(cè)細(xì)胞因子水平。
[0021] 附圖簡(jiǎn)述
[0022] 當(dāng)結(jié)合附圖進(jìn)行閱讀時(shí)，將更好地理解本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的以下詳細(xì)說(shuō)明。 出于說(shuō)明本發(fā)明的目的，在附圖中示出的是目前優(yōu)選的實(shí)施方式。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，本 發(fā)明并不局限于附圖中示出的實(shí)施方式的精確安排和機(jī)構(gòu)。
[0023] 圖1是證明四個(gè)不同患者中的血清細(xì)胞因子水平的圖。所有的患者顯示細(xì)胞因子 釋放，包括IL-6。
[0024] 圖2是描繪了代表性患者中標(biāo)繪的的血清細(xì)胞因子的圖?；颊咴诘?至7天病危， 并且僅在塔西單抗給予之后開始改善。
[0025] 圖3是如對(duì)T細(xì)胞活性標(biāo)記（穿孔素和IFN- y )進(jìn)行測(cè)量，證明抗體干預(yù)并不影 響CART 19細(xì)胞功能性的圖。
[0026] 圖4,包括圖4A直至4C，是描繪了臨床反應(yīng)的一系列圖。圖4A示出了用CTL019 細(xì)胞治療的、在第〇天輸注的患有多次復(fù)發(fā)的化療難治的CD19+B細(xì)胞前體急性成淋巴細(xì) 胞白血病的兩個(gè)兒童。在CTL019輸注后，血清乳酸脫氫酶（LDH)和體溫的改變，其中用 圓圈區(qū)分每24小時(shí)時(shí)期的最高溫度。給予CH0P-100,在第5天以2mg/kg/天開始甲潑 尼龍，在第12天之前逐漸變少至消失。在第7天早晨，給予依那西普0.8mg/kg x 1。在 第7天晚上6pm，給予塔西單抗8mg/kg X 1。在CHOP-IOO中，在第5天給予皮質(zhì)激素下， 發(fā)生發(fā)熱的短暫改善，其中在第8天，在給予由依那西普和塔西單抗組成的細(xì)胞因子定向 治療后，發(fā)生發(fā)熱的完全解決。圖4B示出了在CTL019輸注后，在頻繁的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量的 血清細(xì)胞因子和炎癥標(biāo)記。使用具有來(lái)自基線的倍數(shù)變化的半對(duì)數(shù)圖示出了細(xì)胞因子 值。針對(duì)每個(gè)分析物的基線（輸注之前的第0天）值（pg/ml血清）為（CH0P-100, CHOP- 101) :ILl-0 : (0. 9, 0. 2) ；IL-6: (4. 3, I. 9) ；TNF-a ： (I. 5, 0. 4) ；IL2Ra ： (418. 8, 205. 7)； IL-2: (0. 7,0. 4) ;IL-10(9. 9,2. 3) ;ILlRa : (43. 9,27. 9)。兩個(gè)患者在多個(gè)細(xì)胞因子和細(xì) 胞因子受體--包括可溶白細(xì)胞介素 IA和2受體（IL-1RA和IL-2R)，白細(xì)胞介素2、6和 !?(〖!^、〖!^和幾-⑴沁腫瘤壞死因子"汀即^沁和干擾素-丫丨預(yù)?-^--方面出現(xiàn) 顯著升高。圖4C示出了循環(huán)絕對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（ANC)、絕對(duì)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（ALC)和白細(xì) 胞（WBC)計(jì)數(shù)的改變。值得注意的是，ALC的增加主要由激活的CT019T淋巴細(xì)胞組成。
[0027] 圖5,包括圖5A直至5D，是描繪了在周圍血液、骨髓和CSF中CTL019細(xì)胞的擴(kuò)張 和可視化的一系列圖。圖5A示出了用抗體染色的周圍血液的流式細(xì)胞術(shù)分析，以檢測(cè)CD3 和抗-⑶19CAR。描繪的是在CH0P-100和CH0P-101中，表達(dá)CAR的⑶3細(xì)胞的百分比。圖 5B示出了通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR，CTL019T細(xì)胞在周圍血液、骨髓和CSF中的存在。從在CTL019 輸注之前和之后連續(xù)時(shí)間點(diǎn)收集的全血、骨髓抽出物和CSF分離基因組DNA。圖5C示出了 在從CH0P-100和CH0P-101收集的CSF中CTL019細(xì)胞的流式細(xì)胞檢測(cè)。圖示出了在周 圍血液的Wright (賴特）染色涂片和CSF的細(xì)胞涂片中激活的大顆粒淋巴細(xì)胞的圖。
[0028] 圖6是示出了在CH0P-101中，在基線和在復(fù)發(fā)時(shí)的⑶19表達(dá)的圖。在CTL019輸 注之前，以及在復(fù)發(fā)2個(gè)月以后，從CH0P-101獲得骨髓樣品。分離自骨髓的單核細(xì)胞被染 色⑶45、⑶34和⑶19,并且在Accuri C6流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。在活細(xì)胞上門控后，在 CD34+細(xì)胞上對(duì)母細(xì)胞門（blast gate) (CD45+SSC低）子門控（subgated)，并且對(duì)于CD19 表達(dá)產(chǎn)生頻率曲線。分劃線表示針對(duì)同種型對(duì)照上的相同門控的閾值。治療前母細(xì)胞具有 一個(gè)范圍的CD19分布，其中一小群非常暗的染色細(xì)胞被視為X軸上，在102,左側(cè)頻率曲線 的尾部。復(fù)發(fā)樣品并不具有任何CD19陽(yáng)性母細(xì)胞。處理前母細(xì)胞群體上CD19表達(dá)的分析揭 示，小群體的CD19暗或者是陰性細(xì)胞。這一小群體的細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度（MFI)為187 (左 側(cè)小圖），類似于抗-CD19-染色的復(fù)發(fā)的母細(xì)胞的MFI (201，右側(cè)小圖）。治療前骨髓樣品 是細(xì)胞減少的，具有10%母細(xì)胞，并且復(fù)發(fā)骨髓樣品是正常細(xì)胞的，具有68%母細(xì)胞，導(dǎo)致 可供用于采樣的事件中的差異。
[0029] 圖7是示出在CTL019輸注后，在第+23天，在CH0P-101中，骨髓中緩和的誘導(dǎo)的 圖。在基線（頂部小圖）和在第+23天（底部小圖），對(duì)CH0P-101的臨床免疫分型報(bào)道。細(xì) 胞染色⑶10、⑶19、⑶20、⑶34、⑶38和⑶58。在溶解紅細(xì)胞后，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。在第+23 天的報(bào)道表明白細(xì)胞由以下組成：42.0%淋巴細(xì)胞、6.0%單核細(xì)胞、50. 3%脊髓型、0. 17% 脊髓母細(xì)胞以及沒有活的淋巴祖細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，不存在殘余的前體B細(xì)胞淋巴性 白血病/淋巴瘤的令人信服的免疫表型證據(jù)。鑒定了基本上沒有活的B細(xì)胞。
[0030] 圖8是描繪在血液中CTL019細(xì)胞的體內(nèi)擴(kuò)張和持久性的圖。針對(duì)CH0P-100和 CH0P-101，示出了血液中的白細(xì)胞（WBC)、CD3+T細(xì)胞、和CTL019細(xì)胞的個(gè)數(shù)。在一個(gè)半對(duì) 數(shù)圖上示出了細(xì)胞個(gè)數(shù)。
[0031] 圖9,包括圖9A和9B，是證明了在CTL019輸注1個(gè)月內(nèi)，受試者在骨髓和血液中， 具有CD19陽(yáng)性細(xì)胞的消除的一系列圖。圖9A示出了 CH0P-100中，持久性的B細(xì)胞發(fā)育不 全。頂部小圖示出了在第+6天，在從表達(dá)⑶19和⑶20的CH0P-100抽出的骨髓中，白血病 母細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)群體。在第+23和6個(gè)月，這一群體缺失。圖9B示出在CH0P-101中，B細(xì)胞 發(fā)育不全和⑶19逃逸變體細(xì)胞的出現(xiàn)。用抽出自抗-⑶45、⑶34和⑶19染色的CH0P-101 的骨髓的流式細(xì)胞術(shù)分析。在底端行中，側(cè)向散射的和CD45暗的陽(yáng)性細(xì)胞用來(lái)鑒定在底線 表達(dá)可變量的⑶34和⑶19的白血病細(xì)胞。在第64天檢測(cè)到僅有⑶19陰性母細(xì)胞。在頂 部小圖中的數(shù)值表示每個(gè)象限中表示的總白細(xì)胞的分?jǐn)?shù)。在下部小圖中的數(shù)值表示來(lái)自在 CD45暗/SS低門中表示的總白細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
[0032] 圖10是描繪了在接受CAR T細(xì)胞后，在患者中呈現(xiàn)的鐵蛋白的水平的圖。
[0033] 圖11是描繪了在接受CAR T細(xì)胞后，在患者中呈現(xiàn)的肌紅蛋白的水平的圖。
[0034] 圖12是描繪了在接受CAR T細(xì)胞后，在患者中呈現(xiàn)的纖溶酶原激活物抑制 劑-I(PAI-I)的水平的圖。
[0035] 詳細(xì)說(shuō)明
[0036] 本發(fā)明涉及用于治療癌癥，包括但不局限于血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體瘤的組合物 和方法。本發(fā)明還涵蓋了治療和預(yù)防某些類型的癌癥，包括原發(fā)性癌癥和轉(zhuǎn)移性癌癥，連同 難治的或抗常規(guī)化療的癌癥的方法。這些方法包括給予對(duì)此類治療和預(yù)防有需要的患者一 個(gè)治療上或預(yù)防上有效量的T細(xì)胞，該T細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)嵌合抗原受體（CAR)。CAR是將 用于希望的抗原（例如腫瘤抗原）的基于抗體的特異性與T細(xì)胞受體激活細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組 合，以產(chǎn)生顯示特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。
[0037] 作為整體治療方案的一部分，本發(fā)明涵蓋通過(guò)評(píng)價(jià)在T細(xì)胞輸注后的患者中的可 溶性因子譜（profile)，而管理某些癌癥（例如預(yù)防或拖延它們的復(fù)發(fā)，或延長(zhǎng)緩和的時(shí) 間）的方法。優(yōu)選地，可溶性因子譜包括細(xì)胞因子譜的評(píng)價(jià)。當(dāng)細(xì)胞因子譜表明與T細(xì)胞 輸注前相比，T細(xì)胞輸注后具體細(xì)胞因子的增加，則熟練的技術(shù)人員可以選擇給予對(duì)此類管 理有需要的患者有效量的細(xì)胞因子抑制化合物或它的一種藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、 水合物、立體異構(gòu)體、包合物、或前藥，以管理T細(xì)胞輸注后提高的水平的細(xì)胞因子。
[0038] 本發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)：從基線的調(diào)制或在基線的現(xiàn)存水平的因子的獨(dú)特組合 的鑒定可以幫助追蹤C(jī)AR T細(xì)胞輸注后的T細(xì)胞激活、靶活性、以及潛在有害副作用，以幫 助管理癌癥的治療。示例性因子包括但不局限于IL-I 0、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、 IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-IRa、IL-2R、IFN-a、IFN-y、MIP-I a、MIP-I 0、 MCP-I、TNF a、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、CXCR 因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、EGF、HGF、 FGF-0、CD40、CD40L、鐵蛋白、等。
[0039] 本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)嵌合抗原受體（CAR)的T細(xì)胞的過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移與毒性管理 組合的策略，，其中產(chǎn)生來(lái)自T細(xì)胞輸注后患者的可溶性因子譜，并且進(jìn)行針對(duì)提高的可溶 性因子的治療，以便治療癌癥。例如，產(chǎn)生實(shí)時(shí)可溶性因子譜允許用適當(dāng)抑制劑干預(yù)提高的 可溶性因子，以便將水平下降至正常水平。
[0040] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的CAR包括具有靶向希望的抗原的抗原識(shí)別域的胞外 域、跨膜結(jié)構(gòu)域、和胞漿域。本發(fā)明并不局限于一個(gè)特定的CAR。而是，靶向希望的抗原的任 何CAR都可以用于本發(fā)明。在PCT/US11/64191中已經(jīng)描述了制備CAR的組合物和方法，將 其通過(guò)引用以其全文并入于此。
[0041] 在任何以上方法的一些實(shí)施方式中，這些方法導(dǎo)致腫瘤尺寸或疾病或疾病進(jìn)展的 證據(jù)的可測(cè)量的減少、完全反應(yīng)、部分反應(yīng)、穩(wěn)定的疾病、無(wú)進(jìn)展存活的增加或延長(zhǎng)、總體存 活期的增加或延長(zhǎng)、或毒性的減小。
[0042] 定義
[0043] 除非另外定義，否則在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所理解相同的含義。盡管與在此描述的那些方法和材料類似或等效的任 何方法和材料均可以用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，但在此描述了優(yōu)選的材料和方法。在描述和 要求本發(fā)明時(shí)，將使用以下術(shù)語(yǔ)。
[0044] 還應(yīng)理解在此使用術(shù)語(yǔ)的目的僅在于描述【具體實(shí)施方式】，并不意味著限制。
[0045] 在此處使用的冠詞"一個(gè)"和"一種"（"a"和"an"）是指一個(gè)或超過(guò)一個(gè)（即， 至少一個(gè)）該冠詞的語(yǔ)法賓語(yǔ)。通過(guò)舉例，"一個(gè)元素"是指一個(gè)元素或超過(guò)一個(gè)元素。
[0046] 如在此使用，當(dāng)指一個(gè)可測(cè)量的值，例如一個(gè)量、一個(gè)時(shí)距等時(shí)，"約"是指涵蓋從 指定值的±20%或±10%的變化，在一些實(shí)例中是±5%，在一些實(shí)例中是±1%，并且在 一些實(shí)例中是±0. 1%，只要此類變化適合進(jìn)行披露的方法。
[0047] 如在此使用，"激活"是指已經(jīng)充分刺激T細(xì)胞的狀態(tài)，能誘導(dǎo)可檢測(cè)的細(xì)胞增殖。 激活可以與誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生、和可檢測(cè)的效應(yīng)子功能關(guān)聯(lián)。除其他事項(xiàng)之外，術(shù)語(yǔ)"激 活的T細(xì)胞"是指經(jīng)歷細(xì)胞分裂的T細(xì)胞。
[0048] 在此使用可溶性因子的"激活劑"或"激動(dòng)劑"來(lái)指能夠激活或增加可溶性因子的 水平的藥劑的分子。激活劑是增加、促進(jìn)、誘導(dǎo)激活，激活或上調(diào)可溶性因子的活性或表達(dá) 的化合物，例如激動(dòng)劑。用于檢測(cè)激活劑的測(cè)定包括例如在體外、在細(xì)胞中、或細(xì)胞膜中表 達(dá)可溶性因子，施用推定的激動(dòng)劑化合物，并且然后確定對(duì)可溶性因子活性的功能效應(yīng)，如 在本文的其他地方所描述。
[0049] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"抗體"是指特異性結(jié)合抗原的免疫球蛋白分子?？贵w可以是 源自天然來(lái)源或源自重組來(lái)源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性 部分。通?？贵w是免疫球蛋白分子的四聚體。本發(fā)明中的抗體可以按多種形式存在，包括 例如多克隆抗體、單克隆抗體、Fv、Fab和F(ab)2連同單鏈抗體和人源化抗體（Harlow(哈 洛）等人，1999,在以下中：Using Antibodies:A Laboratory Manual(使用抗體：實(shí)驗(yàn)室手 冊(cè)），Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社），紐約州；Harlow(哈 洛）等人，1989,在以下中：Antibodies:A Laboratory Manual(抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)），冷 泉港，紐約；Houston(休斯敦）等人，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國(guó)科學(xué)院院 刊）85:5879-5883 ;Bird (伯德）等人，1988, Science (科學(xué)）242:423-426)。
[0050] 術(shù)語(yǔ)"抗體片段"是指完整抗體的一部分并且指完整抗體的抗原決定可變區(qū)?？?體片段的示例包括但不局限于Fab、Fab'、F(ab'）2、和Fv片段、線性抗體；scFv抗體；以及 從抗體片段形成的多特異性抗體。
[0051] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"抗原"被定義為引起免疫反應(yīng)的分子。這一免疫反應(yīng)可以涉及 抗體產(chǎn)生、抑或特定免疫活性細(xì)胞的激活，或二者。熟練的技術(shù)人員將理解，任何大分子，幾 乎包括所有蛋白或肽，可以用作抗原。此外，抗原可以源自重組的或基因組的DNA。熟練的 技術(shù)人員將理解，如在此使用了那一術(shù)語(yǔ)，包括編碼引起免疫反應(yīng)的蛋白的核苷酸序列或 一部分核苷酸序列的任何任何DNA，因此編碼了"抗原"。此外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解， 并不唯一地由基因的全長(zhǎng)核苷酸序列編碼了抗原。容易明白的是，本發(fā)明包括但不局限于 多于一個(gè)基因的部分核苷酸序列的使用，以及按不同組合安排這些核苷酸序列，以引起希 望的免疫反應(yīng)。此外，熟練的技術(shù)人員將理解，根本不需要由"基因"來(lái)編碼抗原。容易明 白的是，可以合成而產(chǎn)生抗原，并且抗原可以源自生物樣品。此類生物樣品可以包括但不局 限于組織樣品、腫瘤樣品、細(xì)胞或生物學(xué)流體。
[0052] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"自身抗原"是指由免疫系統(tǒng)識(shí)別的任何自體抗原，就像它是外 源的一樣。自身抗原包括但不局限于細(xì)胞蛋白、磷蛋白、細(xì)胞表面蛋白、細(xì)胞脂質(zhì)、核酸、糖 蛋白，包括細(xì)胞表面受體。
[0053] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"自身免疫性疾病"被定義為由自身免疫反應(yīng)引起的失調(diào)。自 身免疫性疾病是由于對(duì)自體抗原的不適當(dāng)?shù)牟⑶疫^(guò)度的反應(yīng)。除了別的之外，自身免疫性 疾病的示例包括但不局限于：阿狄森氏病、嚴(yán)重脫發(fā)、強(qiáng)直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身 免疫性腮腺炎、克羅恩病、糖尿?。↖型）、營(yíng)養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥、附睪炎、腎小球腎 炎、格雷夫斯氏病、格-巴綜合征、橋本氏病、溶血性貧血、系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、多重峰硬化、 重癥肌無(wú)力、尋常型天皰瘡、銀肩病、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、舍格倫綜合 癥、脊柱關(guān)節(jié)病、甲狀腺炎、血管炎、白癜風(fēng)、粘液水腫、惡性貧血、潰瘍性結(jié)腸炎。
[0054] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"自體同源的"是指源自與它稍后要重新引入的個(gè)體相同的個(gè)體 的任何材料。
[0055] "異源的"是指源自同一物種的不同動(dòng)物的移植物。
[0056] "異種異體移植"是指源自不同物種的動(dòng)物的移植物。
[0057] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"癌癥"被定義為特征在于異常細(xì)胞的迅速并且失控的生長(zhǎng)的疾 病。癌細(xì)胞可以局部地或通過(guò)血流和淋巴系統(tǒng)而擴(kuò)展至身體的其他部分。不同癌癥的示例 包括但不局限于乳癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、肝癌、 腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
[0058] 如在此使用，"聯(lián)合治療"是指結(jié)合其他藥劑給予第一藥劑。"結(jié)合"是指除了另一 治療方式，給予一種治療方式。像這樣，"結(jié)合"是指在遞送其他治療方式至個(gè)體之前、之中、 或之后給予一種治療方式。此類聯(lián)合可以被認(rèn)為是單個(gè)治療方案或制度的一部分。
[0059] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"并行給予"是指在聯(lián)合治療中，第一治療的給予和第二治療的 給予彼此重疊。
[0060] 作為術(shù)語(yǔ)在此使用，"共刺激配體"包括特異性結(jié)合T細(xì)胞上的同類共刺激分子 的抗原遞呈細(xì)胞（APC、樹突細(xì)胞、B細(xì)胞、等）上的分子，由此提供除了通過(guò)以下而提供的 原始信號(hào)的信號(hào)，例如TCR/CD3復(fù)合物與加載有肽的MHC分子的結(jié)合，介導(dǎo)了 T細(xì)胞反應(yīng)， 包括但局限于增殖、激活、分化、等。共刺激配體可以包括但不局限于⑶7、B7-l(⑶80)、 B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、0X40L、可誘導(dǎo)共刺激配體（ICOS-L)、細(xì)胞間黏附分子 (ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴細(xì)胞毒素 0 受體、3/TR6、 ILT3、ILT4、HVEM、結(jié)合Toll配體受體的激動(dòng)劑或抗體、以及特異性結(jié)合B7-H3的配體。在 其他事物之外，共刺激配體還涵蓋特異性結(jié)合T細(xì)胞上存在的共刺激分子--例如，但不局 限于 CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD-I、IC0S、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-I (LFA-I)、 ⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3--的抗體，以及特異性結(jié)合⑶83的配體。
[0061] "共刺激分子"是指特異性結(jié)合共刺激配體的T細(xì)胞上的同源結(jié)合配偶體，由此介 導(dǎo)通過(guò)T細(xì)胞的共刺激反應(yīng)，例如但不局限于增殖。共刺激分子包括但不局限于MHC I類 分子、BTLA和Toll配體受體。
[0062] 如在此使用，"共刺激信號(hào)"是指與原始信號(hào)組合的信號(hào)，例如TCR/CD3配接，導(dǎo)致 T細(xì)胞增殖和/或關(guān)鍵分子的上調(diào)或下調(diào)。
[0063] "疾病"是指其中動(dòng)物不能維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的動(dòng)物的健康狀態(tài)，并且如果疾病不能 改善，則動(dòng)物的健康就繼續(xù)惡化。相比之下，"失調(diào)"是其中動(dòng)物不能維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的健康 狀態(tài)，但是其中與它將沒有該失調(diào)相比，動(dòng)物的健康狀態(tài)是更不可取的。保持不治療的話， 失調(diào)并不一定引起動(dòng)物的健康狀態(tài)中的另外的疾病。
[0064] 如在此使用，"有效量"是指提供治療的或預(yù)防的益處的量。
[0065] 如在此使用，"內(nèi)源的"是指來(lái)自，或產(chǎn)生在有機(jī)體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)內(nèi)的任何材 料。
[0066] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"外源的"是指產(chǎn)生在有機(jī)體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)外的被引入有機(jī) 體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)中的任何材料。
[0067] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"被定義為由啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的具體核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或 翻譯。
[0068] "表達(dá)載體"是指包括重組多核苷酸的載體，該重組多核苷酸包括可操作地連接至 待表達(dá)的核苷酸序列的表達(dá)控制序列。表達(dá)載體包括用于表達(dá)的充足的順式作用元件；用 于表達(dá)的其他元件可以由宿主細(xì)胞供應(yīng)或存在于體外體外表達(dá)系統(tǒng)中。表達(dá)載體包括本領(lǐng) 域已知的那些的，例如合并了重組多核苷酸的粘粒、質(zhì)粒（例如裸露的或包含在脂質(zhì)體內(nèi)） 和病毒（例如慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、和腺病毒伴隨病毒）。
[0069] "同源的"是指兩個(gè)多肽之間的或兩個(gè)核酸分子之間的序列相似性或序列一致性。 當(dāng)全部?jī)蓚€(gè)比較的序列中的一個(gè)位置被相同堿基或氨基酸單體亞基占據(jù)時(shí)，例如兩個(gè)DNA 分子的每一個(gè)中的一個(gè)位置都被腺嘌呤占據(jù)，則這些分子在那一位置是同源的。兩個(gè)序列 之間的同源性的百分比是由兩個(gè)序列共享的匹配位置數(shù)或同源位置數(shù)除以比較的位置數(shù)X 100的一個(gè)函數(shù)。例如，如果兩個(gè)序列中的位置中10個(gè)有6個(gè)是匹配的或同源的，則兩個(gè)序 列是60%同源的。通過(guò)舉例，DNA序列ATTGCC和TATGGC共享50%同源性。一般而言，當(dāng) 兩個(gè)序列對(duì)齊時(shí)做出比較，以給出最大同源性。
[0070] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"免疫球蛋白"或"Ig"被定義為發(fā)揮抗體的作用的一類蛋白。B 細(xì)胞表達(dá)的抗體有時(shí)被稱為BCR(B細(xì)胞受體）或抗原受體。包括在這一類蛋白中的五個(gè)成 員是IgA、IgG、IgM、IgD、和IgE。IgA是身體分泌物（例如唾液、眼淚、母乳、胃腸分泌物和 呼吸道和生殖泌尿道的黏液分泌物）中存在的初級(jí)抗體。IgG是最常見的循環(huán)抗體。IgM 是在多數(shù)受試者體內(nèi)，在初次免疫反應(yīng)中產(chǎn)生的主要免疫球蛋白。它是凝集、補(bǔ)體結(jié)合、和 其他抗體反應(yīng)中最有效的免疫球蛋白，并且在針對(duì)細(xì)菌和病毒的防御中是重要的。IgD是不 具有已知抗體功能的免疫球蛋白，但是可以用作抗原受體。IgE是當(dāng)暴露于變應(yīng)原時(shí)，通過(guò) 引起介質(zhì)從肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放而介導(dǎo)速發(fā)型超敏反應(yīng)的免疫球蛋白。
[0071] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"免疫反應(yīng)"包括T細(xì)胞介導(dǎo)的和/或B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。 示例性免疫反應(yīng)包括T細(xì)胞反應(yīng)，例如細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞的細(xì)胞毒性。此外，術(shù)語(yǔ)免疫反 應(yīng)包括通過(guò)T細(xì)胞激活而間接發(fā)揮作用的免疫反應(yīng)，例如抗體產(chǎn)生（體液反應(yīng)）和細(xì)胞因 子應(yīng)答細(xì)胞（例如巨噬細(xì)胞）的激活。在免疫反應(yīng)中涉及的免疫細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞，例如 B細(xì)胞和T細(xì)胞（CD4+、⑶8+、Thl和Th2細(xì)胞）；抗原呈遞細(xì)胞（例如專職性抗原提呈細(xì)胞 (例如樹突細(xì)巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞），和非專職性抗原提呈細(xì)胞，例如角化 細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞）；自然殺傷細(xì)胞；骨髓細(xì)胞，例 如巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、和粒細(xì)胞。
[0072] 在此使用可溶性因子的"抑制劑"或"拮抗劑"來(lái)指能夠抑制、滅活或減少可溶性因 子的水平的藥劑的分子。抑制劑是例如結(jié)合、部分或完全阻斷活性、降低、防止、延遲激活、 滅活、脫敏、或下調(diào)可溶性因子的活性或表達(dá)的化合物，例如拮抗劑。抑制劑包括多肽抑制 劑（例如抗體、可溶性受體等），連同核酸抑制劑（例如siRNA或反義RNA)，可溶性因子的遺 傳修飾的版本，例如具有改變的活性的版本，連同天然發(fā)生的和合成的可溶性因子拮抗劑， 小化學(xué)分子等。用于檢測(cè)抑制劑的測(cè)定包括例如在體外、在細(xì)胞中、或細(xì)胞膜中表達(dá)可溶性 因子，施用推定的拮抗劑化合物，并且然后確定對(duì)可溶性因子活性的功能效應(yīng)，如在本文的 其他地方所描述。
[0073] 如在此使用，"指導(dǎo)材料"包括可以用于與本發(fā)明的組合物和方法的有用性進(jìn)行交 流的出版物、記錄、圖表、或任何其他表達(dá)介質(zhì)。例如，本發(fā)明的試劑盒的指導(dǎo)材料可以被附 加至包含本發(fā)明的核酸、肽、和/或組合物的容器上，或者與包含核酸、肽、和/或組合物的 容器一起發(fā)貨。可選地，指導(dǎo)材料可以有意與容器分開發(fā)貨，這樣由接收者協(xié)作性地使用指 導(dǎo)材料和化合物。
[0074] "隔離的"是指從天然狀態(tài)加以改變或遠(yuǎn)離天然狀態(tài)。例如，天然存在于活的動(dòng)物 中的核酸或肽并不是"隔離的"，但是從其天然狀態(tài)的共存材料部分地或完全地分離的相同 和酸或肽是"隔離的"。隔離的核酸或蛋白可以按基本上純化的形式存在，或可以存在于非 天然環(huán)境中，例如像存在于宿主細(xì)胞中。
[0075] 如在此使用，"慢病毒"是指逆轉(zhuǎn)錄病毒科的一個(gè)屬。在逆轉(zhuǎn)錄病毒中，慢病毒是獨(dú) 特的，在于能夠感染非分裂細(xì)胞；它們可以遞送顯著量的遺傳信息進(jìn)入宿主細(xì)胞的DNA中， 所以它們是基因遞送載體的最有效方法之一。HIV、SIV、和FIV都是慢病毒的示例。源自慢 病毒的載體提供了用來(lái)達(dá)到體內(nèi)顯著水平的基因轉(zhuǎn)移的工具。
[0076] 如在此使用，生物樣品中，短語(yǔ)"可溶性因子的水平"典型地是指在生物樣品中存 在的可溶性因子的蛋白的、蛋白片段的或肽的水平的量。"可溶性因子的水平"不需要量化， 而是可以簡(jiǎn)單地檢測(cè)，例如由一個(gè)人主觀視覺檢測(cè)，與或不與來(lái)自對(duì)照樣品的的水平，或?qū)?照樣品的預(yù)期水平進(jìn)行比較。
[0077] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"調(diào)制"是指與未經(jīng)治療或未使用化合物的受試者中的反應(yīng)水平 相比，和/或與在其他方面相同但是未治療的受試者中的反應(yīng)水平相比，介導(dǎo)受試者中反 應(yīng)水平中的可檢測(cè)增加或降低。該術(shù)語(yǔ)涵蓋擾亂和/或影響天然信號(hào)或反應(yīng)，由此介導(dǎo)受 試者（優(yōu)選是人）中的有益治療反應(yīng)。
[0078] 免疫原性組合物的"非消化道"給藥包括例如皮下（s.c.)、靜脈內(nèi)（i.v.)、肌內(nèi) (i. m.)、或胸骨內(nèi)注射或輸注技術(shù)。
[0079] 在此可互換地使用術(shù)語(yǔ)"患者"、"受試者"、"個(gè)體"，并且是指無(wú)論體外還是原位， 都服從在此描述的方法的任何動(dòng)物、或它們的細(xì)胞。在某些非限制性實(shí)施方式中，患者、受 試者或個(gè)體是人。
[0080] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"同時(shí)給藥"是指以不超過(guò)約15分鐘的時(shí)間間隔，例如不超過(guò)約 10、5、或1分鐘里的任何時(shí)間，給予聯(lián)合治療中的第一治療和第二治療。當(dāng)同時(shí)給予第一和 第二治療時(shí)，第一和第二治療可以包含在同一組合物中（例如包含第一和第二治療這二者 的組合物）或在分開的組合物中（例如第一治療在一個(gè)組合物中，并且第二治療包含在另 一組合物中）。
[0081] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"同時(shí)給藥"是指以不超過(guò)約15分鐘的時(shí)間間隔，例如不超過(guò)約 10、5、或1分鐘里的任何時(shí)間，給予聯(lián)合治療中的第一治療和第二治療。當(dāng)同時(shí)給予第一和 第二治療時(shí)，第一和第二治療可以包含在同一組合物中（例如包含第一和第二治療這二者 的組合物）或在分開的組合物中（例如第一治療在一個(gè)組合物中，并且第二治療包含在另 一組合物中）。
[0082] 如在此使用，關(guān)于一種抗體，術(shù)語(yǔ)"特異性結(jié)合"是指識(shí)別特異性抗原、但是基本上 不識(shí)別或結(jié)合樣品中的其他分子的抗體。例如，特異性結(jié)合來(lái)自一個(gè)物種的抗原的抗體還 可以結(jié)合來(lái)自一個(gè)或多個(gè)物種的抗原。但是此類種間交叉反應(yīng)性自身并不改變作為特異性 的抗體的分類。在另一個(gè)示例中，特異性結(jié)合抗原的抗體還可以結(jié)合抗原的不同等位基因 形式。然而，此類交叉反應(yīng)性自身并不改變作為特異性的抗體的分類。在一些實(shí)例中，術(shù)語(yǔ) "特異性結(jié)合"（specific binding或specifically binding)可以關(guān)于抗體、蛋白或肽與 第二化學(xué)物種的相互作用進(jìn)行使用，是指該相互作用取決于化學(xué)物種上的具體結(jié)構(gòu)（例如 抗原決定簇或表位）的存在；例如，抗體識(shí)別并且結(jié)合特定蛋白結(jié)構(gòu)，而不是一般地結(jié)合蛋 白。如果抗體特異性針對(duì)表位"A"，則在包含標(biāo)記的"A"和抗體的反應(yīng)中，包含表位A (或游 離的、未標(biāo)記的A)的分子的存在將減少結(jié)合至抗體的標(biāo)記的A的量。
[0083] 術(shù)語(yǔ)"刺激"是指由刺激分子（例如TCR/CD3復(fù)合物）與它的同源配體結(jié)合而誘導(dǎo) 的初次反應(yīng)，由此介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，例如但不局限于經(jīng)由TCR/CD3復(fù)合物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。刺 激可以介導(dǎo)某些分子的改變的表達(dá)，例如TGF-0的下調(diào)，和/或細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的識(shí)別，等。
[0084] 作為術(shù)語(yǔ)在此使用，"刺激分子"是指與抗原遞呈細(xì)胞上存在的同源刺激配體特異 性結(jié)合的T細(xì)胞上的分子。
[0085] 如在此使用，"刺激配體"是指當(dāng)存在于抗原遞呈細(xì)胞（例如APC、樹突細(xì)胞、B細(xì) 胞、等）上時(shí)，配體可以與T細(xì)胞上的同源結(jié)合配偶體（在此稱為"刺激分子"）特異性結(jié)合， 由此介導(dǎo)通過(guò)T細(xì)胞的初次反應(yīng)，包括但不局限于激活、免疫反應(yīng)的引發(fā)、增殖、等。刺激配 體是本領(lǐng)域熟知的，并且在其他事物之外，涵蓋加載有肽、抗-CD3抗體、超激動(dòng)劑抗CD-28 抗體、和超激動(dòng)劑抗-CD2抗體的MHC I類分子。
[0086] 術(shù)語(yǔ)"受試者"旨在包括其中可以引起免疫反應(yīng)的活的有機(jī)體（例如哺乳動(dòng)物）。 受試者的示例包括人、狗、貓、小鼠、大鼠、和它們的轉(zhuǎn)基因物種。
[0087] 如在此使用，"基本上純化的"細(xì)胞是本質(zhì)上不含有其他細(xì)胞類型的細(xì)胞。基本上 純化的細(xì)胞是指已經(jīng)從在其天然發(fā)生的狀態(tài)下與其正常關(guān)聯(lián)的其他細(xì)胞類型分離的細(xì)胞。 在一些實(shí)例中，一群基本上純化的細(xì)胞是指一個(gè)同源的群的細(xì)胞。在其他實(shí)例中，這一術(shù)語(yǔ) 簡(jiǎn)單地是指已經(jīng)從在它們的天然狀態(tài)下與其正常關(guān)聯(lián)的細(xì)胞分離的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式 中，在體外培養(yǎng)這些細(xì)胞。在其他實(shí)施方式中，不在體外培養(yǎng)這些細(xì)胞。
[0088] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"治療的"是指治療和/或預(yù)防。通過(guò)抑制、緩和、或根除疾病狀 態(tài)，獲得治療效果。
[0089] 術(shù)語(yǔ)"治療有效量"是指將引起研宄者、獸醫(yī)、醫(yī)師或其他臨床醫(yī)生正尋找的組織、 系統(tǒng)、或受試者的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)反應(yīng)的受試者化合物的量。術(shù)語(yǔ)"治療有效量"包括當(dāng)給予 時(shí)，足夠預(yù)防所治療的失調(diào)或疾病的一種或多種病征或癥狀的發(fā)展或在一定程度上緩解該 病征或疾病的化合物的量。治療有效量將取決于化合物，疾病和它的嚴(yán)重程度以及待治療 的受試者的年齡、體重、等而變化。
[0090] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"移植物"是指引入個(gè)體的細(xì)胞、組織、或器官。移植材料的來(lái)源 可以是培養(yǎng)的細(xì)胞、來(lái)自另一個(gè)體的細(xì)胞、或來(lái)自同一個(gè)體的細(xì)胞（例如在體外培養(yǎng)這些 細(xì)胞后）。示例性器官移植物是腎臟、肝臟、心臟、肺、和胰臟。
[0091] 作為術(shù)語(yǔ)在此使用，"治療"疾病是指減少受試者經(jīng)歷的疾病或失調(diào)的至少一個(gè)病 征或癥狀的頻率或嚴(yán)重程度。
[0092] 如在此使用，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)染的"或"轉(zhuǎn)化的"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)的"是指一個(gè)過(guò)程，通過(guò)該過(guò)程， 外源核酸被移入或引入宿主細(xì)胞。"轉(zhuǎn)染的"或"轉(zhuǎn)化的"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)的"細(xì)胞是已經(jīng)轉(zhuǎn)染了、 轉(zhuǎn)化了或轉(zhuǎn)導(dǎo)了外源核酸的細(xì)胞。該細(xì)胞包括原代受試者細(xì)胞和它的后代。
[0093] 范圍：貫穿本披露，可以按一個(gè)范圍格式呈現(xiàn)本發(fā)明的不同方面。應(yīng)當(dāng)理解的是， 處于范圍格式的說(shuō)明僅為了方便和簡(jiǎn)潔，不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明的范圍的不變的限制。因 此，范圍的說(shuō)明應(yīng)被認(rèn)為是已經(jīng)確切地披露了所有可能的子范圍連同該范圍內(nèi)的單獨(dú)數(shù) 值。例如，一個(gè)范圍的說(shuō)明，例如從1至6,應(yīng)被認(rèn)為是已經(jīng)確切披露了多個(gè)子范圍，例如從 1至3、從1至4、從1至5、從2至4、從2至6、從3至6等，連同該范圍內(nèi)的單獨(dú)數(shù)字，例如 1、2、2. 7、3、4、5、5. 3、和6。這一應(yīng)用無(wú)論該范圍的寬度如何。
[0094]
[0095] 本發(fā)明提供了用于治療患者中的癌癥的組合物和方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，該治 療方法包括一線的治療，該一線的治療包括給予本發(fā)明的CAR至患者中，用來(lái)誘導(dǎo)抗腫瘤 免疫反應(yīng)并且監(jiān)測(cè)T細(xì)胞輸注后患者中的可溶性因子的水平，以便根據(jù)第一線的治療的結(jié) 果，確定適合治療該患者的第二線的治療的類型。
[0096] 在一個(gè)實(shí)施方式中，該第二線的治療包括在接受適當(dāng)?shù)腃AR T的輸注后（在本文 的其他地方稱為"T細(xì)胞輸注后"），評(píng)價(jià)患者中的可溶性因子譜，其中當(dāng)該可溶性因子譜表 明與T細(xì)胞輸注前相比，T細(xì)胞輸注后具體的可溶性因子中的增加時(shí)，熟練的技術(shù)人員可以 選擇給予有需要的患者有效量的可溶性因子抑制化合物，以管理T細(xì)胞輸注后，提高的水 平的可溶性因子。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，第二線的治療包括給予一個(gè)類型的可溶性因子 抑制治療，以管理提高的水平的生成自使用CAR T細(xì)胞的第一線的治療的某一可溶性因子。
[0097] 仍在另一個(gè)實(shí)施方式中，涉及給予可溶性因子抑制化合物至患者的第二線的治療 可以與用于治療、預(yù)防或管理與不希望的血管生成關(guān)聯(lián)的或特征在于不希望的血管生成的 疾病或失調(diào)的其他常規(guī)治療組合。此類常規(guī)治療的示例包括但不局限于外科手術(shù)、化療、放 射治療、激素治療、生物治療和免疫治療。
[0098] 在一個(gè)實(shí)施方式中，可以將本發(fā)明的CAR工程化，以包括具有靶向融合至T細(xì)胞抗 原受體復(fù)合物G鏈（例如CD3 〇的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域的腫瘤抗原的抗原結(jié)合域的胞外 域。示例性腫瘤抗原B細(xì)胞抗原是CD19,因?yàn)樵趷盒訠細(xì)胞上表達(dá)這一抗原。然而，本發(fā) 明并不局限于靶向CD19。而是，本發(fā)明包括任何腫瘤抗原結(jié)合部分。抗原結(jié)合部分優(yōu)選與 來(lái)自一個(gè)或多個(gè)共刺激分子和一個(gè)G鏈的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合。優(yōu)選地，抗原結(jié)合部分與 選自下組的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合，該組由以下各項(xiàng)組成：CD137(4-1BB)信號(hào)傳導(dǎo) 域、⑶28信號(hào)傳導(dǎo)域、⑶3 G信號(hào)域、和它們的任何組合。
[0099] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的CAR包括⑶137 (4-1BB)信號(hào)傳導(dǎo)域。這是因?yàn)楸景l(fā) 明部分基于以下發(fā)現(xiàn)：可以用添加共刺激域進(jìn)一步增強(qiáng)CAR-介導(dǎo)的T-細(xì)胞反應(yīng)。例如，與 未工程化以表達(dá)⑶137 (4-1BB)的其他方面相同的CAR T細(xì)胞相比，包含⑶137 (4-1BB)信號(hào) 傳導(dǎo)域顯著增加了 CAR介導(dǎo)的活性和CAR T細(xì)胞的體外持久性。然而，本發(fā)明并不局限于 一個(gè)特定的CAR。而是，靶向腫瘤抗原的任何CAR都可以用于本發(fā)明。在PCT/US11/64191 中已經(jīng)描述了制作和使用CAR的組合物和方法，將其通過(guò)引用以其全文并入于此。
[0100] 方法
[0101] 本發(fā)明的治療方案導(dǎo)致腫瘤尺寸或疾病或疾病進(jìn)展的證據(jù)的可測(cè)量的減少、完全 反應(yīng)、部分反應(yīng)、穩(wěn)定的疾病、無(wú)進(jìn)展存活的增加或延長(zhǎng)、總體存活期的增加或延長(zhǎng)、或毒性 的減小。
[0102] 作為完整治療方案的一部分，本發(fā)明涵蓋第一線治療和第二線治療，其中第一線 治療包括給予本發(fā)明的CAR T細(xì)胞至對(duì)其有需要的患者。本發(fā)明的治療方案允許通過(guò)評(píng) 價(jià)T細(xì)胞輸注后，患者中的可溶性因子譜，而管理癌癥和它的治療。適當(dāng)?shù)牡诙€治療包括 給予適當(dāng)?shù)目扇苄砸蜃右种苿┲粱颊?，以減少提高的水平的生成自第一線治療的可溶性因 子。在一些實(shí)例中，適當(dāng)?shù)牡诙€治療包括給予適當(dāng)?shù)目扇苄砸蜃蛹せ顒┲粱颊?，以增加?制的水平的生成自第一線治療的可溶性因子。
[0103] 在一個(gè)實(shí)施方式中，適當(dāng)?shù)牡诙€治療包括給予適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子抑制劑至患者， 以減少提高的水平的生成自第一線治療的細(xì)胞因子。在一些實(shí)例中，適當(dāng)?shù)牡诙€治療 包括給予適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子激活劑至患者，以增加抑制的水平的生成自第一線治療的細(xì)胞因 子。
[0104] 在一個(gè)實(shí)施方式中，差示水平是與正常的或?qū)φ盏募?xì)胞、給定的患者群體的表達(dá) 水平，或與內(nèi)參相比，過(guò)表達(dá)（高表達(dá)）或表達(dá)不足（低表達(dá)）。在一些實(shí)例中，水平是在患 者和正常個(gè)體之間、T細(xì)胞輸注后的患者和T細(xì)胞輸注前的患者之間、或在第一時(shí)間點(diǎn)的T 細(xì)胞輸注后的患者和第二時(shí)間點(diǎn)的T細(xì)胞輸注后的患者之間進(jìn)行比較。
[0105] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括評(píng)價(jià)一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞因子的差示水平，以產(chǎn)生T 細(xì)胞輸注后的患者中的細(xì)胞因子譜，以便出于將細(xì)胞因子水平調(diào)回正常水平的目的，確定 待施用至患者的細(xì)胞因子治療的類型。因此，可以施用本發(fā)明，以鑒定由于在患者中本發(fā)明 的CAR T細(xì)胞的存在而提高的細(xì)胞因子水平，這允許用細(xì)胞因子抑制劑的患者的專門化治 療，以降低提高的水平的細(xì)胞因子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以施用本發(fā)明，以鑒定由于在 患者中本發(fā)明的CAR T細(xì)胞的存在而降低的細(xì)胞因子水平，這允許用細(xì)胞因子激動(dòng)劑的患 者的專門化治療，以增加減弱的水平的細(xì)胞因子。
[0106] 在一個(gè)實(shí)施方式中，由于接受CAR T細(xì)胞輸注而提高的細(xì)胞因子水平包括但不局 限于 IL-I 0、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-IRa、 IL-2R、IFN-a、IFN-y、MIP-I a、MIP-I0、MCP-I、TNFa、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCLlO、 〇父〇?因子、￥￡6?、狀階^53(7^乂預(yù)、￡6?、邢？、？6?-0、〇〇4〇、〇)4〇1、鐵蛋白、等。然而，本發(fā) 明不應(yīng)局限于這些列出的細(xì)胞因子。而是，本發(fā)明包括被鑒定為由于接受CAR T細(xì)胞輸注， 在患者中提高的任何細(xì)胞因子。
[0107] 在一個(gè)實(shí)施方式中，由于接受CAR T細(xì)胞輸注而降低的細(xì)胞因子水平包括但不局 限于 IL-I 0、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-IRa、 IL-2R、IFN-a、IFN-y、MIP-I a、MIP-I0、MCP-I、TNFa、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCLlO、 〇父〇?因子、￥￡6?、狀階^53(7^乂預(yù)、￡6?、邢？、？6?-0、〇〇4〇、〇)4〇1、鐵蛋白、等。然而，本發(fā) 明不應(yīng)局限于這些列出的細(xì)胞因子。而是，本發(fā)明包括被鑒定為由于接受CAR T細(xì)胞輸注， 在患者中降低的任何細(xì)胞因子。
[0108] 檢測(cè)細(xì)朐閔子和災(zāi)的治療
[0109] 雖然這一部分描述了作為第二線治療的一部分的細(xì)胞因子檢測(cè)和它的治療，但是 本發(fā)明涵蓋了作為第二線治療的一部分的任何可溶性因子的檢測(cè)和它的治療。因此，在上 下文中，"細(xì)胞因子"的描述可以同樣適合"可溶性因子"。
[0110] 在一個(gè)實(shí)施方式中，作為第二線治療的一部分，本發(fā)明包括檢測(cè)已接受本發(fā)明的 CAR T細(xì)胞的輸注的患者中的細(xì)胞因子水平。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞因子的存在或水平可 以用來(lái)選擇候選治療。在一些其他實(shí)施方式中，細(xì)胞因子的存在或水平可以用來(lái)確定在第 一線治療、第二線治療或第一線治療和第二線治療者二者的過(guò)程期間或之后的成功。
[0111] 其中可以檢測(cè)到細(xì)胞因子的生物樣品包括例如血清。在一些實(shí)施方式中，生物樣 品包括可以具有或可以不具有液體組分的組織活檢。
[0112] 免疫測(cè)定可以用來(lái)定性地或定量地分析生物樣品中的細(xì)胞因子水平。可以在 多個(gè)容易地可獲得的手冊(cè)中發(fā)現(xiàn)可應(yīng)用技術(shù)的總體概述，這些手冊(cè)例如是Harlow(哈 洛）&Lane(萊恩），Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社），Using Antibodies:A Laboratory Manual (使用抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)）（1999)。
[0113] 除了使用免疫測(cè)定來(lái)檢測(cè)來(lái)自患者的生物樣品中的細(xì)胞因子水平之外，可以基于 具體細(xì)胞因子的基因表達(dá)水平作出細(xì)胞因子表達(dá)和水平的評(píng)定。用于確定mRNA表達(dá)的存 在和/或水平的RNA雜交技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的，并且可以用來(lái)評(píng)定感興趣的 細(xì)胞因子的基因表達(dá)的存在或水平。
[0114] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法利用細(xì)胞因子的選擇性結(jié)合配偶體來(lái)鑒定生物 樣品中細(xì)胞因子的存在或確定細(xì)胞因子的水平?？梢耘c本發(fā)明的方法和試劑盒一起使用的 選擇性結(jié)合配偶體可以例如是抗體。在一些方面，可以使用針對(duì)具體細(xì)胞因子的單克隆抗 體。在一些其他方面，針對(duì)具體細(xì)胞因子的多克隆抗體可以用來(lái)實(shí)踐這些方法并且在本發(fā) 明的試劑盒中。
[0115] 針對(duì)細(xì)胞因子的商業(yè)抗體是可獲得的，并且可以與本發(fā)明的方法和試劑盒一起使 用。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的是，鑒于其中使用抗體的測(cè)定，待使用的抗體的類型、來(lái)源 和其他方面是要加以考慮的。在一些實(shí)例中，在蛋白印跡法上將識(shí)別其抗原靶的抗體可能 適用于ELISA、ELISpot測(cè)定，并且反之亦然。
[0116] 在一些實(shí)施方式中，可以使用用于生產(chǎn)本領(lǐng)域熟知的單克隆抗體或多克隆抗 體的技術(shù)來(lái)生產(chǎn)要用于本發(fā)明的測(cè)定的抗體（參見例如Coligan (科利根），Current Protocols in Immunology (免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室指南）（1991) ;Harlow(哈洛）&Lane(萊恩）， 同上；Goding(戈?。?，Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(單克隆抗體： 原理和實(shí)踐）（第二版，1986);以及Kohler (科勒）&Milstein(米爾斯坦），Nature(自 然）256:495-497 (1975)。此類技術(shù)包括通過(guò)在噬菌體或類似載體中，從重組抗體文庫(kù)選擇 抗體的抗體制備，連同通過(guò)使兔或小鼠免疫的多克隆抗體和單克隆抗體的制備（參見例如 Huse (休斯）等人，Science (科學(xué)）2祕(mì)：1275_1281 (I989) ;Ward (沃德）等人，Nature (自 然）341:544-546 (1989))。此類抗體可以用于治療應(yīng)用和診斷應(yīng)用，例如在治療和/或檢測(cè) 與在此描述的疾病或病癥關(guān)聯(lián)的任何特定細(xì)胞因子。
[0117] 采用免疫測(cè)定的任何檢測(cè)方法都特別適合在患者護(hù)理點(diǎn)的實(shí)踐。此類方法允許患 者的即時(shí)診斷和/或預(yù)測(cè)評(píng)價(jià)。護(hù)理點(diǎn)診斷系統(tǒng)描述于例如美國(guó)專利號(hào)6, 267, 722中，將 其通過(guò)引用結(jié)合于此。其他免疫測(cè)定方式也是可供使用的，這樣使得可以進(jìn)行生物樣品的 評(píng)價(jià)而不必需發(fā)送樣品至用于評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)室。典型地，這些測(cè)定被格式化為固體測(cè)定，其中 使用一種試劑，例如抗體來(lái)檢測(cè)細(xì)胞因子。描述了適合與免疫測(cè)定（例如本發(fā)明的測(cè)定） 一起使用的示例性測(cè)試裝置，例如在美國(guó)專利號(hào)7, 189, 522 ;6, 818, 455和6, 656, 745中。
[0118] 在一些方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)編碼生物樣品中的細(xì)胞因子的多核苷酸序列 的方法。如以上指出，"生物樣品"是指來(lái)自患者的一個(gè)細(xì)胞或一群細(xì)胞或一定量的組織或 流體。最通常的，已經(jīng)從患者取出樣品，但是術(shù)語(yǔ)"生物樣品"還是可以指在體內(nèi)分析的細(xì) 胞或組織，即未從該患者取出。典型地，"生物樣品"將包含來(lái)自患者的細(xì)胞，但是該術(shù)語(yǔ)還 可以指非細(xì)胞的生物材料。
[0119] 在一個(gè)實(shí)施方式中，基于擴(kuò)增的測(cè)定被用來(lái)測(cè)量希望的細(xì)胞因子的水平。在這樣 一個(gè)測(cè)定中，希望的細(xì)胞因子的核酸序列充當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)（例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，或PCR)中 的模板。在定量擴(kuò)增中，擴(kuò)增產(chǎn)物的量將與原始樣品中的模板的量成比例。與適當(dāng)?shù)膶?duì)照的 比較提供了細(xì)胞因子關(guān)聯(lián)基因的拷貝數(shù)的量度。定量擴(kuò)增的多種方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員熟知的。提供了用于定量PCR的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方案，例如在Innis (英尼斯）等人（1990)PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (PCR 實(shí)驗(yàn)方案，方法和應(yīng)用的向?qū)В?Academic Press, Inc.(學(xué)術(shù)出版社）紐約州）。RT-PCR是普通技術(shù)人員熟知的（參見例 如Ausubel (奧蘇貝爾）等人，同上）。在一些實(shí)施方式中，使用定量RT-PCR，例如TaqMan? 測(cè)定，由此允許樣品中的mRNA水平與對(duì)照樣品或值進(jìn)行比較。用于希望的細(xì)胞因子的已 知核酸序列足以使一個(gè)技術(shù)人員能夠例行地選擇引物，來(lái)擴(kuò)增基因的任何部分。可以使用 本領(lǐng)域熟知的原理來(lái)設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增特定序列的適合引物（參見例如Dieffenfach(迪芬巴 赫）&Dveksler (德維克斯勒），PCR Primer:A Laboratory Manual (PCR 引物：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)） (1995))〇
[0120] 在一些實(shí)施方式中，基于雜交的測(cè)定可以用于檢測(cè)生物樣品的細(xì)胞中希望的細(xì)胞 因子的量。此類測(cè)定包括RNA的斑點(diǎn)印跡分析連同其他測(cè)定，例如在包含細(xì)胞的樣品上進(jìn) 行的熒光原位雜交。其他雜交測(cè)定是本領(lǐng)域容易地可獲得的。
[0121] 在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方式中，將在生物樣品中檢測(cè)細(xì)胞因子多核苷酸或多肽的水 平和/或存在，由此檢測(cè)細(xì)胞因子的差示表達(dá)，用來(lái)與對(duì)照生物樣品相比，從源自輸注了本 發(fā)明的CAR T細(xì)胞的患者的生物樣品產(chǎn)生細(xì)胞因子譜。
[0122] 在生物樣品中檢測(cè)到的細(xì)胞因子多核苷酸或多肽的量表明了細(xì)胞因子的存在，用 來(lái)出于將患者分類，以便適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子治療的目的，產(chǎn)生細(xì)胞因子譜。例如，當(dāng)細(xì)胞因子 譜表明與對(duì)照（例如T細(xì)胞輸注前）相比，T細(xì)胞輸注后具體細(xì)胞因子增加時(shí)，則熟練的技 術(shù)人員可以選擇給予對(duì)此類管理有需要的患者有效量的細(xì)胞因子抑制化合物?？蛇x地，當(dāng) 細(xì)胞因子譜表明與對(duì)照（例如T細(xì)胞輸注前）相比，T細(xì)胞輸注后具體細(xì)胞因子降低時(shí)，則 熟練的技術(shù)人員可以選擇給予對(duì)此類管理有需要的患者有效量的細(xì)胞因子激動(dòng)劑化合物。
[0123] 在一些實(shí)施方式中，T細(xì)胞輸注后樣品和對(duì)照樣品之間的細(xì)胞因子水平中的差異 在約 0? 5、1. 0、1. 5、2、5、10、100、200、500、1000 倍。
[0124] 本發(fā)明的方法還可以用于評(píng)定療程的功效。例如，在包含提高的量的細(xì)胞因子 IL-6的T細(xì)胞輸注后患者中，可以通過(guò)隨時(shí)間監(jiān)測(cè)IL-6,來(lái)評(píng)定抗-IL-6治療的功效。例 如，與取自在治療之前或在治療早期的哺乳動(dòng)物的樣品中的水平相比，在取自治療后的患 者的生物樣品中IL-6多核苷酸或多肽水平中的減少表明了有效的治療。
[0125] 在一個(gè)實(shí)施方式中，治療方案可以基于中和提高的細(xì)胞因子。例如可以選擇細(xì)胞 因子的拮抗劑用于治療?？贵w是適合的拮抗劑的示例并且包括小鼠抗體、嵌合抗體、人源化 抗體、和人抗體或它們的片段。嵌合抗體是已經(jīng)典型地通過(guò)基因工程，從屬于不同物種的免 疫球蛋白基因區(qū)段構(gòu)建了它的輕鏈和重鏈基因的抗體，（參見例如Boyce(博伊斯）等人， Annals of Oncology(腫瘤學(xué)年報(bào)）14:520-535(2003))。例如，來(lái)自小鼠單克隆抗體的基 因的可變⑴區(qū)段可以連接至人恒定（C)區(qū)段。因此，典型的嵌合抗體是由來(lái)自小鼠抗體 的V或抗原結(jié)合域和來(lái)自人抗體的C或效應(yīng)子區(qū)域組成的雜蛋白。
[0126] 人源化抗體具有基本上來(lái)自人抗體（稱為受體抗體）的可變區(qū)框架殘基和基本 上來(lái)自小鼠抗體（稱為供體免疫球蛋白）的互補(bǔ)決定區(qū)。參見Queen(昆）等人Proc. NatL. Acad. Sci. USA (美國(guó)科學(xué)院院刊）86:10029-10033 (1989)和 TO90/07861、美國(guó)專利 號(hào)5, 693, 762、美國(guó)專利號(hào)5, 693, 761、美國(guó)專利號(hào)5, 585, 089、美國(guó)專利號(hào)5, 530, 101以及 Winter (溫特），美國(guó)專利號(hào)5, 225, 539。如果存在，這一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)還基本上或完全 來(lái)自人免疫球蛋白。除了其他來(lái)源，可以使用具有人免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠（Lonberg(朗 伯格）等人，WO 93/12227 (1993))，通過(guò)常規(guī)雜交瘤方法、噬菌體展示（參見例如Dower (道 爾）等人，WO 91/17271和McCafferty (麥卡弗蒂）等人，WO 92/01047)獲得抗體。編碼免 疫球蛋白鏈的核酸可以獲得自產(chǎn)生抗體的雜交瘤或細(xì)胞系，或基于公開的文獻(xiàn)中的免疫球 蛋白核酸或氨基酸序列。
[0127] 希望的細(xì)胞因子的其他拮抗劑還可以用于治療目標(biāo)。例如，可以用于本發(fā)明的目 標(biāo)的一類拮抗劑是細(xì)胞因子受體的可溶形式。僅出于說(shuō)明性目的，IL-6拮抗劑是特異性結(jié) 合IL-6的抗-IL-6抗體。特異性抗體具有全身地抑制或?qū)笽L-6的作用的能力。在一些 實(shí)施方式中，抗體結(jié)合IL-6并且防止它與它的受體（例如IL-6Ra或IL-6R0 )相互作用 或激活這些受體。在一些實(shí)施方式中，可以通過(guò)使用針對(duì)白介素-6受體（IL-6R)的拮抗劑 來(lái)對(duì)抗IL-6的活性。美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?006251653描述了用于治療白介素-6相關(guān)疾病的方法 并且披露了多個(gè)白介素-6拮抗劑，包括例如人源化抗-IL-6R抗體和嵌合抗-IL-6R抗體。 在一些實(shí)施方式中，IL-6或IL-6R衍生物可以用于阻斷并且對(duì)抗IL-6/IL-6R之間的相互 作用。
[0128] 本發(fā)明并不局限于在此描述的這些細(xì)胞因子和它們的對(duì)應(yīng)的激動(dòng)劑和抑制劑。而 是，本發(fā)明包括使用任何用于本領(lǐng)域的細(xì)胞因子激動(dòng)劑和/或抑制劑，以調(diào)制細(xì)胞因子。這 是因?yàn)楸景l(fā)明基于在接受本發(fā)明的CAR T細(xì)胞輸注的患者中管理癌癥治療，其中輸注的CAR T細(xì)胞導(dǎo)致增加和降低水平的不同細(xì)胞因子。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員基于在此呈現(xiàn)的披露內(nèi) 容：與對(duì)照樣品相比，T細(xì)胞輸注后樣品中細(xì)胞因子的差示表達(dá)水平可以被靶向用于治療， 以便使細(xì)胞因子水平增加或降低至正常水平。
[0129] 治療應(yīng)用
[0130] 本發(fā)明涵蓋轉(zhuǎn)導(dǎo)了慢病毒載體（LV)的細(xì)胞（例如T細(xì)胞）。例如，LV編碼組合特 異性抗體的抗原識(shí)別域與CD3- G、CD28、4-1BB或它們的任何組合的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的CAR。 因此，在一些實(shí)例中，轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞可以引起CAR介導(dǎo)的T-細(xì)胞反應(yīng)。
[0131] 本發(fā)明提供了 CAR用來(lái)將初始T細(xì)胞的特異性重新定向至腫瘤抗原的用途。因此， 本發(fā)明還提供了用于刺激T細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，用來(lái)在哺乳動(dòng)物中靶向細(xì)胞群體或組 織的方法，該方法包括將表達(dá)CAR的T細(xì)胞給予至哺乳動(dòng)物的步驟，其中CAR包括與預(yù)先確 定的靶特異性相互作用的結(jié)合部分、包括例如人CD3G的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的G鏈部分、和共 刺激信號(hào)傳遞區(qū)。
[0132] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括一個(gè)類型的細(xì)胞治療，其中遺傳修飾T細(xì)胞，以表 達(dá)CAR，并且將CAR T細(xì)胞輸注到對(duì)其有需要的接受者中。輸注的細(xì)胞能夠殺死接受者中的 腫瘤細(xì)胞。不像抗體治療，CAR T細(xì)胞能夠在體內(nèi)復(fù)制，導(dǎo)致長(zhǎng)期的持久性，該持久性導(dǎo)致 持續(xù)的腫瘤控制。
[0133] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的CAR T細(xì)胞可以經(jīng)歷在體內(nèi)強(qiáng)大的T細(xì)胞表達(dá)，并且 可以持續(xù)延長(zhǎng)量的時(shí)間。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的CAR T細(xì)胞演化為特異性記憶T 細(xì)胞，這些特異性記憶T細(xì)胞可以再激活，以抑制任何額外的腫瘤形成或生長(zhǎng)。例如，出乎 意料的是，本發(fā)明的CART19細(xì)胞可以經(jīng)歷體內(nèi)強(qiáng)大的T細(xì)胞擴(kuò)張，并且在血液和骨髓中以 高水平持續(xù)延長(zhǎng)量的時(shí)間，并且形成特異性記憶T細(xì)胞。不希望受任何具體理論約束，當(dāng)遇 到并且隨后消除表達(dá)替代抗原的靶細(xì)胞時(shí)，CAR T細(xì)胞可以在體內(nèi)分化為中心記憶樣狀態(tài)。
[0134] 不希望受任何具體理論約束，由CAR-修飾的T細(xì)胞引起的抗腫瘤免疫反應(yīng)可以 是主動(dòng)的或被動(dòng)的免疫反應(yīng)。此外，CAR介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可以是過(guò)繼性免疫治療方法，其中 CAR-修飾的T細(xì)胞誘導(dǎo)特異性針對(duì)CAR中的抗原結(jié)合部分的免疫反應(yīng)。例如，CART19細(xì)胞 引起特異性針對(duì)表達(dá)CD19的細(xì)胞的免疫反應(yīng)。
[0135] 盡管在此披露的數(shù)據(jù)確切地披露了包含源自FMC63鼠單克隆抗體的 抗-^198(^￥、人^8€[鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域、以及人4-188和^3 6信號(hào)傳導(dǎo)域的慢病毒載 體，但是本發(fā)明不應(yīng)被解釋為包括針對(duì)如在本文的其他地方描述的構(gòu)建體的多個(gè)組分的每 一個(gè)的任何數(shù)量的變化。即，本發(fā)明包括使用CAR中任何抗原結(jié)合部分，以產(chǎn)生特異性針對(duì) 該抗原結(jié)合部分的CAR-介導(dǎo)的T-細(xì)胞反應(yīng)。例如，出于治療癌癥的目的，本發(fā)明的CAR中 的抗原結(jié)合部分可以靶向腫瘤抗原。
[0136] 可以治療的癌癥包括未血管化的、或基本上仍未血管化的腫瘤，連同血管化的腫 瘤。癌癥可以包括非實(shí)體瘤（例如血液學(xué)腫瘤，例如白血病和淋巴瘤）或可以包括實(shí)體瘤。 要用本發(fā)明的CAR治療的癌癥的類型包括但不局限于惡性腫瘤（carcinoma)、母細(xì)胞瘤、和 肉瘤，以及某些白血病或淋巴的惡性腫瘤（malignancies)，良性的和惡性的腫瘤，以及惡性 腫瘤（malignancies)，例如肉瘤、惡性腫瘤（carcinomas)和黑色素瘤。還包括成體腫瘤/ 癌癥和幼體腫瘤/癌癥。
[0137] 血液學(xué)癌癥是血液或骨髓的癌癥。血液學(xué)的（或血源性的）癌癥包括白血病，白 血病包括急性白血?。ɡ缂毙粤馨图?xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞性白血病、急性骨髓性白血 病和成髓細(xì)胞白血病、前髓細(xì)胞性白血病、粒-單核細(xì)胞型白血病、單核細(xì)胞性白血病以及 紅白血?。园籽。ɡ缏运杓?xì)胞性（粒細(xì)胞的）白血病、慢性骨髓性白血病、和慢 性淋巴細(xì)胞白血病），真性紅細(xì)胞增多癥，淋巴瘤，霍奇金氏病，非何杰金氏淋巴瘤（頑固并 且高級(jí)的形式），多發(fā)性骨髓瘤，沃爾丹斯特倫氏巨球蛋白血癥，重鏈病，骨髓增生異常綜合 癥，多毛細(xì)胞白血病以及骨髓增生異常。
[0138] 實(shí)體瘤是通常并不包含囊腫或液體區(qū)域的組織的異常包塊。實(shí)體瘤可以是良性 的或惡性的。針對(duì)形成它們的細(xì)胞類型，命名了不同類型的實(shí)體瘤（例如肉瘤、惡性腫瘤 (carcinomas)、和淋巴瘤）。實(shí)體瘤（例如肉瘤和惡性腫瘤（carcinomas))的示例包括纖維 肉瘤，含有粘液瘤組織的肉瘤，脂肉瘤，軟骨肉瘤，骨肉瘤，和其他肉瘤，滑膜瘤，間皮瘤，尤 因氏瘤，平滑肌肉瘤，橫紋肌肉瘤，結(jié)腸癌，淋巴惡性腫瘤，胰腺癌，乳癌，肺癌，卵巢癌，前列 腺癌，肝細(xì)胞癌，鱗狀細(xì)胞癌，基底細(xì)胞癌，腺癌，汗腺癌，甲狀腺髓樣癌，乳頭狀甲狀腺癌， 嗜鉻細(xì)胞瘤，皮脂腺癌，乳頭狀癌，睪丸網(wǎng)乳頭狀腺癌，髓樣癌，支氣管癌，腎細(xì)胞癌，肝癌， 膽管癌，絨毛膜癌，維爾姆斯氏腫瘤，宮頸癌，睪丸腫瘤，精原細(xì)胞瘤，膀胱癌，黑色素瘤，以 及CNS腫瘤（例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤（例如腦干膠質(zhì)瘤和混合型膠質(zhì)瘤），成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤（也 稱為多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤）星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤，CNS淋巴瘤，生殖細(xì)胞瘤，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤， 神經(jīng)鞘瘤，顱咽管瘤，室管膜瘤，松果體瘤，成血管細(xì)胞瘤，聽神經(jīng)瘤，少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤，髓膜 瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和腦轉(zhuǎn)移）。
[0139] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的CAR的抗原結(jié)合部分的部分被設(shè)計(jì)為用來(lái)治療具體 的癌癥。例如，被設(shè)計(jì)為革G向CD19的CAR可以用來(lái)治療癌癥和失調(diào)，這些癌癥和失調(diào)包括 但不局限于前體B ALL (幼體適應(yīng)癥）、成體ALL、套細(xì)胞淋巴瘤、彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤、搶 救后異基因骨髓移植、等。
[0140] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，CAR可以被設(shè)計(jì)為靶向CD22,以治療彌散性大B細(xì)胞淋巴 瘤。
[0141] 在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥和失調(diào)包括但不局限于前體-B ALL(幼體適應(yīng)癥）、成 體ALL、套細(xì)胞淋巴瘤、彌散性大B-細(xì)胞淋巴瘤、搶救后異基因骨髓移、等，可以使用靶向 ⑶19、⑶20、⑶22的CAR和RORl的組合對(duì)它們進(jìn)行治療。
[0142] 在一個(gè)實(shí)施方式中，CAR可以被設(shè)計(jì)為靶向間皮素，以治療間皮瘤、胰腺癌、卵巢 癌、等。
[0143] 在一個(gè)實(shí)施方式中，CAR可以被設(shè)計(jì)為靶向⑶33/IL3Ra，以治療急性骨髓性白血 病等。
[0144] 在一個(gè)實(shí)施方式中，CAR可以被設(shè)計(jì)為靶向c-Met，以治療三陰性乳癌、非小細(xì)胞 肺癌、等。
[0145] 在一個(gè)實(shí)施方式中，CAR可以被設(shè)計(jì)為靶向PSMA，以治療前列腺癌等。
[0146] 在一個(gè)實(shí)施方式中，CAR可以被設(shè)計(jì)為靶向糖脂F(xiàn)77,以治療前列腺癌等。
[0147] 在一個(gè)實(shí)施方式中，CAR可以被設(shè)計(jì)為靶向EGFRvIII，以治療成膠質(zhì)細(xì)胞瘤等。
[0148] 在一個(gè)實(shí)施方式中，CAR可以被設(shè)計(jì)為靶向⑶-2,以治療成神經(jīng)細(xì)胞瘤、黑色素 瘤、等。
[0149] 在一個(gè)實(shí)施方式中，CAR可以被設(shè)計(jì)為靶向NY-ES0-1TCR，以治療骨髓瘤、肉瘤、黑 色素瘤、等。
[0150] 在一個(gè)實(shí)施方式中，CAR可以被設(shè)計(jì)為靶向MAGE A3TCR，以治療骨髓瘤、肉瘤、黑色 素瘤、等。
[0151] 然而，本發(fā)明不應(yīng)被解釋為僅局限于在此披露的抗原靶和疾病。而是，本發(fā)明應(yīng)被 解釋為包括與一種疾病關(guān)聯(lián)的任何抗原性靶，其中CAR可以被用來(lái)治療該疾病。
[0152] 本發(fā)明的CAR介導(dǎo)的T細(xì)胞還可以用作一個(gè)類型的疫苗，用于哺乳動(dòng)物中的先體 外后體內(nèi)免疫和/或體內(nèi)治療。優(yōu)選地，該哺乳動(dòng)物是人。
[0153] 關(guān)于離體免疫，在給予細(xì)胞進(jìn)入哺乳動(dòng)物之前，在體外發(fā)生以下項(xiàng)中的至少一個(gè)： i)這些細(xì)胞的擴(kuò)張，ii)將編碼CAR的核酸引入這些細(xì)胞，和/或iii)這些細(xì)胞的冷凍保 存。
[0154] 離體程序是本領(lǐng)域熟知的，并且將在以下更充分地討論。簡(jiǎn)要地，從哺乳動(dòng)物（優(yōu) 選是人）分離細(xì)胞，并且用表達(dá)在此披露的CAR的載體進(jìn)行遺傳修飾（即體外轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn) 染）?？梢詫AR-修飾的細(xì)胞給予至哺乳動(dòng)物接受者，以提供治療益處。哺乳動(dòng)物接受者 可以是人，并且CAR-修飾的細(xì)胞可以相對(duì)于該接受者是自體的?？蛇x地，這些細(xì)胞相對(duì)于 該接受者是異源的、同系的或異種的。
[0155] 用于造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的離體擴(kuò)張的程序描述于美國(guó)專利號(hào)5, 199, 942中，通 過(guò)引用將其結(jié)合于此，可以適用于本發(fā)明的細(xì)胞。其他適合的方法是本領(lǐng)域已知的，并且因 此本發(fā)明并不局限于細(xì)胞的離體擴(kuò)張的任何具體方法。簡(jiǎn)要地，T細(xì)胞的離體培養(yǎng)和擴(kuò)張 包括：（1)從哺乳動(dòng)物，從周圍血液收集物或骨髓外植體收集CD34+造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞； 以及（2)離體擴(kuò)張此類細(xì)胞。除了美國(guó)專利號(hào)5, 199, 942中描述的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，其他因 子，例如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配體可以被用于培養(yǎng)和擴(kuò)張這些細(xì)胞。
[0156] 除了在離體免疫方面使用基于細(xì)胞的疫苗，本發(fā)明還提供了用于體內(nèi)免疫的組合 物和方法，以引起針對(duì)患者中的抗原的免疫反應(yīng)。
[0157] 一般而言，如在此所述激活并且擴(kuò)張的細(xì)胞可以用于治療和預(yù)防免疫受損的個(gè)體 中出現(xiàn)的疾病。具體地，本發(fā)明的CAR-修飾的T細(xì)胞被用于治療CCL。在某些實(shí)施方式中， 本發(fā)明的細(xì)胞被用于治療具有發(fā)展CCL的風(fēng)險(xiǎn)的患者。因此，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù) 防CCL的方法，該方法包括對(duì)其有需要的受試者一個(gè)治療有效量的本發(fā)明的CAR-修飾的T 細(xì)胞。
[0158] 可以單獨(dú)給予本發(fā)明的CAR-修飾的T細(xì)胞，或與稀釋劑和/或與其他組分，例如 IL-2或其他細(xì)胞因子或細(xì)胞群體組合，作為藥物組合物給予本發(fā)明的CAR-修飾的T細(xì)胞。 簡(jiǎn)要地，本發(fā)明的藥物組合物可以包括如在此所述的靶細(xì)胞群體，與一種或多種藥學(xué)上或 生理學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑組合。此類組合物可以包括緩沖液，例如中性緩 沖鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋 白；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑，例如EDTA或谷胱甘肽；輔助劑（例如氫 氧化鋁）；以及防腐劑。優(yōu)選配制本發(fā)明的組合物用于靜脈給予。
[0159] 可以按適合待治療的（或待預(yù)防的）疾病的方式，給予本發(fā)明的藥物組合物。給 予的量和頻率將由以下因素決定，例如患者的病癥、患者的疾病的類型和嚴(yán)重程度，雖然可 以通過(guò)臨床試驗(yàn)確定適當(dāng)?shù)膭┝俊?br> [0160] 當(dāng)表明"免疫有效量"、"抗腫瘤有效量"、"腫瘤抑制有效量"、或"治療量"時(shí)，可以 由醫(yī)師考慮患者（受試者）的年齡、體重、腫瘤尺寸、感染或轉(zhuǎn)移的程度、和病癥的個(gè)體差 異，確定待給予的本發(fā)明的組合物的明確的量?？梢源篌w上闡明的是，可以按以下劑量：1〇4至IO9個(gè)細(xì)胞/kg體重、優(yōu)選10 5至10 6個(gè)細(xì)胞/kg體重（包括那些范圍內(nèi)的整數(shù)值），給 予包含在此所述的T細(xì)胞的藥物組合物。還可以按這些劑量，多次給予T細(xì)胞組合物?？?以通過(guò)使用免疫治療中通常已知的輸注技術(shù)，可以這些細(xì)胞（參見例如Rosenberg (羅森伯 格）等人，New Eng. J. of Med.(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志）319:1676,1988)。可以通過(guò)監(jiān)測(cè)患者 的疾病病征并且因此調(diào)整治療，由醫(yī)藥領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易地確定用于具體患者的最 佳劑量和治療方案。
[0161] 在某些實(shí)施方式中，可能希望給予激活的T細(xì)胞至受試者，并且隨后重新抽血（或 進(jìn)行血液成分分離），根據(jù)本發(fā)明激活其中的T細(xì)胞，并且用這些激活并且擴(kuò)張的T細(xì)胞 重新輸注患者。可以每數(shù)個(gè)星期，進(jìn)行這一過(guò)程多次。在某些實(shí)施方式中，可以從IOcc至 400cc的抽取血液中激活T細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，可以從20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、 70(^、80(^、90(^、或100(^的抽取血液中激活1'細(xì)胞。不受理論約束，使用這一多次抽血/ 多次重新輸注實(shí)驗(yàn)方案可以用于選擇出某些群體的T細(xì)胞。
[0162] 可以按任何方便的方式進(jìn)行受試者組合物的給予，包括通過(guò)噴霧、注射、攝食、輸 液、植入或移植。可以將在此描述的組合物皮下地、皮內(nèi)地、瘤內(nèi)地、結(jié)內(nèi)地、髓內(nèi)地、肌內(nèi) 地、通過(guò)靜脈內(nèi)（i.v.)注射、或腹膜內(nèi)地給予至患者。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)皮內(nèi)注射或 皮下注射，將本發(fā)明的T細(xì)胞組合物給予至患者。在另一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選通過(guò)i.v.注 射，給予本發(fā)明的T細(xì)胞組合物。可以將T細(xì)胞組合物直接注射進(jìn)腫瘤、淋巴結(jié)、或感染部 位。
[0163] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，使用在此描述的方法，或本領(lǐng)域已知的其他方法激 活和擴(kuò)張細(xì)胞，其中擴(kuò)張 T細(xì)胞至治療水平，并且結(jié)合（例如在之前、同時(shí)或之后）任何 數(shù)量的相關(guān)治療方式給予至患者，這些相關(guān)治療方式包括但不局限于用藥劑治療，例如抗 病毒治療、西多福韋和白介素-2、阿糖胞苷（也稱為ARA-C)或用于MS患者的那他珠單抗 治療或用于銀肩病患者的依法珠單抗治療或用于PML患者的其他治療。在另外的實(shí)施方 式中，可以與化療，放射，免疫抑制劑（例如環(huán)孢霉素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和 FK506)，抗體或其他免疫消融藥劑（例如CAM PATH、抗-CD3抗體或其他抗體治療），細(xì)胞 毒素，氟達(dá)拉濱，環(huán)孢霉素，F(xiàn)K506,拉珀霉素，霉酚酸，留類，F(xiàn)R901228,細(xì)胞因子，以及輻射 組合，使用本發(fā)明的T細(xì)胞。這些藥物抑制鈣依賴性磷酸酶calCineurin(鈣調(diào)神經(jīng)磷酸 酶）（環(huán)孢霉素和FK506)，抑或抑制對(duì)于生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的信號(hào)傳遞而言重要的p70S6激酶 (拉珀霉素）（1^11(劉）等人，〇611(細(xì)胞）66:807-815，1991;他11(16^〇11(亨德森）等人， Immun.(免疫學(xué)）73:316-321，1991 ;Bierer (比勒）等人，Curr. Opin. Immun.(免疫學(xué)新觀 點(diǎn)）5:763-773,1993)。在另外的實(shí)施方式中，結(jié)合（例如在之前、同時(shí)或之后）骨髓移植、 使用任一化療劑（例如氟達(dá)拉濱）的T細(xì)胞消融治療、外束放射治療（XRT)、環(huán)磷酰胺、或 抗體（例如0KT3或CAMPATH)，將本發(fā)明的細(xì)胞組合物給予至患者。在另一個(gè)實(shí)施方式中， 在B-細(xì)胞消融治療，例如與CD20反應(yīng)的藥劑，例如美羅華之后，給予本發(fā)明的細(xì)胞組合物。 例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，受試者可以經(jīng)歷標(biāo)準(zhǔn)治療，其中高劑量化療之后是外周血干細(xì)胞 移植。在某些實(shí)施方式中，在移植后，受試者接受本發(fā)明的擴(kuò)張的免疫細(xì)胞的輸注。在一個(gè) 額外的實(shí)施方式中，在外科手術(shù)之前或之后給予擴(kuò)張的細(xì)胞。
[0164] 待給予至患者的以上治療的劑量將隨正治療的病癥的明確性質(zhì)和治療的接受者 而變化?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域習(xí)慣做法進(jìn)行用于人類給予的劑量的縮放。例如對(duì)于成體患者， CAMPATH的劑量一般在1至約IOOmg的范圍內(nèi)，通常每天給予，持續(xù)1和30天之間的一個(gè)時(shí) 期。優(yōu)選的每天劑量是每天1至l〇mg，雖然在一些實(shí)例中，可以使用高達(dá)40mg每天的更大 劑量（描述于美國(guó)專利號(hào)6, 120, 766中）。
[0165] 細(xì)朐閔子釋放綜合征（CRS)的治療
[0166] 本發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)：CART19細(xì)胞的體內(nèi)增殖和與其關(guān)聯(lián)的強(qiáng)力抗腫瘤活 性還與導(dǎo)致嗜血細(xì)胞性淋巴組織增生癥（HLH)(也稱為巨噬細(xì)胞活化綜合征（MAS))的CRS 關(guān)聯(lián)。不希望受任何具體理論約束，認(rèn)為MAS/HLH是與CART19強(qiáng)力抗腫瘤活性關(guān)聯(lián)的并且 可能是該活性所需的獨(dú)特生物標(biāo)記。
[0167] 因此，本發(fā)明提供了包括給予本發(fā)明的CAR進(jìn)入患者的第一線的治療，和包括給 予一個(gè)類型的治療的第二線的治療，以管理生成自使用CAR T細(xì)胞的第一線的治療的提高 的水平的某些可溶性因子。
[0168] 在一個(gè)實(shí)施方式中，第二線的治療包括用于治療CRS的組合物和方法。CRS的癥狀 包括高燒、惡心、暫時(shí)的低血壓、低氧、等。本發(fā)明基于以下觀察：CART19細(xì)胞誘導(dǎo)患者中提 高水平的可溶性因子，包括但不局限于IFN-y、TNFa、IL-2和IL-6。因此，第二線的治療 包括針對(duì)生成自給予CART19細(xì)胞的提高的細(xì)胞因子，用于中和這些作用的化合物和方法。 在一個(gè)實(shí)施方式中，中和劑能夠抵消細(xì)胞因子表達(dá)/活性的不希望的一致爆發(fā)，并且因此 對(duì)預(yù)防、改善和治療與CART19治療關(guān)聯(lián)的CRS是有用的。
[0169] 在一個(gè)實(shí)施方式中，在CART19細(xì)胞輸注后約第10-12天進(jìn)行CRS的治療。
[0170] 在一個(gè)實(shí)施方式中，第二線的治療包括給予一種留體至患者。在另一個(gè)實(shí)施方式 中，第二線的治療包括給予更多的甾體、TNFa的抑制劑、和IL-6的抑制劑中的一種或多 種。TNFa抑制劑的示例是依那西普。IL-6抑制劑的示例是塔西單抗（toe)。
[0171] 實(shí)驗(yàn)實(shí)施例
[0172] 進(jìn)一步參考以下實(shí)驗(yàn)實(shí)施例來(lái)詳細(xì)描述本發(fā)明。僅出于說(shuō)明的目的提供這些實(shí)施 例，并不旨在是限制性的，除非另外說(shuō)明。因此，本發(fā)明絕不應(yīng)理解為局限于以下實(shí)施例，而 是應(yīng)解釋為涵蓋由于在此提供的傳授內(nèi)容而變得明顯的任何和所有變化。
[0173] 不做進(jìn)一步描述，認(rèn)為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以使用以上描述和以下說(shuō)明性實(shí)施 例，制造并且利用本發(fā)明的化合物并且實(shí)踐所要求的方法。因此，以下工作實(shí)施例確切地指 出了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并且不被解釋為以任何方式限制本披露的剩余部分。
[0174] 實(shí)施例1 :與CAR T細(xì)朐輸注組合的細(xì)朐閔子治療
[0175] 在此呈現(xiàn)的結(jié)果證明，在輸注CAR T細(xì)胞后，患者顯示出差示表達(dá)水平的不同細(xì)胞 因子。在一些實(shí)例中，提高水平的一些細(xì)胞因子是由于輸注的CAR T細(xì)胞的毒性（圖1)。 觀察到塔西單抗（抗-IL6)可以改善多個(gè)CAR的毒性，并且表面上地保護(hù)了 2個(gè)患者中全 部2人中的抗腫瘤作用（圖2)。不希望受任何具體理論約束，認(rèn)為阿那白滯素和阻斷IL-I 的其他試劑在這方面也可以是有用的。在此呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)還證明IL-I在患者中提高，并且這 會(huì)導(dǎo)致稍后IL-6升高。阿那白滯素是與ILl受體結(jié)合的并且阻斷IL-Ia和0信號(hào)傳遞 這二者的IL-IRa重組蛋白。阿那白滯素具有短的1/2壽命。有利的是使用阿那白滯素來(lái) 開始治療患者，因?yàn)镮L-Ia和0都會(huì)被阻斷，并且還減輕了細(xì)胞因子風(fēng)暴，并且保持抗腫 瘤作用。
[0176] 還觀察到，如通過(guò)穿孔素和IFN-y測(cè)量，抗體干預(yù)并不賦予CART19細(xì)胞功能性 (圖 3)。
[0177] 實(shí)施例2 :CD19_重宙向的嵌合抗原#體T(CART19)細(xì)朐誘導(dǎo)細(xì)朐閔子釋放綜合征 (CRS)以及可以由IL-6桔抗劑塔西單抗（toe)管理的可治療的巨噬細(xì)朐活化綜合征（MAS) 的誘導(dǎo)
[0178] CART19細(xì)胞的輸注導(dǎo)致體內(nèi)100至100, OOOx的增殖，腫瘤溶解綜合征，隨后是持 久的抗腫瘤活性，以及在患有B細(xì)胞腫瘤的患者中的延長(zhǎng)的持久性。在此呈現(xiàn)的這些結(jié)果 證明，CART19細(xì)胞的體內(nèi)增殖和由此而來(lái)的強(qiáng)力抗腫瘤活性與導(dǎo)致嗜血細(xì)胞性淋巴組織增 生癥（HLH)(也稱為MAS)的CRS關(guān)聯(lián)。不希望受任何具體理論約束，認(rèn)為MAS/HLH是與強(qiáng) 力抗腫瘤活性關(guān)聯(lián)的并且可能是該活性所需的獨(dú)特生物標(biāo)記。
[0179] 將由抗⑶19scFv/4_lBB/⑶3-G組成的CAR用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)自體的T細(xì)胞，將這些T 細(xì)胞用抗-CD3/抗CD28珠粒離體激活/擴(kuò)張，并且然后在2-8次先前治療后，用這些T細(xì) 胞輸注進(jìn)患有持久的疾病的ALL或CLL患者。還在具有高水平的人ALL/人T細(xì)胞移植的 異種移植小鼠模型中將CART19抗ALL活性建模，并且使用2色生物發(fā)光成像同時(shí)檢測(cè)CAR T細(xì)胞和ALL。
[0180] 在此呈現(xiàn)的結(jié)果提供了接受CART19細(xì)胞的10個(gè)患者的更新結(jié)果，這10個(gè)患者包 括9個(gè)患有CLL的患者和患有復(fù)發(fā)難治的ALL的1個(gè)幼體患者。6/9的可評(píng)價(jià)患者具有完 全恢復(fù)（CR)或部分恢復(fù)（PR)，包括4個(gè)持續(xù)的CR。盡管不存在急性輸注毒性，但是所有響 應(yīng)的患者還是發(fā)展了 CRS。都患有高燒，連同3或4級(jí)的低血壓/低氧。CRS之后是CART19 細(xì)胞的峰值血液表達(dá)，并且然后是強(qiáng)度增加，直至CART19細(xì)胞峰值（輸注后D10-31)。ALL 患者經(jīng)歷了最顯著的毒性，具有4級(jí)低血壓和呼吸衰竭。在D6的留體治療并未導(dǎo)致改善。 在D9，TNFa和IL-6的值得注意的高水平（基線上方的峰值增加：IFNy在6040x ;IL-6在 988x ; IL-2R在56x，IL-2在163x和TNF a在17x)，給予TNF a和IL-6拮抗劑（依那西普 和toe)。這導(dǎo)致在12hr內(nèi)發(fā)燒和低血壓的解決，以及從呼吸機(jī)支持迅速切斷至房間空氣。 這些干預(yù)對(duì)CART19細(xì)胞表達(dá)或功效：發(fā)生在Dll上的CAR T峰值（2539個(gè)CAR+細(xì)胞/uL ; 通過(guò)流動(dòng)77%的CD3細(xì)胞）沒有明顯影響，并且與示出65 %母細(xì)胞的她的初始研宄骨髓相 比，D23骨髓示出具有陰性最小殘留疾?。∕RD)的CR。雖然她沒有CNS ALL病史，但是脊液 示出可檢測(cè)的CART19細(xì)胞（21個(gè)淋巴細(xì)胞/mcL ;78% CAR+)。在輸注后4mo,這一患者仍 然在CR中，其中在血液中是17個(gè)CART19細(xì)胞/uL，并且在骨髓中是31 % CAR+⑶3細(xì)胞。
[0181] 隨后的響應(yīng)患者的臨床評(píng)定不出都具有MAS/HLH的證據(jù)，包括鐵蛋白的提尚和 HLH的組織學(xué)證據(jù)。峰值鐵蛋白水平范圍是從44, 00至605, 000,之后并且繼續(xù)是峰值T細(xì) 胞增殖。其他一致的發(fā)現(xiàn)包括與疾病和中度DIC無(wú)關(guān)的迅速發(fā)作的肝脾腫大。
[0182] 隨后地，3個(gè)CLL患者還已經(jīng)用toe治療，還快速并且驚人地解決了高燒、低血壓 和低氧。一個(gè)患者在DlO接受了 toc，并且伴隨CART19擴(kuò)張，達(dá)到了 CR。另一個(gè)患者在第 9天的toe給予后，迅速解決了 CRS，并且對(duì)反應(yīng)的隨訪太短。第三個(gè)CLL患者在D3接受了 toc，針對(duì)早期發(fā)燒，并且不具有CART-19增殖，也沒有反應(yīng)。
[0183] 為了給細(xì)胞因子的阻斷的時(shí)間測(cè)量建模，建立了使用生物發(fā)光原發(fā)性幼體ALL的 異種移植物，并且然后用來(lái)自臨床制造的另外的細(xì)胞進(jìn)行治療。CART19細(xì)胞增殖并且導(dǎo) 致延長(zhǎng)的存活。在T細(xì)胞輸注前，用toe進(jìn)行了細(xì)胞因子阻斷，和/或依那西普用輸注的 CART19細(xì)胞的更少體內(nèi)增殖消除了疾病對(duì)照，證實(shí)了在給予早期toe (D3)的一個(gè)患者中看 到的結(jié)果。
[0184] CART19T細(xì)胞可以產(chǎn)生大量體內(nèi)擴(kuò)張、長(zhǎng)期持久性、以及抗腫瘤功效，但是還誘導(dǎo) 了具有暗示迅速響應(yīng)細(xì)胞因子阻斷的MAS/HLH的特征的顯著CRS。在顯著CART19增殖的啟 動(dòng)前給予，TNFa和/或IL-6的阻斷可以干擾增殖和效應(yīng)子功能，但是如果在細(xì)胞增殖進(jìn) 行中的一個(gè)點(diǎn)給予，則toe可以改善已經(jīng)觀察到與強(qiáng)大的臨床反應(yīng)關(guān)聯(lián)的癥狀。
[0185] 實(shí)施例3用嵌合抗原#體表汰T細(xì)朐緩和ALL ：
[0186] 在此呈現(xiàn)的結(jié)果證明，在急性淋巴細(xì)胞白血病中（ALL)，CAR T細(xì)胞具有臨床活 性。簡(jiǎn)要地，用轉(zhuǎn)導(dǎo)了抗⑶19抗體和T-細(xì)胞信號(hào)傳遞分子的IO6至10 7個(gè)/kg的T細(xì)胞 (CTL019CAR T細(xì)胞；也稱為CART19)治療患有復(fù)發(fā)并且難治的前體-B細(xì)胞ALL的兩個(gè)幼 體患者。在全部?jī)蓚€(gè)患者中，CTL019T細(xì)胞擴(kuò)張了多于1000倍，并且送至骨髓。此外，CAR T細(xì)胞能夠跨越血腦屏障，并且如在腦脊液中測(cè)量，以高水平持續(xù)至少6個(gè)月。注意到八個(gè) 嚴(yán)重的不良事件。全部?jī)蓚€(gè)患者都發(fā)展了細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS)和B細(xì)胞發(fā)育不全。 在一個(gè)兒童中，CRS是嚴(yán)重的，并且在逆轉(zhuǎn)該綜合征中，用依那西普和塔西單抗的細(xì)胞因子 阻斷是有效的，并且仍未阻止CAR T細(xì)胞擴(kuò)張和抗白血病功效。在全部?jī)蓚€(gè)患者中都觀察 到完全緩和，并且在治療后9個(gè)月時(shí)，在一個(gè)患者中病情不間斷。在治療后約2個(gè)月，另一 個(gè)患者復(fù)發(fā)，其中母細(xì)胞不再表達(dá)CD19。
[0187] 在此呈現(xiàn)的結(jié)果證明，CAR修飾的T細(xì)胞能夠在體內(nèi)殺死甚至侵犯性的難治性急 性白血病細(xì)胞。不再表達(dá)靶的腫瘤細(xì)胞的出現(xiàn)表明，在一些患有ALL的患者中，除了⑶19， 需要靶向其他分子。
[0188] 如已經(jīng)報(bào)道（Porter(波特）等人，2011，N Engl J Med(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜 志）365:725-33 ;Kalos(卡洛斯）等人，2011，Science Translational Medicine(科學(xué)轉(zhuǎn)化 醫(yī)學(xué)）3:95ra73)，在患有CLL的3個(gè)患者中，CTL019(CART19)細(xì)胞的體內(nèi)表達(dá)和強(qiáng)大的抗 白血病作用。CTL019是包括⑶137 (4-1BB)信號(hào)傳導(dǎo)域的CAR，并且使用慢病毒載體技術(shù)對(duì) 其進(jìn)行表達(dá)（Milone (米龍）等人，1009, Mol Ther (分子治療）17:1453-64)。在此呈現(xiàn)的 結(jié)果證明，在2個(gè)患有難治并且復(fù)發(fā)的ALL的幼體患者中，CTL019的用途。全部?jī)蓚€(gè)患者都 具有白血病的緩和，伴隨送至骨髓和CNS的體內(nèi)CTL019的強(qiáng)大表達(dá)。抗白血病作用是強(qiáng)力 的，因?yàn)榛颊呋加谢熾y治的疾病，阻礙了異源供體干細(xì)胞移植，并且另一個(gè)患者在異源臍 帶血移植后復(fù)發(fā)，并且對(duì)blinatumomab (-種藥物）（嵌合的雙特異性抗-⑶3和抗-⑶19) 治療有抗性。
[0189] 現(xiàn)在描述在這些實(shí)驗(yàn)中采用的材料和方法。
[0190] 材料和方法
[0191] CART19
[0192] 先前已經(jīng)報(bào)道了 CTL019(CART19)生產(chǎn)（Porter (波特）等人，2011，N Engl J Med(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志）365:725-33 ;Kalos(卡洛斯）等人，2011 ,Science Translational Medicine(科學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)）3:95ra73)。如先前報(bào)道，在患者樣本中 檢測(cè)并且量化CTL019(Porter(波特）等人，2011，N Engl J Med(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜 志）365:725-33 ;Kalos(卡洛斯）等人，2011，Science Translational Medicine(科學(xué)轉(zhuǎn) 化醫(yī)學(xué)）3:95ra73)。
[0193] 樣品柚取和加工
[0194] 在淡紫色頂部vacutainer管（K2EDTA)或紅色頂部（無(wú)添加劑）vacutainer 管（Becton Dickinson公司）中收集樣品（周圍血液、骨髓）。在加工前，本質(zhì)上如所述 (Olson(奧爾森）等人，2011，J Transl Med(轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)雜志）9:26)，在抽取的2小時(shí)內(nèi) 將淡紫色頂部管遞送至實(shí)驗(yàn)室，或在保溫容器中，在室溫下發(fā)貨過(guò)夜。根據(jù)建立的實(shí)驗(yàn)室 S0P，在30分鐘內(nèi)加工樣品。如所述（Kalos (卡洛斯）等人，2011，Science Translational Medicine (科學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)）3:95ra73)，對(duì)周圍血液和骨髓單核細(xì)胞進(jìn)行純化、加工，并且儲(chǔ) 存在液氮中。在抽取2小時(shí)內(nèi)（包括凝固時(shí)間）加工紅色頂部管；通過(guò)離心分離血清，分裝 為單次使用的100 U L的等分部分，并且儲(chǔ)存在-80°C。在抽吸30分鐘內(nèi)將CSF遞送至實(shí)驗(yàn) 室，并且通過(guò)CSF流體的離心收集CSF中的細(xì)胞，并且對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行加工，用于DNA和流 式細(xì)胞術(shù)。
[0195] Q-PCR 分析
[0196] 在淡紫色頂部 BD vacutainer 管（K2EDTA) (Becton Dickinson 公司）中收集全血 和骨髓樣品。如所述（Kalos (卡洛斯）等人，2011 ,Science Translational Medicine (科 學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)）3:95ra73)，從全血直接分離基因組DNA，針對(duì)周圍血液和骨髓樣品，每個(gè)時(shí)間 點(diǎn)使用200ng基因組DNA，并且針對(duì)CSF樣品，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)使用18-21. 7ng基因組DNA，使用 ABI Taqman技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)證測(cè)定，大量進(jìn)行關(guān)于基因組DNA樣品的Q-PCR分析，以檢測(cè)整合的 ⑶19CAR轉(zhuǎn)基因序列。為了確定每單位DNA的拷貝數(shù)，產(chǎn)生8個(gè)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由插入IOOng 的非轉(zhuǎn)導(dǎo)的對(duì)照基因組DNA的5至IO6個(gè)拷貝的CTL019慢病毒質(zhì)粒組成。對(duì)于所有可量化 的值，用小于〇.95%的％ CV-式三份評(píng)價(jià)每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)（樣品、標(biāo)準(zhǔn)曲線），在3/3個(gè)重復(fù)中， 具有正的 Ct 值。如所述（Kalos (卡洛斯）等人，2011，Science Translational Medicine (科 學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)）3:95ra73)，使用來(lái)自周圍血液和骨髓的20ng輸入基因組DNA (對(duì)于CSF樣品 是2-4. 3ng)，以及特異性針對(duì)⑶KNlA基因上有的非轉(zhuǎn)錄基因組序列的引物/探針組合，進(jìn) 行平行擴(kuò)增反應(yīng)，以控制研宄的DNA的質(zhì)量。這些擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生了校正因子（CF)，以校正計(jì) 算的DNA輸入對(duì)比實(shí)際的DNA輸入。根據(jù)以下公式計(jì)算每微克DNA的轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)：從 每輸入DNA(ng)的CTL019標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的拷貝數(shù)X CF X 1000ng。由通過(guò)Q-PCR，量化輸 注的細(xì)胞產(chǎn)物的標(biāo)記的能力，確定這一測(cè)定的準(zhǔn)確度。對(duì)于CH0P-100,這些盲確定分別產(chǎn)生 了 11. 1%和11. 6%的Q-PCR值和流動(dòng)標(biāo)記值，以及分別是20. 0%和14. 4%，是CH0P-101 輸注產(chǎn)物的標(biāo)記。
[0197] 可溶件閔子分析
[0198] 在紅色（無(wú)添加劑）BD vacutainer管（Becton Dickinson公司）中收集全血，使 用建立的實(shí)驗(yàn)室SOP加工以獲得血清，分裝用于單次使用，并且儲(chǔ)存在-80°C。使用Luminex 珠粒測(cè)定技術(shù)，和從Life technologies公司（Invitrogen公司）購(gòu)買的試劑盒，進(jìn)行可 溶性細(xì)胞因子的因子的量化。按制造商實(shí)驗(yàn)方案，使用3倍稀釋系列產(chǎn)生9點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線， 用該標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測(cè)定。一式兩份評(píng)價(jià)2個(gè)外部標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，并且5個(gè)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)按照單倍；以 1:2稀釋，一式兩份評(píng)價(jià)所有樣品；針對(duì)兩份測(cè)量的計(jì)算的％ CV小于15%。用百分比表示 FlexMAP-3D上獲得的數(shù)據(jù)，并且使用XPonent 4. 0軟件和5-參數(shù)邏輯回歸分析進(jìn)行分析。 由80%-120% (觀察值/期望值）范圍確定標(biāo)準(zhǔn)曲線量化范圍。報(bào)告的值包括在標(biāo)準(zhǔn)曲 線范圍內(nèi)的那些和通過(guò)邏輯回歸分析計(jì)算的那些。
[0199] 抗體試劑
[0200] 以下抗體用于這些研宄：MDA-CAR(Jena(耶拿）和Cooper (庫(kù)珀），2013, L?針 對(duì)CD19的抗獨(dú)特型抗體。PlosONE(公共科學(xué)圖書館期刊）2013 ;印刷中），針對(duì)共軛至 Alexa647的⑶19CAR的鼠抗體。針對(duì)多參數(shù)免疫分型的抗體：T細(xì)胞檢測(cè)組：抗-⑶3-FITC、 抗-CD8-PE、抗-CD14-PE-Cy7、抗-CD16-PE-Cy7、抗-CD19-PE-Cy7、抗-CD16-PE-Cy7。 B 細(xì)胞檢測(cè)組：抗-CD20-FITC、抗-CD45-PE、抗-CD45-APC、抗-CD19-PE-Cy7、抗-CD19-PE、 抗-CD34-PCP-e710 和抗 CD34-APC，都購(gòu)買自 e-Biosciences 公司。
[0201] 多參數(shù)流式細(xì)朐術(shù)
[0202] 在菲可帕克加工后，直接通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)細(xì)胞，除了在冷凍保存的樣品的溶 解后立即評(píng)價(jià)的CH0P-101基線樣品。如在本文中所述，使用每個(gè)病癥約0.2-0. 5x IO6個(gè) 總細(xì)胞（取決于樣品中的細(xì)胞產(chǎn)率），并且針對(duì)CSF樣品，使用痕量的在CSF流體的離心后 收集的細(xì)胞，并且使用熒光扣除對(duì)照（FMO)染色，進(jìn)行針對(duì)周圍血液和骨髓樣品的多參數(shù) 免疫分型。使用制造商推薦的抗體和試劑濃度，在冰上，在IOOuL PBS中染色細(xì)胞30分 鐘，洗滌，并且再懸浮在0.5%多聚甲醛中，并且使用裝備有藍(lán)色（488)和紅色（633nm)激 光的Accuri C6流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行獲取。以FCS文件格式輸出Accuri文件，并且使用 FlowJo軟件（版本9. 5. 3, Treestar)進(jìn)行分析。使用單抗體染色和BD補(bǔ)償珠粒（Becton Dickinson公司）建立補(bǔ)償值，并且通過(guò)軟件進(jìn)行計(jì)算。對(duì)T細(xì)胞的門控策略如下：活細(xì)胞 (FSC/SSC)>dump 通道（CD14+CD16+CD19-PECy7)對(duì)比 CD3+>CD3+。對(duì) B 細(xì)胞的門控策略如 下：活細(xì)胞（FSC/SSC)>SSC低事件〉CD19+。在單獨(dú)的圖中描述了針對(duì)CH0P-100和CH0P-101 樣品的更多門控細(xì)節(jié)。
[0203] 分子MRD分析
[0204] 由Adaptive Biotechnologies公司（西雅圖，華盛頓州）和使用基于Illumina HiSeq/MiSeq平臺(tái)的免疫SEQ測(cè)定的BCR IGH⑶R3區(qū)的高通量下一代測(cè)序進(jìn)行分子MRD分 析（Larimore (拉里莫爾）等人，2012，J Immunol (免疫學(xué)雜志）189:3221-30)。對(duì)于這些 分析，701-6, OOOng (約111，000-950, 000基因組當(dāng)量）的分離自獲得自患者的全血或骨髓 樣品的基因組DNA經(jīng)受組合的多重PCR和測(cè)序，隨后是算法分析，以量化樣品中單獨(dú)的IGH CDR3序列。進(jìn)行每個(gè)樣品中TCRB CDR3區(qū)的平行擴(kuò)增和測(cè)序（Robins (羅賓斯）等人，2009， Blood (血液）114:4099-107)以評(píng)定DNA樣品的質(zhì)量。對(duì)于每個(gè)患者，使用EMBL-EBI多重序 列比對(duì)工具對(duì)測(cè)定自不同時(shí)間點(diǎn)的樣品的IGH⑶R3核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)（Goujon(古戎） 等人，2010，Nucleic Acids Res (核酸研宄）38:W695-9;Sievers (西弗斯）等人，2011，M〇1 Syst Biol (分子系統(tǒng)生物學(xué)）7:539)?？缭皆谝韵聲r(shí)間點(diǎn)樣品中測(cè)定的IGH CDR3序列在 生物信息學(xué)上追蹤來(lái)自最早時(shí)間點(diǎn)樣品的優(yōu)勢(shì)克隆，以鑒定具有95%或更大逐對(duì)序列一致 性的序列的存在。對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，報(bào)告了對(duì)類似于優(yōu)勢(shì)克隆的那些序列的總測(cè)序讀數(shù)。
[0205] 現(xiàn)在描述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0206] 病例報(bào)告
[0207] CH0P-100是處于她的ALL的第二次復(fù)發(fā)中的7歲女孩。她在2年前確診，并且 達(dá)到了最小殘留疾病（MRD)的陰性緩和，在確診后17個(gè)月復(fù)發(fā)。她在再誘導(dǎo)化療后重 新進(jìn)入緩和，但是在4個(gè)月后復(fù)發(fā)，此后她并不響應(yīng)furtheclofaribine(-種藥物）/ 依托泊苷/環(huán)磷酰胺。她在基線的核型為48，XX，del(9) (p21.3)，+ll，del(14) (q2 ? q24)，+16/46, XX [4]。通過(guò)在強(qiáng)化療之前的血液成分分離獲得外周血單核細(xì)胞（PBMC)，預(yù)期 可能存在不足的循環(huán)T細(xì)胞可供用于此類強(qiáng)治療后的細(xì)胞制造。如以前所述（Porter (波 特）等人，2011，N Engl J Med(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志）365:725-33 ;Kalos(卡洛斯）等人， 2011，Science Translational Medicine (科學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)）3:95ra73)，按經(jīng) 3 個(gè)連續(xù)天給予 的3. 8x IO8個(gè)細(xì)胞/kg(1.2x IO7個(gè)CTL019細(xì)胞/kg)的總劑量，這一患者輸注有已經(jīng)進(jìn)行 抗⑶3/⑶28擴(kuò)張并且慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)抗⑶19CAR的CTL019細(xì)胞。在她的CTL019輸注 前，她并沒有接受淋巴細(xì)胞消耗性化療，其中在CTL019輸注前6軸，給予了最近的細(xì)胞毒性 治療。注意到?jīng)]有立即的輸注毒性，但是她因?yàn)樵诘?天前進(jìn)展為高燒的低級(jí)別發(fā)燒而住 院，并且在第5天，患者轉(zhuǎn)移至兒科I⑶(CH0P-100,圖4A)。這隨后是迅速進(jìn)展至顯著的呼 吸和心血管危害，需要機(jī)械通氣和血壓支持。
[0208] 第二個(gè)ALL個(gè)患者是10歲女孩（CH0P-101)，她在確診后28個(gè)月和CTL019輸注 前10個(gè)月，已經(jīng)經(jīng)歷了 4/6配對(duì)的非親緣性臍帶移植后的第二次復(fù)發(fā)。她在她的移植后， 已經(jīng)經(jīng)歷了移植物抗宿主疾?。℅VHD)，用治療解決了這一疾病；她在她的復(fù)發(fā)時(shí)，擺脫了 免疫抑制。盡管進(jìn)行了多次細(xì)胞毒性的和生物的治療，她并沒有隨后重新進(jìn)入緩和。她 的基線核型為 46XX，del(l) (pl3)，t(2 ;9) (q ? 21 ;q ? 21)，t(3 ;17) (p24 ;q23)，del(6) (ql6q21)，del(9)(ql3q22)，der (16)t (I ; ? ; 16) (pl3 ; ? pl3. 3)[9]，//46, Xy[1]。在 PBMC 收集前，用兩個(gè)周期的blinatumomab(-種藥物）對(duì)她進(jìn)行治療（Bargou(巴戈）等人， 2008, Science (科學(xué)）321:974-7)，沒有反應(yīng)。在PBMC收集時(shí)，她的周圍血液細(xì)胞的68 %是 供體來(lái)源的。在前一周給予依托泊苷/環(huán)磷酰胺化療用于淋巴細(xì)胞消耗后，制造 CTL019T細(xì) 胞并且按單次劑量中IO7個(gè)細(xì)胞/kg(1.4x IO6個(gè)CTL019細(xì)胞/kg)的總劑量進(jìn)行輸注。在 CTL019輸注前一天，它的骨髓被取代為一群⑶19+/⑶34+ALL細(xì)胞，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)臨床流式細(xì)胞 術(shù)（圖7)，這些細(xì)胞具有CD19的可變表達(dá)。她沒有立即的輸注毒性，但是在D+6天發(fā)燒，并 且住院。她沒有經(jīng)歷心肺毒性，并且并沒有接受糖皮質(zhì)激素類或抗細(xì)胞因子治療。CH0P-101 經(jīng)歷了未知原因的發(fā)燒，懷疑是由于細(xì)胞因子釋放（圖4B)，肌痛，以及自發(fā)解決的兩天的 精神錯(cuò)亂（3級(jí)）。在輸注CTL019細(xì)胞后，她沒有GVHD的證據(jù)。雖然已經(jīng)從患者收集這些 細(xì)胞，但是它們?nèi)院艽蟪潭壬鲜枪w（臍帶血）來(lái)源的。
[0209] 全部?jī)蓚€(gè)#試者中的緩和的誘導(dǎo)
[0210] 如描繪總WBC、ALC和ANC相對(duì)于CTL019輸注的時(shí)間測(cè)量的圖所示，在CTL019輸 注后2周內(nèi)，全部?jī)蓚€(gè)受試者都具有循環(huán)的淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的增加（圖4C)。在圖5 中更詳細(xì)地示出，多數(shù)淋巴細(xì)胞由表達(dá)嵌合抗原受體的T細(xì)胞組成（圖8)。在全部?jī)蓚€(gè)受 試者中，記錄了高級(jí)非傳染性發(fā)燒，隨后是LDH的提高（圖4A)。LDH的提高和高級(jí)發(fā)燒類 似于在CTL019輸注后，CLL患者中先前描述的那些（Porter (波特）等人，2011，N Engl J Med(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志）365:725-33 ;Kalos(卡洛斯）等人，2011，Science Translational Medicine (科學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)）3:95ra73)。輸注后約一個(gè)月，在全部?jī)蓚€(gè)受試者中都達(dá)到了白 血病的MRD陰性（〈0? 01% )形態(tài)學(xué)緩和（表1)。
[0211] CH0P-100中的臨床緩和與截止2013年1月的已經(jīng)持續(xù)至少9個(gè)月的深度分子緩 和關(guān)聯(lián)（表1)。IGH基因座的高流量DNA測(cè)序揭示，在CH0P-100的血液和骨髓中，在D+23 天，總IGH讀數(shù)的顯著降低。在D+180天測(cè)序的多于1百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞當(dāng)量中，在血液和骨髓中 未檢測(cè)到惡性克隆。相比之下，在血液和骨髓中容易地檢測(cè)到T細(xì)胞受體序列，表明在所有 時(shí)間點(diǎn)測(cè)試的DNA的完整性。
[0212] 表I :CH0P-100和101的血液和骨髓中分子緩和的誘導(dǎo)
【權(quán)利要求】
1. 治療患有與腫瘤抗原的提高的表達(dá)關(guān)聯(lián)的疾病、失調(diào)或病癥的患者的方法，該方法 包括給予對(duì)其有需要的患者第一線治療和第二線治療，其中該第一線治療包括給予該患者 有效量的遺傳修飾以表達(dá)CAR的細(xì)胞，其中該CAR包括抗原結(jié)合域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)信 號(hào)傳導(dǎo)域。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中在給予該第一線治療后，監(jiān)測(cè)該患者中的細(xì)胞因子 水平，以確定待給予至該患者的第二線治療的適當(dāng)類型，并且給予對(duì)其有需要的該患者適 當(dāng)?shù)牡诙€治療。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中細(xì)胞因子水平的增加鑒定待給予至對(duì)其有需要的該 患者的細(xì)胞因子抑制治療的類型。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中該細(xì)胞因子選自IL-1 0、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-IRa、IL-2R、IFN-a、IFN-y、MIP-1 a、 MIP-1 0、MCP-l、TNFa、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、CXCR 因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、 EGF、HGF、FGF- 0、CD40、CD40L、鐵蛋白、以及它們的任何組合。
5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中該細(xì)胞因子抑制治療選自小干擾RNA(siRNA)、微 RNA、反義核酸、核酶、編碼反式顯性負(fù)性突變體的表達(dá)載體、抗體、肽、小分子、細(xì)胞因子抑 制藥物、以及它們的任何組合。
6. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中通過(guò)檢測(cè)來(lái)自該患者的生物樣品中的細(xì)胞因子的蛋 白水平來(lái)監(jiān)測(cè)這些細(xì)胞因子水平。
7. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中通過(guò)檢測(cè)來(lái)自該患者的生物樣品中的細(xì)胞因子的核 酸水平來(lái)監(jiān)測(cè)這些細(xì)胞因子水平。
8. 減少或避免與給予遺傳修飾以表達(dá)CAR的細(xì)胞關(guān)聯(lián)的不良作用的方法，其中該CAR 包括抗原結(jié)合域、跨膜結(jié)構(gòu)域、以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域，該方法包括監(jiān)測(cè)患者中細(xì)胞因子的 水平以確定待給予至該患者的細(xì)胞因子治療的適當(dāng)類型并且給予適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子治療至 該患者。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中細(xì)胞因子水平中的增加鑒定待給予至該患者的細(xì)胞 因子抑制治療的類型。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中該細(xì)胞因子選自IL-1 0、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-IRa、IL-2R、IFN-a、IFN-y、MIP-1 a、 MIP-1 0、MCP-l、TNFa、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、CXCR 因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、 EGF、HGF、FGF- 0、CD40、CD40L、鐵蛋白、以及它們的任何組合。
11. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中該細(xì)胞因子抑制治療選自小干擾RNA(siRNA)、微 RNA、反義核酸、核酶、編碼反式顯性負(fù)性突變體的表達(dá)載體、細(xì)胞內(nèi)抗體、肽、小分子、細(xì)胞 因子抑制藥物、以及它們的任何組合。
12. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中通過(guò)檢測(cè)來(lái)自該患者的生物樣品中的細(xì)胞因子的 蛋白水平來(lái)監(jiān)測(cè)這些細(xì)胞因子水平。
13. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中通過(guò)檢測(cè)來(lái)自該患者的生物樣品中的細(xì)胞因子的 核酸水平來(lái)監(jiān)測(cè)這些細(xì)胞因子水平。
【文檔編號(hào)】A61K39/00GK104427997SQ201380037301
【公開日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年7月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月13日
【發(fā)明者】C·H·瓊, B·L·萊文, M·D·卡羅斯, S·格魯普 申請(qǐng)人:賓夕法尼亞大學(xué)董事會(huì), 費(fèi)城兒童醫(yī)院