對于由阻礙整合素α8β1功能引起的纖維化的抑制的制作方法
【專利摘要】獲得新型且有效的抗纖維化劑。使用含有整合素α8β1的拮抗劑的抗纖維化劑。或者，使用一種抗纖維化劑，其含有：與整合素α8鏈的帽端亞結(jié)構(gòu)域中的至少1個氨基酸及其周邊區(qū)域，特異結(jié)合的抗整合素α8β1抗體?；蛘撸褂靡环N抗纖維化劑，其含有：與整合素α8鏈的R120及其周邊區(qū)域，或S132及在其周邊區(qū)域特異結(jié)合的抗整合素α8β1抗體。所述拮抗劑也可以是：例如，與來自人，小鼠，和大鼠的任意一個物種中的整合素α8β1，可以結(jié)合的抗整合素α8β1抗體。NITE BP-82620101012NITE BP-82520101012NITE BP-82720101012NITE BP-82920101012NITE BP-82420101012NITE BP-82820101012
【專利說明】對于由阻礙整合素0 86 1功能引起的纖維化的抑制

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抗纖維化劑。

【背景技術(shù)】
[0002]纖維化癥通常為人所知的是指:以膠原蛋白等為組成成分的結(jié)締組織增加，代替了正常組織，由此導(dǎo)致組織硬化，失去正常功能，從而產(chǎn)生疾病。產(chǎn)生于肝臟，肺，腎臟，心臟，在皮膚等處。例如，如果肝組織產(chǎn)生大量纖維化，導(dǎo)致肝硬變。
[0003]作為纖維化癥的研究例子，非專利文獻1中記載了:產(chǎn)生纖維化癥的肺的基因表達的研究結(jié)果。根據(jù)所述結(jié)果，纖維化肺組織中的178個基因高表達，如果以顯著差(￠^0.01111 1^01 811(1 81:11(16111:^ 8 1:-1:681:)來算，大概有 1000 個左右的高表達基因。另外非專利文獻2記載了:用纖維化癥肺整合素0 8 13 1的高表達。
另外專利文獻1記載了:阻礙整合素(1=1:6取'1=) 0 80 1與其配體結(jié)合的抗體。
【先行技術(shù)文獻】
【專利文獻】
[0004]【專利文獻1】國際公開第2011/049082號 【非專利文獻】
[0005]【非專利文獻1 】〃辦-!'6即 1社1011 811(11~016 0？ 081:601)0111:111 1111111111811 1(110^81:1110 ￠1111110II&！'又！1131~0818? 6七 3,1., ？^08 16(1.200586^) ^2(9) 16251.200586^) 6.[非專利文獻 2]0？ 1:116￠1111110II81'又 811(1
1161)81:10 1^1131-0818.^16^1116 6七 &1.，八III 了 ？81:1101? 2000^1111:156(6): 1927~35?


【發(fā)明內(nèi)容】

【發(fā)明要解決的課題】
[0006]然而，所述非專利文獻1?2及專利文獻1中沒有記載:治療纖維化癥的結(jié)果。纖維化癥，是眾多疾病中特別難治的疾病。就本專利申請的發(fā)明人所知:市售的治療藥物只有一種，其普通名吡非尼酮鹽野義制藥株式會社制備而且這唯一的治療藥，只在日本被認可為治療藥，美國？0八認為其藥效不足，沒有認可該藥物。
[0007]本發(fā)明鑒于為所述情況，目的是:提供新型且有效的抗纖維化劑。
【解決課題的手段】
[0008]本發(fā)明人，如下述實施例的記載:纖維化癥的小鼠模型，1)觀察病理組織圖像，纖維化得到改善；2)膠原蛋白01(1)以及平滑肌肌動蛋白(八0-3嫩)的基因表達量或蛋白量的增加被抑制⑶反映纖維化的指標(biāo)膠原蛋白積累量的羥脯氨酸￠17(^0171^011116)的量,其增加被成功抑制。所抑制的是:阻礙整合素0 80 1功能的物質(zhì)被投入而發(fā)揮效果。
[0009]另外，所述非專利文獻1及2中，研究了纖維化組織的基因表達量的增減或分布圖。然而，量或分布，并不一定意味著該分子的作用是必要的，其與其他分子共有表達調(diào)節(jié)機制從而產(chǎn)生變化的情況也是有的。因此，一般情況下，在一個疾病中表達增加的分子有多個。有關(guān)整合素0 813 1，過去沒有人能指出其與纖維化相關(guān)的功能方面的證據(jù)，本發(fā)明人在下述實施例中首次發(fā)現(xiàn)了這一點。在所述實施例中，得出的令人吃驚的結(jié)果:在動物級另I」，清楚地觀察到病理組織的變化(改善)，以及所述指標(biāo)被抑制。
[0010]本發(fā)明提供:含有整合素0 80 1的拮抗劑的抗纖維化劑。如果使用所述抗纖維化劑，能抑制纖維化。
[0011]另外，本發(fā)明還提供:含有特異性結(jié)合的抗整合素08抗體的抗纖維化劑，其特異性結(jié)合的部位是整合素0 8鏈的帽端亞結(jié)構(gòu)域內(nèi)(0?) 811)3(101118111)至少一個氨基酸及其周邊區(qū)域。如果使用所述抗纖維化劑，能抑制纖維化。
[0012]另外，本發(fā)明還提供:含有整合素0 813 1拮抗劑治療藥，用于治療隨著纖維化的進行而產(chǎn)生的疾病。如果使用所述治療藥，可以治療隨著纖維化的進行而產(chǎn)生的疾病。
【發(fā)明的效果】
[0013]使用本發(fā)明的新型且有效的抗纖維化劑，能抑制纖維化。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1表示的是:以表面活性劑溶解導(dǎo)入了人￠1 9的雞細胞系，以抗人￠1 9抗體19八2
免疫沉淀的結(jié)果。
圖2表示的是:使用導(dǎo)入了人0 9的雞細胞系和抗人0 9抗體19八2，進行分析的結(jié)果。
圖3表示的是:將整合素0 813 1野生型、8120突變體以及？161突變體，與實施例的抗整合素0 8 0 1抗體反應(yīng)，進行分析的結(jié)果。
圖4表示的是:將整合素0 8 13 1的[20突變體(穩(wěn)定表達株)，與實施例的抗整合素0813 1抗體或?qū)φ? 8抗體反應(yīng)，進行分析的結(jié)果圖。
圖5表示的結(jié)果是:測量實施例的抗整合素0 8 13 1抗體對于整合素0 8 13 1的阻礙活性。
圖6表示的結(jié)果是:通過1^3分析，檢測實施例的抗整合素0 8 13 1抗體對于人及小鼠整合素0 8 0 1的交叉反應(yīng)性。
圖7表示的結(jié)果是:通過…⑶分析，檢測實施例的抗整合素0 8 13 1抗體對于人及大鼠整合素0 8 0 1的交叉反應(yīng)性。
圖8表示的結(jié)果是:針對各種生物而來的整合素0 8 13 1的[20及其周邊區(qū)域的氨基酸序列，進行比對(八11即1116111:)。
圖9說明的是:將實施例的抗整合素0 813 1抗體向801小鼠給藥的日程表。
圖10表示的是:將實施例的抗整合素0 813 1抗體給藥或不給藥時，將801小鼠的肝切片以1388011染色法染色的照片。
圖11表示的是:實施例的抗整合素0 813 1抗體給藥或不給藥時，801小鼠肝臟的001 0 1⑴和￠1 -3嫩的基因表達量的檢測結(jié)果。
圖12表示的是:在將實施例的抗整合素0 813 1抗體給藥或不給藥時，801小鼠的肝臟中羥脯氨酸含量的結(jié)果。
圖13表示的是:將實施例的抗整合素0 813 1抗體向冗14小鼠給藥的日程表。
圖14表示的是:將實施例的抗整合素0 813 1抗體給藥或不給藥時，對冗14小鼠肝切片進行1&88011染色的照片。
圖15表示的是:實施例的抗整合素0 813 1抗體給藥或不給藥時，在冗14小鼠的肝臟中0-3嫩的蛋白表達量的檢測結(jié)果。
圖16表示的是:實施例的抗整合素0 813 1抗體給藥或不給藥時，0014小鼠的肝臟中羥脯氨酸含量的測量結(jié)果。
圖17表示的是:將實施例的抗整合素0 813 1抗體向肺纖維化癥小鼠的給藥日程表。圖18表示的是:實施例的抗整合素0 813 1抗體給藥或者不給藥時，將肺纖維化癥小鼠的肺切片進行冊染色后的照片。
圖19表示的是:實施例的抗整合素0 813 1抗體給藥或不給藥時，肺纖維化癥小鼠肺中001 0 1⑴和￠1 -3嫩的基因表達量的檢測結(jié)果。
圖20表示的是:實施例的抗整合素0 813 1抗體給藥或不給藥時，肺纖維化癥小鼠的體重變化的測量結(jié)果。
圖21表示的是:實施例的抗整合素0 813 1抗體給藥或不給藥時，肺纖維化癥小鼠肺中羥脯氨酸含量的檢測結(jié)果。
圖22表示的是:實施例的抗整合素0 8 13 1抗體阻礙整合素0 8 13 1的阻礙活性的檢測結(jié)果。
圖23表示的是:實施例的抗整合素0 813 1抗體對于人以及小鼠整合素0 813 1的交叉反應(yīng)性，通過…⑶分析檢測而得到的結(jié)果。
圖24表示的是:將整合素0 8 13 18132突變體(穩(wěn)定表達株)，與實施例的抗整合素08131抗體或?qū)φ? 8抗體進行反應(yīng)，進行分析而得到的結(jié)果。

【具體實施方式】
[0015]以下，就本發(fā)明的實施方式進行詳細說明。另外，對于相同的內(nèi)容，為了避開重復(fù)，適當(dāng)省略其說明。
[0016]本發(fā)明的一種實施方式是是新型抗纖維化劑。所述抗纖維化劑是，例如，含有整合素0 80 1拮抗劑的抗纖維化劑。整合素0 83 1的拮抗劑，在下述實施例中被證明:能抑制纖維化。因此，如果用含有所述組成的抗纖維化劑，能抑制纖維化。
[0017]就「纖維化」而言，為人所知的典型是:以膠原蛋白等為組成要素的結(jié)締組織增長，替換正常組織，因此組織硬化，失去正常功能，從而產(chǎn)生疾病。例如，在肝臟，肺，腎臟，心臟，皮膚等中產(chǎn)生?；蚶?，如果肝組織產(chǎn)生大量纖維化，以至于產(chǎn)生肝硬變。另外，除了肝硬變，隨著纖維化的進行，各組織中有時產(chǎn)生惡性腫瘤。
[0018]就「整合素0 83 1」而言，典型的是:由0鏈和@鏈組成的為異二聚體的、且存在于細胞膜表面的受體蛋白質(zhì)。整合素0813 10嫩序列及氨基酸序列，可以參考例如他七10的 1 06111:61~ 0101:601111010^7(^081)的數(shù)據(jù)庫&等。鏈的氨基酸序列可以是:例如序列編號(3即10勵:)7的氨基酸序列。13鏈的氨基酸序列可以是:例如序列編號8的氨基酸序列。0鏈和13鏈含有:含信號肽的種類，或不含的種類。另夕卜，作為配體可以有舉出的例子有:例如骨橋蛋白，纖連蛋白，玻連蛋白或腱生蛋白。
[0019]在本說明書中對于拮抗劑的種類沒有特別限定，不過優(yōu)選為:阻礙整合素0 8 1和配體結(jié)合的抗整合素0 80 1抗體?；蛘邇?yōu)選為:在整合素08鏈的帽端亞結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少1個氨基酸及其周邊區(qū)域上，特異結(jié)合的抗整合素0 813 1抗體。或者優(yōu)選為:所述拮抗劑是，在整合素0 8鏈的[20及其周邊區(qū)域上，或在3132及其周邊區(qū)域上，特異結(jié)合的抗整合素08131抗體?；蛘邇?yōu)選為:所述拮抗劑是，可以特異結(jié)合來自人，小鼠(11101:86),以及大鼠(1^)中任意一個的整合素0 83 1的抗整合素0 83 1抗體?；蛘邇?yōu)選為:所述拮抗劑為，阻礙整合素08131功能的抗整合素08131抗體?；蛘邇?yōu)選為:所述拮抗劑為，對于整合素0 8鏈的81201^突變體或3132八突變體沒有結(jié)合性，對于整合素0 8鏈的野生型具有結(jié)合性的抗整合素0 813 1抗體?；蛘邇?yōu)選為:所述拮抗劑為，重鏈⑶町、2以及3分別含有序列編號為1、2以及3的氨基酸序列，且輕鏈⑶町、2以及3分別含有序列編號為4、5以及6的氨基酸序列的抗整合素0 8 13 1抗體?；蛘邇?yōu)選為:所述拮抗劑為，如果是阻礙整合素0 813 1及其配體結(jié)合的物質(zhì)，則沒有特別限定，例如可以是抗體，蛋白質(zhì)，低分子化合物，高分子化合物，或核酸。
[0020]本發(fā)明的一種實施方式是一種抗纖維化劑，其中含有與整合素0 8鏈的[20及其周邊區(qū)域，或3132及其周邊區(qū)域特異結(jié)合的抗整合素0 813 1抗體。與整合素^ 8鏈的[20及其周邊區(qū)域，或3132及其周邊區(qū)域特異性結(jié)合的抗整合素0 8 13 1抗體，如下述實施例所證明，能抑制纖維化。因此，如果使用含有所述組成的抗纖維化劑，能抑制纖維化。
[0021]另外，本發(fā)明的一種實施方式是一種抗纖維化劑，其含有:在整合素08鏈的帽端亞結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少1個氨基酸上，或在該氨基酸及其周邊區(qū)域上特異結(jié)合的抗整合素08131抗體。如果使用所述抗纖維化劑，能抑制纖維化。
[0022]另外，本發(fā)明的一種實施方式是一種抗纖維化劑，其含有:對于整合素0 8鏈的尺1201^突變體或3132八突變體沒有結(jié)合性，對于整合素0 8鏈的野生型有結(jié)合性的抗整合素08^1抗體。對于整合素0 8鏈的81201^突變體或3132八突變體沒有結(jié)合性，對于整合素^ 8鏈的野生型有結(jié)合性的抗整合素0 813 1抗體，在下述實施例中被證明:能抑制纖維化。因此，如果使用具有所述組成的抗纖維化劑，能抑制纖維化。
[0023]另外，本發(fā)明的一種實施方式是一種抗纖維化劑，其含有:對于整合素0 8鏈的1個以上的帽端亞結(jié)構(gòu)域突變體沒有結(jié)合性，對于整合素0 8鏈的野生型有結(jié)合性的抗整合素0 813 1抗體。如果使用所述抗纖維化劑，能抑制纖維化。另外，整合素0 8鏈的帽端亞結(jié)構(gòu)域突變體指的是:帽端亞結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少1個氨基酸發(fā)生了突變的突變型整合素0 8鏈。在此處，對于帽端亞結(jié)構(gòu)域突變體沒有結(jié)合性的抗體:可以是對于至少1個突變體不具有結(jié)合性；也可以是對于不同于所述突變體的，而位于其他帽端亞結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸發(fā)生突變的突變體具有結(jié)合性。
[0024]另外，本發(fā)明的一種實施方式是一種抗纖維化劑，其含有:編碼阻礙整合素0 8^1功能的抗整合素8 0 1抗體的多核苷酸$0171111(31601:1(16)。阻礙整合素8 3 1功能的抗整合素0813 1抗體，如下述實施例所證明，能抑制纖維化。因此，如果使用含有所述組成的抗纖維化劑，從所述多核苷酸表達所述抗整合素0 813 1抗體，其結(jié)果是能抑制纖維化。
[0025]另外，本發(fā)明的一種實施方式是一種抗纖維化劑，其含有:整合素080 1拮抗劑的前體。整合素0 8 0 1拮抗劑，如下述實施例所證明，能抑制纖維化。因此，如果使用含有所述組成的抗纖維化劑，由所述前體產(chǎn)生所述拮抗劑，結(jié)果是能抑制纖維化。
[0026]另外，本發(fā)明的一種實施方式是一種抗纖維化劑，其含有:整合素0 813 1的功能阻礙劑。阻礙整合素0 813 1的功能，如下述實施例所證明，能抑制纖維化。因此，如果使用含有所述組成的抗纖維化劑，能抑制纖維化。
[0027]另外，本發(fā)明的一種實施方式是一種抑制或治療纖維化的方法，使用本實施方式中的拮抗劑或抗纖維化劑。
根據(jù)所述方法，通過抑制纖維化，可以治療纖維化或隨著纖維化進行而產(chǎn)生的疾病。
[0028]另外，本發(fā)明的一種實施方式是一種膠原蛋白積累(八抑制劑，其含有整合素0 80 1的拮抗劑；或者是一種膠原蛋白積累抑制的方法。整合素0 813 1的拮抗劑，如下述實施例所證明，能抑制膠原蛋白的積累。因此，如果使用含有所述組成的膠原蛋白積累抑制劑，能抑制膠原蛋白的積累。
[0029]另外，本發(fā)明的一種實施方式是一種膠原蛋白0 1(1)或0-3嫩的表達抑制劑，其含有整合素0 813 1的拮抗劑；或是一種抑制膠原蛋白0 1(1)或0-3嫩表達的方法。整合素013 1的拮抗劑，如下述實施例所證明，可以抑制膠原蛋白0 1(1)及0-3嫩的表達。因此，如果使用含有所述組成的膠原蛋白0 1(1)或0-3嫩的表達抑制劑，可以抑制膠原蛋白。1⑴或抑制。-3嫩的表達。膠原蛋白0 1⑴和0 的氨基酸序列及0嫩序列可以參照等。
[0030]另外，本發(fā)明的一種實施方式是一種羥脯氨酸生成的抑制劑，其含有整合素0 8^1拮抗劑；或是一種抑制羥脯氨酸生成的方法。整合素0 8 0 1拮抗劑，如下述實施例所證明，能抑制羥脯氨酸的產(chǎn)生。因此，如果使用含有所述組成的羥脯氨酸生成抑制劑，能抑制羥脯氨酸的產(chǎn)生。羥脯氨酸的含量測定，例如，可以按照下述實施例中記載的步驟進行，也可以使用〃 1=--腦一七 &1., 1(610 了 16(1.701.27^0.1,43-46(1978)^^^^^^^0
[0031]本發(fā)明的一種實施方式是:表達整合素08131，并且對于膠原蛋白0 1⑴或0 -3嫩的表達量高于正常細胞的非正常細胞中的，上述膠原蛋白0 1(1)或上述0 -3嫩的表達具有阻礙的方法。該方法含有使整合素0 813 1拮抗劑和所述非正常細胞接觸的步驟。根據(jù)所述方法，通過阻礙膠原蛋白0 1(1)或0-3嫩的表達，能抑制疾病。
[0032]本發(fā)明的一種實施方式是:表達整合素0 813 1，并且對于羥脯氨酸的產(chǎn)生量高于正常組織的非正常組織中的，上述羥脯氨酸的產(chǎn)生具有阻礙的方法，該方法含有使整合素0 8 13 1拮抗劑和和所述非正常組織接觸的步驟。根據(jù)所述方法，通過阻礙羥脯氨酸的產(chǎn)生，能抑制疾病。
[0033]在本說明書中，整合素0 8鏈的[20及其周邊區(qū)域，優(yōu)選為:含有整合素^8鏈的第 114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，或 126 位氨基酸序列的區(qū)域。或是也可以含有整合素0 8鏈的序列編號9的氨基酸序列的區(qū)域。其周邊區(qū)域，如果含有所述抗整合素0 813 1抗體的表位(如“叩^)區(qū)域的話，則沒有特別限定。另外，所述114?126位是:以含有信號肽時的整合素0 8鏈為基準計算時而得的位置。因此，整合素0 8鏈不含有信號肽時，所述114?126位，其意思可以是:分別相當(dāng)于76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，和88位的氨基酸。另外，就抗體在特定區(qū)域特異結(jié)合而言，包括:抗體將特定區(qū)域作為表位識別。作為表位識別，包括:作為表位的一部分識別。就抗體特定的氨基酸及在其周邊區(qū)域的特異結(jié)合而言，包括:抗體對于特定的氨基酸及其周邊的立體結(jié)構(gòu)，特異識別、結(jié)合。
[0034]本說明書中，整合素0 8鏈的3132及其周邊區(qū)域，可以是:含有整合素0 8鏈的126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，或 138 位氨基酸序列的區(qū)域。另夕卜，所述126?138位:以含有信號肽時整合素0 8鏈為基準計算而得的位置。因此，整合素0 8鏈不含有信號肽時，所述的126?138位，其意思可以是:分別相當(dāng)于88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，和100位的氨基酸。所述氨基酸的周邊區(qū)域是:例如，將本實施方式的抗體作為表位識別的區(qū)域。所述的氨基酸周邊區(qū)域，如果是將抗體作為表位識別的區(qū)域，也可以含有所述氨基酸前后的1，2，3，4，5，或6個氨基酸。
[0035]在本說明書中，整合素0鏈的帽端亞結(jié)構(gòu)域，可以包括帽端亞結(jié)構(gòu)域插入部((?)811)3(1011181111?4。本實施方式的抗體結(jié)合的鏈的部位，考慮到穩(wěn)定地抑制纖維化，優(yōu)選為位于插入部1中。插入部1可以是:例如整合素0鏈的113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，或 132 位。整合素。8 鏈不含有信號肽時，所述的113?132位，其意思可以是:分別相當(dāng)于75?94位的氨基酸。插入部 2 可以是:例如整合素 ^ 鏈的 154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，或171位。整合素￠1 8鏈不含有信號肽時，所述154?171位，其意思可以是:分別相當(dāng)于116?133位的氨基酸。插入部3可以使:例如，整合素0鏈的187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，或 199 位。整合素 0 8 鏈不含有信號肽時，所述187?199位，其意思可以是:分別相當(dāng)于149?161位的氨基酸。插入部4可以是:例如，整合素 0 鏈的 233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，或250位。整合素^ 8鏈不含有信號肽時，所述的233?250位，其意思可以是:分別相當(dāng)于195?212位的氨基酸。整合素家族的帽端亞結(jié)構(gòu)域的位置的例子是，例如，《父130 6七 &1.,2004^0^ 4:432(7013): 59-67.》中記載的。
[0036]在本說明書中，通過抗整合素0 83 1抗體阻礙整合素^80 1功能的狀態(tài)，包括:例如，使整合素0 813 1與所述配體反應(yīng)時的結(jié)合量，相對于正常時有意義的減少。所述有意義的減少可以是:例如，所述結(jié)合量減少至0.7,0.6,0.5,0.4,0.3,0.2,0.1,0.01，或0倍。所述倍率，可以是:在此舉出的任意1個值以下，或任意2個值的范圍內(nèi)?？紤]到整合素0 813 1的功能被特別明確地阻礙，優(yōu)選為減少至0.5倍以下，更加優(yōu)選為減少至0.1倍以下。所述結(jié)合量可以是:例如，如下屬實施例所述的方法那樣，在固定了配體的基板
中，使整合素0 813 1表達細胞接觸、以吸光強度測量粘著后的細胞數(shù)，從而測得結(jié)合量。在本說明書中「有意義」可以是:例如以31^11(16111:’ 8 1:-1:681:(單側(cè)或兩側(cè))評估統(tǒng)計學(xué)的顯著差，其1^0.05時的情況。或包括:產(chǎn)生具有實際差異的狀態(tài)。
[0037]在本說明書，抗體對于抗原沒有結(jié)合性的狀態(tài)包括:抗體抗原完全不結(jié)合的狀態(tài)，或抗體向抗原的結(jié)合量顯著少的狀態(tài)。抗體和抗原的結(jié)合性可以是:例如，使抗體和抗原表達細胞反應(yīng)之后，通過流式細胞技術(shù)(他^)分析測量。所謂…⑶分析是:其典型的為，用激光照射在流通池內(nèi)流動的細胞，檢測從細胞來的前方散射光、側(cè)面來的散射光的參數(shù)，鑒定細胞特性的分析方法。例如可以是:抗體和抗原非表達細胞反應(yīng)時的峰，與抗體和抗原表達細胞反應(yīng)時的峰相比較，本質(zhì)上不具有有意義的變化時，判斷為抗體對于抗原不具有結(jié)合性。另一方面可以是:抗體和抗原非表達細胞反應(yīng)時的峰，與抗體和抗原表達細胞反應(yīng)時的峰相比較，本質(zhì)上具有有意義的變化時，判斷為抗體對于抗原具有結(jié)合性?；蛘邲]有結(jié)合性的狀態(tài)可以是:通過表面等離子體共振測量裝置測量結(jié)合速率常數(shù)0?)，與有結(jié)合性時相比可以是0.2,0.1,0.05，或0.01倍的狀態(tài)。所述倍率，可以使在此舉出的任意1個值以下，或任意2個值的范圍內(nèi)。
[0038]在本說明書中，基因表達被阻礙的狀態(tài)，包括:基因表達被有意義的阻礙的狀態(tài)?；蛘呖梢允潜蛔璧K40，50，60，70，80，90，或100 %。所述百分比，可以是在此舉出的任意1個值以上，或任意2個值的范圍內(nèi)。從抑制纖維化的觀點來看，優(yōu)選為50%以上，更加優(yōu)選為70%以上?；蛘呖梢允?例如，與產(chǎn)生纖維化的組織中基因表達量相比，表達量減少至0.7，0.6，0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，0.01，或0倍的狀態(tài)。所述倍率，可以是在此舉出的任意1個值以下，或任意2個值的范圍內(nèi)。從抑制纖維化的觀點來看，優(yōu)選減少至0.5倍以下，更加優(yōu)選為減少至0.1倍以下。另外，本說明書基因的表達量被抑制的狀態(tài)，與所述的基因表達量減少的狀態(tài)為相同狀態(tài)。
[0039]在本說明書中，羥脯氨酸的產(chǎn)生被阻礙的狀態(tài)，包括:羥脯氨酸的產(chǎn)生被有意義地阻礙的狀態(tài)。或者可以是:被40，50，60，70，80，90，或100%地阻礙。所述比例，可以是在此舉出的任意1個值以上，或任意2個值的范圍內(nèi)。或者是，例如，包括:與產(chǎn)生纖維化的組織中羥脯氨酸的產(chǎn)生量相比，減少至0.9,0.8,0.7,0.6,0.5,0.2,0.1，或0倍的狀態(tài)。所述倍率，可以是在此舉出的任意1個值以下，或任意2個值的范圍內(nèi)。從抑制纖維化的觀點來看，優(yōu)選為減少至0.9倍以下。另外，在本說明書中，羥脯氨酸的產(chǎn)生量被抑制的狀態(tài)，與所述羥脯氨酸的產(chǎn)生被阻礙的狀態(tài)為相同狀態(tài)。
[0040]在本說明書中，增加指的是，包括:例如增加至1.2,1.3,1.4,1.5,2,2.5,3,5,10,
或40倍的狀態(tài)。所述倍率，可以是在此舉出的任意1個值以上，或任意2個值的范圍內(nèi)。
[0041]在本說明書中，所謂配體的前體是，含有下述物質(zhì):在111 ^^0或111 VI廿0中，與任意物質(zhì)反應(yīng)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其結(jié)果是，可以成為與所述配體結(jié)構(gòu)相同的物質(zhì)。
[0042]在本說明書中，氨基酸是:有氨基和羧基的有機化合物的總稱。本發(fā)明實施方式的抗整合素0 813 1抗體包含「特定的氨基酸序列」時，所述氨基酸序列中任意一個氨基酸可以被化學(xué)修飾?？梢允沁@種的情況下，本發(fā)明實施方式的抗整合素0 80 1抗體，也可以被稱為:含有所述「特定的氨基酸序列」。一般情況下，就蛋白質(zhì)中的氨基酸在生物體內(nèi)被化學(xué)修飾而言，是:例如~末端修飾(例如，乙?；?，肉豆蘧酰化等)，末端修飾(例如，酰胺化，糖基磷脂化￠17008711)11081)11211:1(1711110811:01)加成等，或側(cè)鏈修飾(例如，磷酸化，糖鏈加成等)等。
[0043]在本說明書中，多核苷酸$0171111(31601:1(16)，包括:核苷酸或堿基，或其等價物(￡^111^816111:8)，復(fù)數(shù)結(jié)合的狀態(tài)下組成的物質(zhì)。核苷酸及堿基含有嫩堿基或觀八堿基。所述的等價物，含有:例如0嫩堿基或觀八堿基被甲基化等化學(xué)修飾的物質(zhì)，或含有核苷酸類似物。核苷酸類似物，含有非天然的核苷酸。所謂「堿基序列」，是組成多核苷酸的核苷酸或所述等價物的序列。在堿基序列的記載中，八，I'，匕0，分別含有:腺嘌呤及所述等價物，胸腺嘧啶及所述等價物，鳥嘌呤及所述等價物，胞嘧啶及所述等價物。
另外了和V尿嘧啶)，可以根據(jù)用途互相替換。另外，多核苷酸可以采用0嫩/?嫩合成裝置合成。另外，可以從0嫩堿基或觀八堿基合成的受托公司(例如，11^11:1*08611公司等)購買。另外，多核苷酸也可以載體(^6(^010或是質(zhì)粒。
[0044]作為所述載體，可以使用:例如,來自大腸桿菌的質(zhì)粒(例如成I'-81116)，來自枯草菌的質(zhì)粒(例如即8110),來自酵母的質(zhì)粒(例如1)31119),動物細胞表達質(zhì)粒(例如^1-11),、噬菌體等噬菌體，來自病毒的載體等。
這些載體，可以含有:啟動子，復(fù)制起始點，或耐抗菌素的基因等，蛋白質(zhì)表達所需要的組成要素。載體可以是表達載體。
[0045]本發(fā)明的實施方式的抗整合素0 813 1抗體編碼的多核苷酸或載體，可以將細胞遺傳轉(zhuǎn)化。如果采用所述遺傳轉(zhuǎn)化體，可以使用該【技術(shù)領(lǐng)域】的公知方法，制得本發(fā)明實施方式的抗整合素080 1抗體。遺傳轉(zhuǎn)化體，可以使其他的哺乳動物(例如，大鼠，小鼠，豚鼠，兔子，牛，猴子等)的細胞。作為哺乳動物細胞可以是，例如，中國倉鼠卵巢細胞((?)細胞)，猴子細胞⑶3-7等?；蛘?，遺傳轉(zhuǎn)化體也可以使屬菌，酵母等。
[0046]將所述多核苷酸或載體向細胞中導(dǎo)入和抗體生產(chǎn)，可以根據(jù)該【技術(shù)領(lǐng)域】公知的方法進行。將多核苷酸或載體導(dǎo)入細胞的方法可以是:例如，使用磷酸鈣法，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，電穿孔法，腺病毒法，逆轉(zhuǎn)錄病毒法，或顯微注射法等(修訂第4版新基因工程學(xué)手冊，羊土社(2003): 152-179.〉。作為使用抗體細胞的生產(chǎn)方法可以是使用，例如，〃蛋白質(zhì)實驗手冊，羊土社(2003): 128-142.〃中記載的方法。
[0047]抗體的純化方法，例如，可以使用硫酸銨，乙醇沉淀，蛋白質(zhì)八，蛋白質(zhì)6，凝膠過濾層析，陰離子，陽離子交換色譜法，磷酸纖維素層析，疏水性互相作用色譜法，親和色譜法，羥基磷灰石層析，或凝集素層析等方法(蛋白質(zhì)實驗手冊，羊土社(2003): 27-52.) 0
[0048]在本說明書中所指的「結(jié)合」，意思是物質(zhì)間的連接。連接可以是:共價鍵結(jié)合或非共價鍵結(jié)合的任意一種，例如，離子結(jié)合，氫結(jié)合，疏水性相互作用，或親水性相互作用。本說明書中，抗原抗體反應(yīng)的「識別」，意思可以是:抗體工程學(xué)領(lǐng)域中通常使用的意思，例如，包括特異結(jié)合這樣的意思。
[0049]在本說明書中的「1種以上」指的是:可以是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或20種，可以是所述任意一個值以上，或其范圍內(nèi)。
[0050]本發(fā)明的實施方式的抗整合素0 83 1抗體結(jié)合的整合素0831，其來源沒有特別限定，不過優(yōu)選為:人，小鼠，豚鼠，倉鼠，大鼠，老鼠，兔子，豬，羊，牛，馬，貓，狗，狨猴，猴子，黑猩猩的任意1種以上。
其中，從抗整合素0 813 1抗體作為治療藥使用的觀點而言，優(yōu)選人?；蛘?，從作為在非臨床試驗使用的模型動物特別合適的觀點而言，優(yōu)選小鼠及大鼠。
[0051]本發(fā)明的實施方式的抗整合素0 80 1抗體，可以是單克隆抗體。如果是單克隆抗體，和多克隆抗體相比，可以高效率地對整合素0 813 1起作用。
[0052]本發(fā)明的實施方式的抗整合素0 80 1抗體，可以是:有抗原結(jié)合活性的抗體片段(下文有時稱其為「抗原結(jié)合性片段」)。此時，具有的效果是:穩(wěn)定性提高，或抗體的生產(chǎn)效率提聞等。
[0053]本發(fā)明的實施方式的抗整合素0 813 1抗體，可以是:與整合素8 1野生型或突變型結(jié)合的抗體。所謂突變型，包括:個體間0嫩序列的差異造成的情況。但是，優(yōu)選為:與整合素0 8鏈的81201^突變體或3132八突變體沒有結(jié)合性。野生型或突變型0鏈的氨基酸序列，優(yōu)選為:相對于序列編號7所示的氨基酸序列，有80%以上的同源性，更優(yōu)選為有90%以上的同源性，特別優(yōu)選有95%以上的同源性。野生型或突變型13鏈的氨基酸序列，相對于序列編號8的氨基酸序列，優(yōu)選為80%以上的同源性，更優(yōu)選為90%以上的同源性，特別優(yōu)選為有95%以上同源性。
[0054]本發(fā)明的實施方式的抗整合素08131抗體的種類^匕?)，沒有特別限定，不過可以是，例如1拂，1曲，I姊，I#，或I成。
[0055]另外，本發(fā)明的一種實施方式為一種含抗整合素0 80 1抗體的抗纖維化劑，所述含抗整合素0 813 1抗體含有:重鏈⑶町、2以及3，分別含有序列編號為1、2以及3的氨基酸序列；輕鏈0^1、2以及3，分別含有序列編號為4，5，和6的氨基酸序列。含有所述特定的氨基酸序列的抗整合素0 813 1抗體，如下述實施例所證明，能抑制纖維化。因此，如果使用含有所述組成的抗纖維化劑，能抑制纖維化。
[0056]另外，本發(fā)明的一種實施方式為一種含抗整合素0 80 1抗體的抗纖維化劑，所述含抗整合素0 813 1抗體含有:重鏈⑶町、2以及3，分別含有序列編號為10，11，和12的氨基酸序列；輕鏈0^1、2以及3，分別含有序列編號為13，14，和15的氨基酸序列。如果使用所述抗纖維化劑，能抑制纖維化。
另外，本發(fā)明的一種實施方式為一種含抗整合素0 813 1抗體的抗纖維化劑，所述含抗整合素0 813 1抗體含有:重鏈⑶町、2以及3，分別含有序列編號為16，17，和18的氨基酸序列；輕鏈0^1、2以及3，分別含有序列編號為19，20，和21的氨基酸序列。如果使用所述抗纖維化劑，能抑制纖維化。
[0057]另外，為人所知的是:一般情況下，即使抗體的氨基酸序列中產(chǎn)生某種程度的缺失，置換，插入，加成(添加)等，抗體仍然保持某種程度的功能。因此，特定具有所述氨基酸序列的抗整合素0 8卩1抗體，可以產(chǎn)生某種程度的缺失，置換，添加。這種缺失，置換，添加等的抗體，可以根據(jù)例如，根據(jù)定點突變法，隨機突變法，或用抗體噬菌體庫的生物淘汰法(0101)81111111?)等制得。作為定點突變法,可以使用例如 1^00-？1118-1111:叫6116818 1(11: (10108000.，110.)。從缺失，置換，添加等導(dǎo)入后的突變型抗體，選擇與野生型具有同樣活性的抗體的方法，可以是:以…(:3分析或等各種表征方法。
[0058]另外，所述抗整合素0 813 1抗體，只要具有阻礙整合素0 83 1與其激動劑(^18^)結(jié)合的功能，可以是:含有相對于野生型，有1個或1個以上的氨基酸缺少失，置換，插入，附加的氨基酸序列的抗體?；蛘撸灰哂凶璧K整合素0813 1及其激動劑結(jié)合的功能，可以是:含有與野生型有90%以上同源性的氨基酸序列的抗體?；蛘撸灰哂凶璧K整合素0 813 1及其激動劑結(jié)合的功能，可以是含有如下序列的抗體，該序列是:相對于由與編碼((30(16)野生型的氨基酸序列的堿基序列所互補的堿基序列組成的核酸，在嚴格的(81:1-11186111:)條件下進行雜化的核酸的堿基序列所編碼出的氨基酸序列。
[0059]所述的序列編號為1，5，10，14，16，或20的氨基酸序列，只要所述抗整合素0 83 1抗體具有阻礙整合素0 8 13 1與其激動劑結(jié)合的功能，可以是各個氨基酸序列中1或2個氨基酸缺失，置換，插入或附加。
另外，所述的序列編號為2,3,4,6,11，12，13，15，17，18，19，或21氨基酸序列，只要所述抗整合素0 813 1抗體具有阻礙整合素0 813 1與其激動劑結(jié)合的功能，可以是各個氨基酸序列中1、2或3個氨基酸缺失，置換，插入或附加。
[0060]如果所述抗整合素0 83 1抗體中有1個或1個以上的氨基酸缺少失，置換，插入或附加時，「1個以上」可以是15，10，8，6，4，或2個，也可以是其中任意一個值以下。優(yōu)選為:該數(shù)字小。其原因是:所述「1個以上」的數(shù)字越小，越接近原來的抗整合素0 80 1抗體的特性。另外，一般情況下，1或1個以上體的氨基酸殘基的缺失，添加，插入，或被其他氨基酸置換的多肽，保持其生物學(xué)活性(此士 6丨^08(1 801V 8 1984861):81(18): 5662-5666., 201161~ 6^ &1., ^1610 &1如 1^8.19820(^25；10(20): 6487-6500.，胃&叩一七 &1., 80101106.1984^11 29:224(4656): 1431-1433.)。
[0061]所述抗整合素0 80 1抗體中，如果有1個或1個以上氨基酸被其他氨基酸置換，優(yōu)選為:以保持氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的其他氨基酸進行置換。例如，就氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)而言，可以舉出的例子有:疏水性氨基酸(八，I，匕1，？，親水性氨基酸
6,只，X，3，丁)，脂肪族側(cè)鏈氨基酸(6,八，V，匕I，？〉，含羥基側(cè)鏈的氨基酸(8, 丁，1)，含硫原子側(cè)鏈的氨基酸⑴，1)，含羧酸及酰胺側(cè)鏈的氨基酸(0,1 2，0)，含堿基側(cè)鏈的氨基酸(尺，1?)，含芳香族側(cè)鏈的氨基酸。(括號內(nèi)均為氨基酸的單字母縮寫上述各個小組內(nèi)的氨基酸之間的置換被總稱為「保存性置換」。
[0062]所述抗整合素0 83 1抗體中，表示氨基酸序列同源性時用的「90%以上」，可以是例如90，95，98，99，或100%。可以是上述值的任意一個值以上，或在其范圍內(nèi)。優(yōu)選為:所述數(shù)值大。其原因是所述「90%以上」的數(shù)值越大，其特性越接近原來的上述抗整合素
08^1抗體。
[0063]在本說明書中的同源性，可以是:根據(jù)本【技術(shù)領(lǐng)域】公知的方法，計算在2個或多個氨基酸序列中，同樣的氨基酸數(shù)的比例。在計算比例之前，將待比較的氨基酸序列群的氨基酸序列排列對齊，為了得出最大同源性比例，必要時在氨基酸序列的一部分中導(dǎo)入間隙(間隔、缺口)。排列對齊的方法，比例的計算方法，比較方法，以及與之相關(guān)的電腦程序，是本【技術(shù)領(lǐng)域】中廣為人知的(例如等)。在本說明書中的「同源性」，沒有特別情況，可以根據(jù)(^如:110)31.111111.11111.^0^/)的81^31測量值來表示。在81八3丁中比較氨基酸序列時的八1801*11:11111中，可以使用默認設(shè)置的81%?)。測量結(jié)果以？0811::1^68或1(16111:11:168進行數(shù)值化。
[0064]在本說明書中的嚴格條件，例如可以使用以下的條件。(1)為了清洗，使用低離子強度及高溫度(例如，以501,0.0151的氯化鈉/0.00151的檸檬酸鈉/0.1%的十二烷基硫酸鈉)(2)雜交(取匕“匕社1011)中使用霍爾姆酰胺等變性劑(例如，以421，50%卜八)霍爾姆酰胺和0.1%牛血清白蛋白/0.1%聚蔗糖1%的聚乙烯吡咯烷酮作0禮的邱6.5磷酸鈉緩沖液體，以及750禮的氯化鈉，75禮檸檬酸鈉)，或(3) 20%霍爾姆酸胺，5X 330，501111 憐酸鈉(￠117.6)，溶液801111:1011), 10%硫酸葡聚糖，以及201118/1111的變性剪切鮭魚精子0嫩的溶液中，以371培養(yǎng)1夜，然后在37-501以1X3%洗滌過濾器。另外，霍爾姆酰胺濃度可以是50%以上。沖洗時間為5，15，30，60，或120分鐘，或上述時間以上。影響雜交反應(yīng)嚴格性的因素有:溫度，鹽濃度等2個以上因素，詳細可參考 “1811)361 61: &1.？1~01:00018 111 10160111&1- 01010^7, ^11671111:61~80161106 戶油 1181161~8，(1995)。
[0065]所述抗整合素0 80 1抗體，也可以含有保藏號為肌邛8？-824，^1X2 8？-826，或犯丁2 8？-828質(zhì)粒編碼出的的重鏈，犯，重鏈⑶町?3，或重鏈服1?4?；蛘?，也可以含有被保藏號[呢8^-825,^112 8？-827，或[12 8？-829質(zhì)粒編碼出的輕鏈，V匕輕鏈⑶[?3，或輕鏈服1?4。
[0066]另外，所述抗整合素0 813 1抗體可以是由下述細胞而得，該細胞含有:從保藏號為肌12 8^-824,^112 8？-826，或肌12 8？-828質(zhì)粒。另外，所述細胞可以進一步可以含有保藏號?I丁2 8？-825，順2 8？-827，或 XI丁2 8？-829 質(zhì)粒。
[0067]另外，所述抗整合素0 813 1抗體可以是從下述細胞而得，該細胞含有:對應(yīng)編碼為保藏號肌邛8？-824，?112 8？-826，或肌12 8？-828質(zhì)粒的抗整合素。8 0 1抗體的重鏈；或編碼出犯的載體的。所述載體可以進一步編碼出:對應(yīng)編碼為保藏號[呢8？-825，[丁2 8？-827，或[12 8？-829質(zhì)粒的抗整合素￠1 8 0 1抗體的輕鏈或VI。另外所述細胞可以進一步含有:對應(yīng)編碼為保藏號[呢8^-825,^112 8？-827，或[12 8？-829質(zhì)粒的抗整合素0 8 0 1抗體的輕鏈；或編碼出VI的載體。
[0068]另外，所述保藏號[呢8？-824質(zhì)粒的大小是約6.8^^。在所述質(zhì)粒中，編碼抗整合素0 8 0 1抗體重鏈的區(qū)域大小是約1.71*13。在所述抗整合素0 8 0 1抗體重鏈的編碼區(qū)域的上游及下游，分別有恥11 I及？I限制性內(nèi)切酶位點。因此，通過1(即I及？111八I處理保藏號[12 8？-824質(zhì)粒，可以分離出抗整合素￠1 8 0 1抗體重鏈的編碼區(qū)域的多核苷酸。另外，所述保藏號[呢8？-825質(zhì)粒的大小是約6.在所述質(zhì)粒中，抗整合素08131抗體輕鏈的編碼區(qū)域的大小是約化如。在所述抗整合素0 8 13 1抗體輕鏈的編碼區(qū)域的上游及下游，分別有！1111(1 111及勸21 I限制性內(nèi)切酶位點。因此，通過!11=(1 III及
I處理保藏號[12 8？-825質(zhì)粒，可以分離出抗整合素￠1 8 1抗體輕鏈的編碼區(qū)域的多核苷酸離析。另外，就所述保藏號8？-826，順2 8？-828，順2 8？-827，順2 8？-829質(zhì)粒而言，也可以使用公知技術(shù)，分離出抗體重鏈或抗體輕鏈的編碼區(qū)域的多核苷酸。
[0069]在本說明書中的抗體，含有:可以特異結(jié)合抗原上特定的表位的分子或分子群。另外抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。另外，抗體可以以各種狀態(tài)存在，例如，可以:?、
)2、？5113’、，單鏈抗體(例如，，如…，多價特異性抗體(例如，二價特異性抗體)，具有抗原結(jié)合性的肽或多肽，嵌合抗體(例如，小鼠-人嵌合抗體等)，小鼠抗體，人源化抗體，人抗體，或它們的同等物(或等價物)組成的組中選出的一種以上的狀態(tài)。另外抗體含有抗體修飾物或抗體非修飾物。抗體修飾物可以是:抗體和例如聚乙烯二醇等各種分子結(jié)合。抗體修飾物可以通過公知技術(shù)對抗體進行化學(xué)修飾而得。
[0070]多克隆抗體可以是:例如，為了誘導(dǎo)對抗原特異性的多克隆抗體的生成，向哺乳類(例如，大鼠，小鼠，豚鼠，兔子，牛，猴子等)，鳥類等中，通過將含有目的抗原的免疫原給藥(0081118)而生成。
免疫原的給藥可以注入1個以上的免疫劑，以及(在需要的情況下)佐劑(“[扣妨!!七)。佐劑可以是:為了增加免疫應(yīng)答而使用的，可以含有著弗氏佐劑(完全或不完全〉、礦物質(zhì)凝膠(氫氧化鋁等〉、或界面活性物質(zhì)(溶血卵磷脂等)等。免疫方案，是該【技術(shù)領(lǐng)域】公知的，與選擇的的宿主生物一起，根據(jù)引起免疫應(yīng)答的任意方法而實施(蛋白質(zhì)實驗手冊，羊土社(2003): 86-91.)。
[0071]就單克隆抗體而言，組成群的各個抗體，除去含有少量自然產(chǎn)生的可能的突變之抗體，含有如下情況:其實質(zhì)上為與單一表位相對應(yīng)的抗體?；蚴?，組成群的各個的抗體，除了少量自然產(chǎn)生的含有可能的突變之抗體，可以是實質(zhì)上同樣的抗體。單克隆抗體是高度特異性的，與多克隆抗體不同，典型的多克隆抗體含有:對應(yīng)于不同表位的不同抗體。除了所述特異性之外，單克隆抗體是從沒有被其他免疫球蛋白污染的雜交瘤細胞培養(yǎng)、合成而來。“單克隆抗體”這個稱呼，只不過顯示了從具有實質(zhì)均一的抗體群而來這一特征，并不意味著:必須是以特定方法生產(chǎn)而來的抗體。例如，在本說明書的單克隆抗體，也可以按照〃6,1118^61117:256(5517): 495-497.〃 中所述的雜交瘤細胞法制得?；蛘?，本發(fā)明使用的單克隆抗體，也可以根據(jù)美國專利第4816567號記載的那種組重組法制得?；蛘撸菊f明書的單克隆抗體也可以按照〃6^&1.，耐證一.1991 八呢 15 ；352 (6336): 624-628.〃 或〃血濁8 6七 &1.，了 1018101.199106。5:222(3): 581-597.〃中記載從噬菌體抗體庫分離而得?；蛘撸部梢园凑铡ǖ鞍踪|(zhì)實驗手冊，羊土社(2003): 92-967中記載的方法制得。
[0072]?，是含有抗原識別部位的抗體。所述區(qū)域含有:非共價鍵結(jié)合的1個重鏈可變域及1個輕鏈可變域的二聚物。在所述組成中，各可變域的3個⑶I？互相起作用，在聚物表面能形成抗原結(jié)合部位。
[0073]是:例如，是一種抗體，其中，用含有具有區(qū)域及區(qū)域的抗體的水解蛋白的木瓜蛋白酶，處理得到的片段中，II鏈的~末端側(cè)約有一半和[鏈的全部，通過部分的二硫鍵結(jié)合而結(jié)合。可以按照如下方法而得:例如，本發(fā)明實施方式的抗整合素0 813 1抗體含有區(qū)域及1?區(qū)域，將該抗體用蛋白水解酶木瓜蛋白酶處理而得。
[0074][(處’^，是一種抗體，其中，對于含有具有區(qū)域及區(qū)域的抗體，以水解蛋白的木瓜蛋白酶處理，得到的片段中，有2個是相當(dāng)于部位。？(處’可以是按照如下方法制得:例如，本發(fā)明實施方式的抗整合素0 8 0 1抗體含有區(qū)域及1?區(qū)域，將該抗體用蛋白水解酶木瓜蛋白酶處理而得。另外，例如，可以通過使下述以硫醚基結(jié)合或二硫鍵結(jié)合，進行制備。
[0075]1^13’是,例如一種抗體，通過切斷？(處’鉸鏈區(qū)域的二硫鍵結(jié)合而制得。例如，以還原劑二硫蘇糖醇處理？(汕’而得。
[0076]8(^1^是:一種抗體，其中，V??！和V[通過適肽接頭$61)1:1(16接頭)連接。8(^可以用如下方法生產(chǎn):例如，得到本發(fā)明的實施方式的抗整合素0801抗體的犯及乂[對應(yīng)編碼的⑶嫩，構(gòu)建編碼犯-肽接頭的多核苷酸，將上述多核苷酸構(gòu)建于載體中，再使用表達用細胞進行生產(chǎn)。
[0077]是:有二價抗原結(jié)合活性的抗體。就二價抗原結(jié)合活性而言，可以是相同，也可以是相互不同的抗原結(jié)合活性。01處0辦可以按照如下方法生產(chǎn):例如，構(gòu)建編碼80^的多核苷酸，使肽接頭的氨基酸序列的長度為8個殘基以下，將得到的多核苷酸構(gòu)建于載體中，再使用表達用細胞進行生產(chǎn)。
[0078](18^是一種抗體，其中，多肽的犯及VI中導(dǎo)入了半胱氨酸殘基，將上述多肽通過上述半胱氨酸殘基件的二硫鍵而結(jié)合。就半胱氨酸殘基導(dǎo)入的位置而言:按照861仏I'等公開的方法6七 &1., ？1~01:6111 ￡11?.19941&7 ；7 (5): 697-704.)，根據(jù)抗體的立體結(jié)構(gòu)的預(yù)測可以選擇。
[0079]有抗原結(jié)合性的肽或多肽是一種抗體，其構(gòu)成中含有:抗體的V??！、V[、或它們的⑶尺1，2，或3。含有1個以上的⑶I？的肽，可以直接結(jié)合或通過適當(dāng)?shù)碾慕宇^結(jié)合。
[0080]所述的…、[處、？(處’、有抗原結(jié)合性的肽或多肽(下文中，有時稱為「…等」)的生產(chǎn)方法，沒有特別限定。例如，編碼本發(fā)明實施方式的抗整合素08131抗體中的？^等區(qū)域的0嫩，被構(gòu)建于表達用細胞能進行生產(chǎn)。或者，也可以根據(jù)？11100:法七 11710X701301171 11161:110(1) , 1:800:法10X70^^01171 1116七^10(1)等的化學(xué)合成法生產(chǎn)。另外本說明書中，抗原結(jié)合性片段也可以是一種以上的？V。
[0081]典型的嵌合抗體是:將不同種類生物間的抗體的可變區(qū)和抗體的不變區(qū)連接而得，可以以基因重組技術(shù)容易地構(gòu)建出來。生成嵌合抗體的方法，是該【技術(shù)領(lǐng)域】的公知技術(shù)。例如，小鼠-人嵌合抗體，可以按照〃0081181? 61: 0.1., ？1~00 ^08(1 801 V 8八.1994？吐1:91(3): 969-973.〃中記載的方法制作。制備小鼠-人嵌合抗體的基本的方法是:例如，被克隆的⑶嫩中存在的小鼠前導(dǎo)序列以及可變序列，將小鼠前導(dǎo)序列以及可變序列與下述序列連接而得:編碼哺乳類細胞的表達載體中已存在的人抗體不變區(qū)的序列?；蛘咭部梢允?將被克隆的⑶嫩中存在的小鼠前導(dǎo)序列以及可變序列和編碼人抗體不變區(qū)的序列連接后，連接到哺乳動物表達載體中。人抗體不變區(qū)的片段，可以是任意的人抗體只鏈不變區(qū)及人抗體[鏈不變區(qū)的片段，例如，就人的連中的而言可以是例如2，
3或?:V 4，就I鏈中的而言可以例如 ?:人或(^。
[0082]人源化抗體，典型的是:與為希望的抗原結(jié)合的抗體，其具有來自非人的1個以上⑶!?、人免疫球蛋而來的框架區(qū)①幻、以及人免疫球蛋白而來的不變區(qū)。人源化抗體可以根據(jù)該【技術(shù)領(lǐng)域】中已知的各種的技術(shù)制得(八1111叫1~0 61: &1.，810801.2008細 1:13:1619-1633.)。例如，⑶尺移植(02^1 6七 &1.，8100(1.1999了皿
1:93 (11): 3922-3930.) ,61: &1., ？1~00 似1:1 ^08(1 801V 8 1994^6? 1:91(3): 969-973.),或即81111 打 166^ &1., 1011111111111101.2007^ ^44(11): 3049-3060.2007^11 22.)等。為了改變(優(yōu)選的是:為了改善)抗原結(jié)合，可以將人服區(qū)域的氨基酸殘基，與來自⑶!?供體抗體①如沉8111:1130(17)的對應(yīng)殘基置換。就所述服置換而言，可以以該【技術(shù)領(lǐng)域】公知的方法進行(尺 16吐胍皿 6七 &1., 19881^ 24:332(6162):
殘基的互相作用的模擬(此如丨丨叩)，識別出抗原結(jié)合的重要服殘基。或者可以是，通過序列比較，識別出在特定的位置中的異常服殘基。
[0083]人抗體，典型的是:該抗體中，含有的組成抗體的重鏈的可變區(qū)域及不變區(qū)、輕鏈的可變區(qū)域及不變區(qū)的區(qū)域，來自編碼人免疫球蛋白的基因。主要的制備方法有:制備人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠法，嗤囷體展不法等。
制備人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠法中，向被定點敲除內(nèi)源性的小鼠中導(dǎo)入功能性人基因的話，可以產(chǎn)生出各種具有抗原結(jié)合能力的人抗體，而非鼠抗體。并且使該小鼠免疫的話，可以用現(xiàn)有的雜交瘤細胞法獲得人單克隆抗體。例如，可以按照〃[如“找的^1., 1^尺6乂 1111111111101.1995 ^13(1): 65-93^ 〃中記載的方法制備。噬菌體展示法，典型的是:使大腸桿菌病毒之一的113或17等纖維狀噬菌體的外殼蛋白(的？和00？等)的~末端側(cè)不失去噬菌體的感染性，將外來基因作為融合蛋白質(zhì)表達的系統(tǒng)。例如，可以使用曲冊6七 &1.，他 1: 0101:60111101.19961虹；14(3): 309-314.〃 中記載的方法制備。
[0084]另外，抗體可以根據(jù)抗體03尺-狀&代 (028^:1 61: &1., 8100(1.1999^11111 ；93(11): 3922-3930.),在任意的抗體中，通過將本發(fā)明實施方式的抗整合素0 80 1抗體的重鏈⑶I？或輕鏈⑶I？移植而制備?；蛘咭部梢?將編碼本發(fā)明實施方式的抗整合素0 8 0 1抗體的重鏈⑶I？或輕鏈⑶I？的0嫩，和編碼公知的來自人或人以外生物的抗體中除了重鏈⑶I？或輕鏈⑶I？的區(qū)域的0嫩，按照本【技術(shù)領(lǐng)域】公知的方法連接到載體上后，使用公知的細胞將其表達而制得。此時，為了提高向抗整合素0813 1抗體的靶抗原的作用效率，可以采用本領(lǐng)域公知方法(例如，將抗體的氨基酸殘基隨機突變，篩選反應(yīng)性高的方法，或噬菌體展示法等)，將除了重鏈⑶!?或輕鏈⑶!?以外的區(qū)域進行最優(yōu)化。另外也可以使用，例如，81111^^16 (1)811180111-0(161- 6七 3,1., 101 1111111111101.2007^1~ ^44(11): 3049~3060?￡￠1111320071811 22.)、或者將游標(biāo)區(qū)20116)氨基酸殘基或包裝殘基1-681(11168)置換的方法(特開 2006-241026，或？00仏 6^ &1., I 101 8101.19921虹 20；224(2): 487-499.),將服區(qū)域最優(yōu)化。
[0085]重鏈016狀7:是全長抗體的主要構(gòu)成要素。典型的是，與輕鏈(11油七0^111)以二硫鍵結(jié)合及非共價鍵結(jié)合的方式結(jié)合在一起。重鏈的~末端側(cè)的區(qū)域中，可以是同種的同一類的抗體，也存在著氨基酸序列不固定的所謂“可變區(qū)域(犯)”，一般情況下，為人所知的是:犯對于抗原的特異性、親和性有很大貢獻。例如，"尺 61 七 61~ 6 七 &1.，】101 8101.1999^11116:290(3): 685-98.〃 記載了:在只制備州分子時，其與抗原特異性、高親和性地結(jié)合在一起。并且，〃1008011 1, 01！6111 0101.20061)60 ；13(12): 1243-1244.〃記載了:在駱駝的抗體中，存在沒有輕鏈，只有重鏈的抗體。
[0086]0)1？(互補性決定區(qū)域，00,161116111(161:61-111111111? 1-0^1011)是在抗體中的區(qū)域，形成于實際上和抗原直接接觸的結(jié)合部位。一般情況下，⑶!?位于抗體的？“可變區(qū)域:含有重鏈可變區(qū)域0?)及輕鏈可變區(qū)域00)上。另外，一般情況下，⑶I？有:大約由5?25氨基酸殘基組成的⑶町，⑶以，⑶…。并且為人所知的，特別是，重鏈的⑶尺對于抗體向抗原的結(jié)合有貢獻。另外，0)1？中，0^3對于抗體向抗原的結(jié)合之貢獻最大。例如，〃評 111又 6七 81.,81001161111081 811(1 0101)11781081 尺68681x11 ^011111111111 03^,10118 乂01111116356, 188116 1，27細!'11 2007，？叫68 124-128〃中記載了:通過改變重鏈⑶…，使抗體結(jié)合能力上升。另外，因為0)1？是決定抗體對抗原特異性的區(qū)域，在抗體間氨基酸序列有很大差異，也被稱為超可變區(qū)域。⑶8以外的…區(qū)域被稱為框架區(qū)域(服)，其由服1，服2，服3及？尺4組成，在抗體間相對地被很好保存下來61: 0.1.,「36叫611。6 0？ ？1~01:61118 0？11111111111010^1081 1=1:61681:」113811(1 011111811 361^1068,1983.)0 即，給與抗體反應(yīng)性特征的主要原因是重鏈⑶…，其次也可以說是重鏈⑶尺。
[0087]關(guān)于⑶I？的定義及決定其位置的方法被多次報道。例如,1(2113211:的定義(36(111611068
0？ ？1~01:61118 0？ 11111111111010^10815七11 6(1.,861-^106, ^81:101181
11181:11:111:68 0？061:1168(18, 10.6七 3,1., 101.8101.1987 5196:901-917).,在在本說明書中，使用社的定義作為優(yōu)選的例子，不過，不一定受其限定。另外，根據(jù)情況的不同，也可以同時考慮X處社定義和(^0訪匕的定義決定，例如，可以將依每種定義的0)1？之定義的重復(fù)部分，或者將依每種定義的0)1？之定義的兩者均囊括的部分，作為⑶1這種方法的具體例子是上處社定義和0！0訪13定義的折中方案，即使用1016(311131'’8 八碰 8111:1130(17 1110(161111? 80？1:冊1~6 的 1虹 1:111 等人的方法(^1-00.^1.八⑶土 801.職，1989:86:9268-9272)。
[0088]本說明書中的抗纖維化劑，包括抑制纖維化用的治療藥?；蛘撸ㄖ委熾S著纖維化的進行產(chǎn)生的疾病的治療藥。或者，抗纖維化劑也可以是:用于再生醫(yī)療的抑制纖維化的藥劑。另外，在本說明書中所說的“治療”，意思是:針對被試驗對象的疾病(包括纖維化)或者是伴隨著疾病的1個以上的癥狀，發(fā)揮了改善癥狀的效果或者預(yù)防的效果。治療藥也包括預(yù)防藥。
[0089]另外，抗纖維化劑是:含有藥理學(xué)上允許的1個或更多個所述載體的醫(yī)藥組合物。就醫(yī)藥組合物而言，可以是:例如將有效成分和所述載體混合，在制劑學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】中為人所知的任意方法制備。另外，抗纖維化劑，可以單獨使用有效成分，也可以和任意成分混合。另外，所述載體的形狀沒有特別限定。
[0090]給藥路徑，優(yōu)選使用的是:治療時，有效果的。例如，可以是靜脈內(nèi)，皮下，肌肉內(nèi)，腹腔內(nèi)，或口服給藥。作為給藥形態(tài)，例如，可以是注射劑，密封劑，藥丸，顆粒劑。所給的藥是抗體醫(yī)藥時，作為注射劑來使用是有效的。注射用的水溶液可以用:例如，小瓶014),或不銹鋼容器來保存。另外注射用的水溶液可以是:例如，混合生理食鹽水，糖(例如海藻糖，即1^611211086)，版1(31，或版10?等。另外，抗纖維化劑可以是:例如，混合緩沖劑(例如磷酸鹽緩沖液)，穩(wěn)定劑等。
[0091]對于給藥量沒有特別限定，不過可以是:例如，一次0.25或0.5^/個體(呢/130(17)很好地，可以是在上述數(shù)值的范圍內(nèi)。給藥間隔沒有特別限定，不過可以是:例如，每3天給藥一次而持續(xù)2周，也可以每周給藥2次而持續(xù)4周。給藥量，給藥間隔，給藥方法，可以根據(jù)被試驗對象的年齡、體重、癥狀、對象的內(nèi)臟器官等，做出選擇。另外，也可以與合適的化學(xué)療法藥物一起使用給藥。另外，抗纖維化劑優(yōu)選為；含有發(fā)揮療的有效量的，或發(fā)揮出所期望的作用之有效量的有效成分。另外，所述膠原蛋白積累的抑制、膠原蛋白0 1(1)及0-3嫩的表達抑制劑、氨酸生成抑制劑，優(yōu)選為:使用與抗纖維化劑同樣的給藥方法。
[0092]在本說明書中的“被試驗對象”為:包括人或除了人以外的哺乳動物(例如，小鼠，豚鼠，倉鼠，大鼠，老鼠，兔子，豬只，羊，山羊，牛，馬，貓，狗，狨猴，猴子，和黑猩猩等中的任意1種以上。
[0093]在本說明書中的「或是」，在使用文章中被列舉的事項的「至少1個以上」可以被使用使，而被使用。「或」也一樣。如果本說明書中寫明「2個值的范圍內(nèi)」，則所述范圍包含2個值本身。
[0094]以上，就本發(fā)明的實施方式進行了說明，不過，這些只是本發(fā)明的示例，也能采用所述以外各種各樣的組成。另外也可以將上述實施方式中的記載中的組成組合起來使用。
【實施例】
[0095]以下，以實施例進一步說明本發(fā)明，不過，本發(fā)明不受它們的限定。
[0096]?實施例1?抗整合素0 8 0 1抗體的制備 (1)免疫將小鼠整合素0 8鏈的⑶嫩克隆到哺乳動物表達載體中。其次，以電穿孔法(￡1601:1-01)01-81:1011 11161:110(1)將所述表達載體轉(zhuǎn)染淋巴母細胞樣細胞系后，添加藥劑后進行表達細胞的選擇。得到的小鼠整合素0 8鏈表達細胞系在雞中超免疫出沖虹丨臟皿一)。以流式細胞術(shù)￠:?分析，來測量雞血清中的抗體值。關(guān)于分析，按照(80, 的一般的方法⑴抓如⑶丨)進行。
[0097]另外，整合素￠1 8鏈與0 1鏈形成異二聚體，在鳥類，哺乳類的任意一種中被確認(00887 8，6七 ￡11, ￡180 】10(9): 2375-2385，1991 ；了 0611 801108:537-544, 1995) 0 但是，哺乳類的0鏈和鳥類的卩鏈是不是能形成異二聚體，相關(guān)的具體實驗數(shù)據(jù)沒有被報道。因此，按照以下步驟，確認了:人的0 9和雞的13 1形成了異二聚體，作為整合素分子被表達于細胞膜表面。首先，將人嫩導(dǎo)入雞細胞系中，通過藥選擇得到了穩(wěn)定表達株。其次，以表面活性劑使所述導(dǎo)入了人0 9的雞細胞系溶解，以抗人0 9抗體19八使其免疫沉淀(圖1〉。在電泳道中出現(xiàn)2條帶，可知:人0 9鏈和其他分子形成了復(fù)合體。泳道2是表達整合素3 9 1的￠1 9-^8^60^6(1 81480 (人大腸癌細胞系)的免疫沉淀，比較的話可知:泳道1的2個帶是0 9鏈和3 1鏈。
[0098]并且，使用導(dǎo)入了人0 9的雞細胞系和抗人0 9抗體19八2進行分析(圖2)。與無染色細胞的柱狀圖相比，在與抗體反應(yīng)時柱狀圖向右移動，可知:人0 9在膜表面被表達。因此可以認為:在所述整合素0 8鏈表達細胞系中，同樣地，0 8鏈和13 1鏈的異二聚體形成了。另外，所述的小鼠整合素0 8鏈的氨基酸序列，是序列編號7所示的氨基酸序列。
[0099](2) 80^噬菌體抗體庫的制備
從進行了免疫的雞摘出脾臟，之后分離淋巴球。從得到的淋巴球中提取I？嫩，進行⑶嫩的合成，制得曬菌體抗體庫。有關(guān)曬菌體抗體庫的制法，按照〃的1^皿11? 61: &1., I 乂6七16(1 801.2004^111:66(7): 807-14〃 中記載的一般技術(shù)進行。
[0100](3)淘汰(￠￡111111118)選擇
將8(3”噬菌體抗體庫添加到小鼠整合素0 8鏈的非表達細胞系中，進行非特異噬菌體的吸附操作(八138011)1:1011之后，使其與小鼠整合素8鏈表達細胞系反應(yīng)。用有機溶劑清洗后，將與小鼠整合素0 8鏈表達細胞系特異結(jié)合的噬菌體回收，使其感染大腸桿菌。進行4次淘汰之后，以使用了小鼠整合素0 8鏈表達細胞系的…⑶分析，確認了庫的反應(yīng)性。因為34庫的反應(yīng)性高，從34庫進行曬菌體的克隆，選擇陽性克隆后，決定序列。有關(guān)細胞淘汰，是依據(jù)〃6101^8110 61: &1.，耐16(1.2001價凡；7(11): 1249-53.〃中記載的方法進行的。
[0101](4)人整合素0 8鏈交叉克隆的選擇
為了取得與人整合素0 8鏈有交叉反應(yīng)的抗體，制備了表達人整合素0 8鏈的雞淋巴母細胞樣細胞系。通過…(:3分析，進行與人整合素0 8鏈表達細胞系也有交叉反應(yīng)的克隆的選擇。
[0102](5)對于重組抗體的重組
通過以上實驗得到8(3”噬菌體，以編碼該噬菌體的0嫩鏈為模板，進行犯，VI的放大后，與雞抗體的前導(dǎo)序列、不變區(qū)進行0卩61~1叩？0？，克隆1*1好表達載體。將制備的鏈，[鏈構(gòu)建子轉(zhuǎn)染哺乳類培養(yǎng)細胞后，純化表達的抗體。1~1奸抗體的重組，是按照〃3111 腦 11101:0 6七 &1., 81010^10818.200586^ ；33 (3): 169-74.〃 中記載的方法進行的。根據(jù)以上步驟，制備出3種(#3抗體，#5抗體，#26抗體)抗整合素0 80 1抗體(單克隆抗體)。
[0103]另外，含有編碼#3抗體、#5抗體、或#26抗體重鏈的0嫩序列的質(zhì)粒，均于2009年10月16日寄存于日本獨立行政法人制品評估技術(shù)基盤機構(gòu)專利微生物寄存中心(日本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8)。隨后，日本寄存的所述質(zhì)粒，于2010年10月12日各個保藏號為[呢8？~824^112 8？-826、或[12 8？-828，基于布達佩斯條約被移送國際寄存。
[0104]另外，含有編碼#3抗體、#5抗體、或#26抗體輕鏈的0嫩序列的質(zhì)粒，均于2009年10月16日寄存于日本獨立行政法人制品評估技術(shù)基盤機構(gòu)專利微生物寄存中心(日本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8)。隨后，日本寄存的所述質(zhì)粒，于2010年10月12日以各個保藏號[呢8^-825,^112 8？-827，或[12 8？-829，基于布達佩斯條約被移送國際寄存。這些寄存的6個質(zhì)粒，是在上述(5)中，使用表達載體而制得的。
[0105]另夕卜，#3抗體的重鏈0^1,2，3分別是310,(序列編號為1)，
(序列編號為2)，虹)317(^3(^(^^0310(序列編號為3)。另外，#3抗體的輕鏈0^1,2，3分別是扣(序列編號為4)，0見'殿?3 (序列編號為5)，(?八0311)-(序列編號為6)。0)1？是與抗整合素0 80 1抗體的抗原結(jié)合的特性相關(guān)的部位。#5抗體的重鏈⑶尺1，2，3分別是810^ (序列編號為10)，100008^1116^1(6 (序列編號為11)，760610618^066810 (序列編號為12)。另外#5抗體的輕鏈⑶町，2，3分別是3⑶￡31扣(序列編號為13)，3冊狀？3 (序列編號為14)，6X1088X^61 (序列編號為15)。#26抗體的重鏈⑶町，2，3分別是如0嫩(序列編號為16)，168868^X^6X^1(6 (序列編號為17)，‘￡10(序列編號為 18)。
另外#26抗體的輕鏈0^1,2，3分別是扣(序列編號為19)，231狀？3 (序列編號為20)，6^088^61 (序列編號為21)。另外，X在氨基酸分析表示:不能分析的氨基酸。
[0106]?實施例2?表位的評估
制備 8 種人 ￠18^00^(1^120, 1(125，8132, ？161，1199,八238，八260，3261),使它們在(:?)細胞中瞬時表達，與#3抗體反應(yīng)。#3抗體對野生型和7種突變體0(125，8132, ？161，1199，八238，八260，3261)保持了反應(yīng)性，不過對于[20突變而來的([20突變體)沒有反應(yīng)。#3抗體與野生型、8120突變體，以及？161突變體反應(yīng)，進行分析后的結(jié)果如圖3所示。接著，為了排除因瞬時表達法81201^突變體表達不充分的可能性，制備穩(wěn)定表達株，同樣地使其反應(yīng)，仍然沒有觀察到反應(yīng)。另外，確認了 #1201^突變體與對照08抗體很好地反應(yīng)，充分地被表達(圖4)。這些結(jié)果顯示:#3抗體識別的表位是[20及其周邊區(qū)域。
[0107]?實施例3?阻礙整合素0 8 1活性的評估
在 96-冊11 (96-孔)基板上，小鼠骨橋蛋白(101186 031:001)0111:111) (2.5^/1111)固相化。接著，在所述基板上以1x1025細胞?611加入表達0 8的1(562細胞，同時將#3抗體以圖5中所示的濃度加入。圖5中，八57011111檢測粘著細胞。八57011111的值越低，表示:表達3 8的1(562細胞和骨橋蛋白結(jié)合的越少。
[0108]所述結(jié)果顯示，#3抗體阻礙了:表達0 8的1(562細胞與骨橋蛋白的結(jié)合(圖5)。即，#3抗體具有的功能是:整合素0 8 0 1的拮抗劑。另外抗體濃度為0.05 11 8加1，觀察到60%以上的活性被阻礙(把抗體未加添時作為100)。另外，抗體濃度為0.10^ 8加，觀察到70%以上，抗體濃度為，0.25^ 8加1，95%以上的阻礙活性被阻礙。
[0109]〈實施例4?交叉反應(yīng)性的評估
(1)與人及小鼠整合素0 80 1的反應(yīng)性評估
通過…⑶分析研究:#3抗體與表達人整合素0 8鏈的31480細胞系，和表達小鼠整合素0 8鏈表達的31480細胞系的交叉反應(yīng)性。圖6顯示了其結(jié)果使用。表達人整合素0 8鏈的31480細胞系、以及表達小鼠整合素0 8鏈的31480細胞系中的任何一個，與#3抗體反應(yīng)，和不反應(yīng)時相比，峰的位置明顯右移。另外104時，峰沒有變動。由此顯示了:#3抗體可以與人及小鼠兩方的整合素0 80 1結(jié)合。
[0110](2)與大鼠整合素0 813 1的反應(yīng)性評估
克隆大鼠整合素^ 8鏈的⑶嫩，使其在(:?)細胞中瞬時表達，以確認了其與#3抗體的反應(yīng)性。作為陽性對照，使用人整合素0 8亞基(訓(xùn)仏皿“)的瞬時表達細胞。如圖7所示，#3抗體與大鼠整合素08鏈反應(yīng)了。其反應(yīng)性，與人整合素08鏈反應(yīng)時的程度相同。
[0111](3)與其他生物來源的整合素0 8 0 1反應(yīng)性的評估
根據(jù)上述實施例2的結(jié)果，#3抗體識別的表位是町20及其周邊區(qū)域。在研究了上述部分的大鼠氨基酸序列后發(fā)現(xiàn):其與小鼠以及人的完全相同。在此，從數(shù)據(jù)庫也收集其他種的序列，進行比對(圖8)。其結(jié)果發(fā)現(xiàn):牛，豬只，狗，倉鼠，狨猴，羅猴，長臂猿，黑猩猩，在[20以及末端6個殘基、0-末端6個殘基的共計13殘基序列編號為9)同源性為100%。因此，可以認為:#3抗體與倉鼠，牛，豬只，狗，狨猴，羅猴，長臂猿，黑猩猩的整合素0 8 13 1也有反應(yīng)性。
[0112]〈實施例5?由于膽管結(jié)扎而纖維化的小鼠模型(811611^1011 (801)鼠)的治療效果的評估
(1)向80[小鼠的給藥
如圖9所示，在0，制備了:為了誘導(dǎo)肝纖維化，將小鼠的膽管結(jié)扎，在肝內(nèi)膽管周邊產(chǎn)生了纖維化的所謂“801小鼠”。另外，將無內(nèi)毒素的#3抗體以0.5呢/個體(呢/化辦)的量，于小鼠腹腔內(nèi)每2周、3天給藥。為了比較，準備了沒有將抗整合素0 813 1抗體給藥的801小鼠。并且，按照如下方法測量的纖維化指標(biāo)。
[01 1 3] (2) 1888011 染色法染色
為了研究801小鼠肝組織的纖維化，進行此88011染色。圖10是:由膽管，門靜脈，肝動脈組成的三個一組03111^11*7廿'之周邊組織圖像。上面的圖是沒有將#3抗體給藥的。在上面的圖中，被藍色染色的膠原蛋白纖維的量增加了，新產(chǎn)生了微膽管，即產(chǎn)生了膽管增生。另外，較大膽管中表皮增殖，另外，在膽管周邊發(fā)現(xiàn)炎癥細胞的浸潤。紅色是肝實質(zhì)細胞。下面的圖是:將#3抗體給藥的。將下圖與上圖比較，雖然同樣地產(chǎn)生了微膽管增生，但膠原蛋白纖維的增加程度顯著減少。由此可知:通過膽管結(jié)扎，膽管內(nèi)壓上升，引起膽管增生，不過伴隨其進行的纖維化，由于抗體給藥被抑制了。
[0114](3)001 0 1(1)和0 -觀的基因表達的測量
在801小鼠的肝臟中，膠原蛋白￠11(1))和0平滑肌肌動蛋白(卜5做)的基因表達，以定量？⑶法分析，比較#3抗體給藥/不給藥的小鼠。圖11顯示了:正常小鼠的為1時的相對表達量。
[0115]在80[小鼠中，1(1)的表達是正常小鼠的40倍以上。該值，由于#3抗體給藥，減少到10倍以下的值。即，通過#3抗體給藥，801小鼠的0)1 0 1 (1)的表達被阻礙了75%以上。另外，在80[小鼠中，0-3嫩的表達量增加至正常鼠的約9倍以上。該值，通過#3抗體給藥，減少到5倍以下的值。即，通過#3抗體給藥，801小鼠的0)1 0 1 (1)的表達被阻礙了約50%。
[0116]⑷羥脯氨酸的定量
羥脯氨酸反映組織中的膠原蛋白量，作為纖維化定量標(biāo)準的方法被使用。就801小鼠肝臟中的羥脯氨酸量，在#3抗體給藥/不給藥小鼠之間進行比較。圖12顯示了所述結(jié)果。801小鼠的羥脯氨酸的量，通過#3抗體給藥，從240 9 肝臟組織減少至150 9 肝臟組織。
[0117]另外，羥脯氨酸的測量按照以下步驟進行。首先，將小鼠肝組織于中均質(zhì)化￠1011108611126),^ 1001^/1111。其次在1101下靜置24小時，以800X8離心15分鐘，回收上清。于上清20^ 1中添加14^ 1的剛版10?中和后，加入266^ 1冊20，使總量達到0.31111。并且，與等量的異丙醇(異丙醇)混合后，添加如0.11111氯胺-!'溶液。在室溫下靜置10分鐘靜置后，添加0.51111的二甲氨基苯甲醒(0111161:1171 ￡1111111013611281(16117(16)溶液，充分混合，旋轉(zhuǎn)以甩下粘在壁上的樣品液(31)111(10--)。以501進行90分鐘的顯色反應(yīng)。此后，在室溫下降溫5分鐘后，向基本中注入150^1，測量八590。接著，使用樣品來制作標(biāo)準曲線，進行定量。另外氯胺-1溶液是:含有0.3368氯胺-1(最終是0.84^),31 ^0^0 0.5601(最終是4211)1),檸檬酸溶液0.02“最終是2.^禮)、異丙醇15.801 (最終是39.5% )，以冊20調(diào)整溶液，是總量為4001。另外二甲苯甲醛溶液是:混合了 ￠-(1111161:1171 肅 1110)3611281(16117(16 (對-二甲氨基苯甲醒)0.248?、過氯酸(60% )0.271111、異丙醇0.731111。
[0118]?實施例6?四氯化碳誘導(dǎo)性纖維化小鼠模型((:?小鼠)的治療效果的評估 (1)向小鼠給藥
如圖13所示，在0奶1時，為了誘導(dǎo)肝纖維化，在小鼠皮下將將橄欖油為溶劑的50%四氯化碳以21111/1?個體給藥，制備0314小鼠。另外,將無內(nèi)毒素的(￡11(101:0^111-:1^66)^3抗體以0.25^/個體的量于小鼠的腹膜內(nèi)，每周給藥2次進行4周。為了比較，制備不將抗整合素0 8 0 1抗體給藥的小鼠。并且，按照如下方法測量纖維化的指標(biāo)。
[0119](2)1?88)^ 染色
以此88011染色法對小鼠的肝切片進行染色。圖14顯示了所述結(jié)果。上圖是#3抗體不給藥的情況。上圖中可以看出:與肝小葉周邊的6^188011外殼((^18801^8 ￠￡￠811168)一致，膠原蛋白增加了。被染上藍色的是膠原蛋白纖維，按照肝的小葉結(jié)構(gòu)增生了 6角形。下圖是#3抗體給藥的情況。下圖中，幾乎看不到上圖中所見的肝小葉周邊的&188011膜的肥厚。
[0120]⑶。-3嫩的表達量
正常小鼠和#3抗體給藥/不給藥的小鼠的肝臟中0 -3嫩的表達量，以160611113101:1:1118 進行觀察。
圖15顯示了上述結(jié)果。小鼠中，在#3抗體不給藥時，與正常小鼠相比，0-3嫩的表達量增加(抗體(-)，II = 3)。另一方面，通過將抗整合素0 8 0 1抗體給藥，0 -3嫩的表達量減少(抗體(+)，II = 3)。右端泳道表示:陽性控制組〈1X2細胞的提取物)。
[0121](4)羥脯氨酸的定量
就冗14小鼠的肝臟中羥脯氨酸的量，在#3抗體給藥/不給藥的小鼠間進行比較。圖16顯示了所述結(jié)果。冗14小鼠的羥脯氨酸的量，由于#3抗體給藥，從220^ 8/8肝臟組織減少至177 ^8/8肝臟組織。
[0122]可以明確得知，通過上述實施例5以及6的結(jié)果，由于使用#3抗體，可以:1)改善所觀察到的肝纖維小鼠模型的病理組織學(xué)的纖維化，2)抑制膠原蛋白0 1(1)及0-3嫩的基因表達量的增加，3)抑制羥脯氨酸量的增加。這樣，在動物水平，清楚明白地觀測到所見之病理組織的變化，這是讓人吃驚的事情。不過，已經(jīng)通過如下數(shù)值被證實:即伴隨著纖維化而產(chǎn)生的分子的定量化之?dāng)?shù)值。
[0123]〈實施例7?博萊霉素(81600701:1)誘發(fā)性的肺纖維化癥小鼠模型(肺纖維化癥小鼠)的治療效果的評估
(1)向肺纖維化癥小鼠給藥
如圖17所示，在0中，為了誘導(dǎo)肺纖維化，在鼠的氣管內(nèi)將博萊霉素(日本化藥制造)以1.251/1?個體給藥，制備博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化癥小鼠模型。另外，將無內(nèi)毒素的#3抗體以10^/個體在鼠的腹腔內(nèi)，每3天給一次藥(持續(xù)2周)。作為對照，制備:將生理食鹽水于腹腔中給藥的博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化癥小鼠模型。并且，按照如下方法測量纖維化的指標(biāo)。
[0124](2)病理圖像
博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化癥小鼠，其博萊霉素給藥21天后的病理圖像(冊染色)，如圖18所示。左面的對照組的小鼠產(chǎn)生了顯著的纖維化，由于炎癥性細胞的浸潤和成纖維細胞的增生，由于纖維素的沉積等原因?qū)е抡７闻萁Y(jié)構(gòu)的喪失。另一方面，右邊抗體給藥組的小鼠中，與正常肺相比，雖然有肺泡間壁的肥厚或炎癥細胞浸潤，不過肺泡結(jié)構(gòu)得以保持，與對照組相比，纖維化被強烈抑制。
[0125](3)體重的推移
在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠中，發(fā)現(xiàn):與纖維化相關(guān)的體重增加被抑制或體重減少。測量上述肺纖維化癥小鼠的體重變化(圖19)。所述結(jié)果顯示:#3抗體不給藥的小鼠，從將博萊霉素給藥的3天后到7天后平均減少了 1.8“約10%)的體重。另一方面，#3抗體給藥的小鼠，體重幾乎不減少。即，可以認為:通過#3抗體給藥，由于纖維化導(dǎo)致的體重減少被抑制了。
[0126](4) 001 0 1⑴和￠1 -3嫩的基因表達的測量
用定量？⑶法分析，就上述肺纖維化癥小鼠的肺中(^01 0 1(1)和￠1 -3嫩的基因表達，在#3抗體給藥/不給藥的小鼠間進行比較，以#3抗體給藥小鼠中的表達量作為1，相對表達量如圖20所示。
[0127]抗體不給藥的小鼠中，與#3抗體給藥組相比，0-3嫩的表達量為4倍以上，001^1(1)是8倍以上。通過#3抗體給藥，博萊霉素模型中纖維化相關(guān)的基因在肺中的表達被抑制了。
[0128](5)羥脯氨酸的定量
就上述肺纖維化癥小鼠的肺中羥脯氨酸量，在#3抗體給藥/不給藥小鼠間進行比較。圖21顯示了所述結(jié)果。肺纖維化癥小鼠的羥脯氨酸的量，通過#3抗體給藥，從840.7^邑/8肺組織減少至602.8 4邑/8肺組織。
[0129]?實施例8?阻礙整合素0 8 0 1的#5抗體及#26抗體的阻礙活性評估 ^961^611(96-^)的基板中將(2.51118/1111)固相化。其次，以 0.05 ?
5 9 8/1111的濃度，處理#3抗體，#5抗體，或#26抗體后，于上述基板中加入￠1 8 1的1(562細胞，達到IX 1025細胞/^611，培養(yǎng)1小時后，染色附著的細胞，測量吸光強度。
[0130]所述結(jié)果如圖22所示:#3抗體，#5抗體，和#26抗體，阻礙了表達0 8 0 1^1(562細胞和的結(jié)合(圖22)。所述結(jié)果顯示:#3抗體，#5抗體，和#26抗體，具有整合素0 813 1拮抗劑的功能。另外，如圖所述，可以認為:#5抗體及#26抗體，具有與#3抗體同樣地抑制纖維化的性質(zhì)。
[0131]?實施例9?#5抗體及#26抗體的交叉反應(yīng)性的評估
表達整合素0 813 1來自的來自人及小鼠的乳腺癌細胞系(分別^085781,411),通過^08分析研究了 #3抗體，#5抗體，和#26抗體的交叉反應(yīng)性。所述結(jié)果為:使用人及小鼠來源的細胞中的任意一個，使其分別與#3抗體，#5抗體，和#26抗體反應(yīng)，與不反應(yīng)時比較，峰的位置明顯右移(圖23〉。由此顯示:#5抗體及#26抗體分別可以與來自人及小鼠兩方的整合素0 83 1結(jié)合。
[0132]?實施例10?#5抗體的表位的評估
具有阻礙0 8 13 1作用的#5抗體，與#3抗體同樣，是以雞為宿主制備的，其應(yīng)該識別與0 8鏈序列中不同于雞0 813 1序列的部位。在此，人￠1 8鏈序列中，向與雞￠1 813 1序列不同的氨基酸中加入突變，得到共計22種人0 8鏈突變體⑶嫩。讓該人0 8鏈突變體于⑶0細胞中瞬時表達，使其與#5抗體反應(yīng)。#5抗體與3132突變體不反應(yīng)，與野生型和其他的21種突變體保持了反應(yīng)性。接著，為了排除瞬時表達法中3132突變體沒有充分表達的可能性，制備穩(wěn)定表達株，同樣地使之反應(yīng)，不過同樣沒有觀察到反應(yīng)。確認了如下之事:3132突變體與對照0 8抗體很好地反應(yīng)，充分表達(圖24)。所述對象0 8抗體，識別所述22種突變部位以外的部位。上述結(jié)果顯示:#5抗體識別的表位是3132及其周邊區(qū)域。
[0133]#5抗體所識別的0鏈的3132，和#3抗體所識別的8120，均位于￠1鏈的帽端亞結(jié)構(gòu)域中。因此，顯示了:作為阻礙整合素0 813 1與骨橋蛋白結(jié)合的抗體，識別帽端亞結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸是重要的。
[0134]以上實施例1?10的結(jié)果顯示:通過使用整合素^ 8 1拮抗劑，可以抑制纖維化。另外，通過使用識別整合素0 8鏈的[20及其周邊區(qū)域、或3132及其周邊區(qū)域的抗整合素0 813 1抗體，可以抑制纖維化。
[0135]以上，以實施例說明了本發(fā)明。不過所述實施例是只是示例，可以有種種變形例，這些變形例也屬于本發(fā)明的范圍，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的。
【權(quán)利要求】
1.一種抗纖維化劑，含有整合素α8β I的拮抗劑。
2.權(quán)利要求1中所述的抗纖維化劑，其中，所述拮抗劑是: 阻礙整合素α 8 β I和配體結(jié)合的抗整合素α 8 β I抗體。
3.權(quán)利要求1或2中所述的抗纖維化劑，其中，所述拮抗劑是: 與整合素α 8鏈的帽端亞結(jié)構(gòu)域中的至少I個氨基酸及其周邊區(qū)域特異結(jié)合的抗整合素α 8 β I抗體。
4.權(quán)利要求1?3的任意一項中所述的抗纖維化劑，其中，所述拮抗劑是: 與整合素α 8鏈的R120及其周邊區(qū)域，或S132及其周邊區(qū)域特異結(jié)合的抗整合素α 8β I抗體。
5.權(quán)利要求2?4的任意一項中所述的抗纖維化劑，其中，所述拮抗劑是: 與來自人、小鼠、以及大鼠中的任意一個物種的整合素α 8β 1，可以結(jié)合的抗整合素α 8β I抗體。
6.權(quán)利要求1?5的任意一項中所述的抗纖維化劑，其中，所述拮抗劑是: 與整合素α 8鏈的I個以上的帽端亞結(jié)構(gòu)域突變體沒有結(jié)合性， 而與整合素α 8鏈的野生型具有結(jié)合性的抗整合素α 8 β I抗體。
7.權(quán)利要求1?6的任意一項中所述的抗纖維化劑，其中，所述拮抗劑是: 與整合素α 8鏈的R120k突變體或S132A突變體沒有結(jié)合性， 而與整合素α 8鏈的野生型有結(jié)合性的抗整合素α 8 β I抗體。
8.權(quán)利要求2?7的任意一項中所述的抗纖維化劑，其中，所述拮抗劑是單克隆抗體。
9.權(quán)利要求2?8的任意一項中所述的抗纖維化劑，其中，所述抗整合素α8 β I抗體是:抗原結(jié)合性片段。
10.一種針對隨著纖維化的進行而產(chǎn)生的疾病的治療藥，其中含有整合素α8β1的拮抗劑。
【文檔編號】A61K45/00GK104487092SQ201380017485
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月28日
【發(fā)明者】橫崎恭之, 西道教尚 申請人:國立大學(xué)法人廣島大學(xué)