纖維化的治療的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于治療纖維化的領(lǐng)域。具體而言，它涉及使用N-鈣黏著蛋白抗體治療IPF。該抗體可以是適于治療性用途的拮抗性或中和性N-鈣黏著蛋白的任意抗體。
【專利說明】纖維化的治療

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于使用N-鈣黏著蛋白的拮抗劑治療纖維化的領(lǐng)域。具體而言，它涉及使 用N-鈣黏著蛋白抗體治療特發(fā)性肺纖維化（IPF)。這種抗體可以是適于治療性用途的拮抗 性或中和性N-鈣黏著蛋白抗體的任意抗體。
[0002] 背景
[0003] 肺纖維化-病理學(xué)和病因?qū)W
[0004] 特發(fā)性肺纖維化（IPF)是最常見形式的間質(zhì)性肺病。它是一種進(jìn)行性、末期病狀， 世界范圍內(nèi)侵襲 5 百萬患者（Gharaee-Kermani 和 Phan, 2005 ;Meltzer 和 Noble，2008)。 IPF患者的長期存活不良，5年存活率僅20% (Scotton和Chambers，2007)。IPF的病理學(xué) 以雜亂的膠原蛋白纖維和其他胞外基質(zhì)組分過度沉積和積累為特征，導(dǎo)致組織僵硬、喪失 靈活性和肺功能進(jìn)行性下降。IPF的預(yù)后已經(jīng)與許多種惡性腫瘤的預(yù)后比較，診斷后中位 數(shù)存活期僅為2至3年（Scotton和Chambers，2007)。盡管研究超過50年，但迄今不存在 IPF的有效療法，肺移植是證實延長存活的唯一措施（Walter等人，2006)，并且患者在診斷 后數(shù)年逐漸進(jìn)展至致命結(jié)果。
[0005] 已經(jīng)將IPF視做主要是炎癥過程并且因此治療的天然選擇在歷史上曾是使用皮 質(zhì)類固醇和其他免疫抑制性藥物（Douglas等人，2000 ;Selman等人，1998)。然而，當(dāng)前基 于改變炎性組分的療法僅略微有效，不存在長期改善的證據(jù)并且它們具有嚴(yán)重的副作用 (Mapel 等人，1996 ;Selman 等人，2001)。
[0006] 目前正在評價針對成纖維細(xì)胞增殖和胞外基質(zhì)積累的療法。這樣兩種藥劑是吡非 尼酮和干擾素。吡非尼酮在來自IPF患者的肺成纖維細(xì)胞中減少膠原蛋白合成并阻斷促纖 維化細(xì)胞因子的促有絲分裂作用（Kaneko等人，1998 ;Raghu等人，1999)。在一項采用IPF 患者的II期試驗中，存活率改善，肺功能試驗在一些患者中穩(wěn)定化或改善并且不存在嚴(yán)重 副作用。但是，胸部放射攝影未改善，數(shù)據(jù)難以解釋并需要額外研究以評估有效性（Raghu 等人，1999)。來自一項III期臨床試驗的結(jié)果表明吡非尼酮可能在IPF患者中積極地影響 肺功能（Bouros，2011)，并且最近，它在歐洲、日本和印度獲得批準(zhǔn)，不過其精確作用機(jī)制不 清楚。FDA要求額外的臨床試驗以在批準(zhǔn)前評價吡非尼酮有效性。
[0007] 盡管存在令人鼓舞的相似體外研究，但是采用抵抗皮質(zhì)類固醇或免疫抑制療法的 IPF患者的基于干擾素的臨床試驗未顯示改善。在采用小群體IPF患者的另一項研究中，與 潑尼松組合的情況下存在針對干擾素 Y的有利反應(yīng)（Ziesche等人，1999)。一項采用干擾 素的更新近臨床試驗在2007中斷，原因在于與接受安慰劑的患者相比，無效和患者死亡率 略微增加。
[0008] 在此刻，吡非尼酮是規(guī)定用于IPF的唯一藥物，它可能延遲肺功能下降并改善肺 功能。
[0009] 因此，對總體上治療纖維化和尤其治療IPF的療法，存在未滿足的醫(yī)療需要。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)N-鈣黏著蛋白介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)在患有IPF的受試者中促成纖維化。 本發(fā)明因此提供一種抑制或中和N-鈣黏著蛋白活性的N-鈣黏著蛋白拮抗劑用于治療或預(yù) 防纖維化。在一種實施方式中，N-鈣黏著蛋白拮抗劑是抗N-鈣黏著蛋白抗體。在另一個 實施方案中，N-鈣黏著蛋白抗體用于治療或預(yù)防特發(fā)性肺纖維化。
[0012] 本發(fā)明也提供抑制或中和N-鈣黏著蛋白活性的N-鈣黏著蛋白拮抗劑在制備用于 治療或預(yù)防纖維化的藥物中的用途。在一個實施方案中，使用抗N-鈣黏著蛋白抗體。在另 一個實施方案中，該用途是在制備用于治療或預(yù)防特發(fā)性肺纖維化的藥物中的用途。
[0013] 本發(fā)明也提供一種治療或預(yù)防纖維化的方法，所述方法由向有需求的受試者施用 抑制或中和N-鈣黏著蛋白活性的N-鈣黏著蛋白拮抗劑組成。在一個實施方案中，該方法 包括施用抗N-鈣黏著蛋白抗體。在另一個實施方案中，該方法用于治療或預(yù)防特發(fā)性肺纖 維化。
[0014] 本發(fā)明也提供抗體、用途或方法，其中抗體與可藥用載體配制。
[0015] 本發(fā)明也提供抗體、用途或方法，其中將抗體與吡非尼酮或干擾素依次或同時共 施用。
[0016] 附圖目錄
[0017] 圖1.人肺成纖維細(xì)胞之間的細(xì)胞-細(xì)胞接觸誘導(dǎo)FMT。A.來自HLF的SMA、N-鈣 黏著蛋白和0B-鈣黏著蛋白的蛋白質(zhì)印跡，所述HLF以低細(xì)胞密度（LCD)和高細(xì)胞密度 (HCD)在TGFi3不存在或存在下接種。B.HLF培養(yǎng)物中N-鈣黏著蛋白和SMA的共染色。將 疊加區(qū)域內(nèi)的加方框區(qū)放大以顯示共染色。
[0018] 圖2. N-鈣黏著蛋白在體外參與人肺成纖維細(xì)胞至肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變。A.來自HLF 的SMA和β-肌動蛋白的蛋白質(zhì)印跡，所述HLF在TGFi3不存在或存在下接種，以Fc對照 或N-鈣黏著蛋白-Fc刺激。B. HLF中使用陰性對照siRNA和N-鈣黏著蛋白siRNA，通過 RT-PCR測量的N-鈣黏著蛋白敲減，和siRNA轉(zhuǎn)染的HLF中SMA的蛋白質(zhì)印跡。C.在TGF3 不存在或存在下，來自HLF的SMA的蛋白質(zhì)印跡，所述HLF用小鼠 IgG或N-鈣黏著蛋白阻 斷性抗體（GC-4)處理。
[0019] 圖3. N-鈣黏著蛋白敲減抑制人肺成纖維細(xì)胞中的促纖維化功能性影響。A.分別 使用N-鈣黏著蛋白-Fc或N-鈣黏著蛋白siRNA時，N-鈣黏著蛋白功能的增益和損失對HLF 遷移的影響。B.N-鈣黏著蛋白敲減對血清誘導(dǎo)的和生長因子誘導(dǎo)的HLF增殖的影響。陰性 對照siRNA的影響由黑色棒代表并且N-鈣黏著蛋白siRNA的影響由白色棒代表。C. N-鈣 黏著蛋白敲減對來自HLF的膠原蛋白分泌的影響。*表示p-值〈0. 05時的統(tǒng)計顯著性，并 且林表示p-值〈0· 001時的統(tǒng)計顯著性。
[0020] 圖4.人肺成纖維細(xì)胞中的N-鈣黏著蛋白下游信號傳導(dǎo)。A.在TGF3不存在或 存在下來自HLF的p-Ser552i3-聯(lián)蛋白和總β-聯(lián)蛋白的蛋白質(zhì)印跡。B.來自HLF的 p-Ser552 β -聯(lián)蛋白和總β -聯(lián)蛋白的蛋白質(zhì)印跡，所述HLF用陰性siRNA和Ν-鈣黏著蛋 白siRNA轉(zhuǎn)染。
[0021] 圖5.人肺成纖維細(xì)胞中N-鈣黏著蛋白至0B-鈣黏著蛋白轉(zhuǎn)變。A. HLF中使用陰 性對照siRNA和0B-鈣黏著蛋白siRNA，通過RT-PCR測量的0B-鈣黏著蛋白敲減。B.來 自TGF β不存在或存在下陰性siRNA轉(zhuǎn)染的和0B-鈣黏著蛋白siRNA轉(zhuǎn)染的HLF的SMA和 N-鈣黏著蛋白的蛋白質(zhì)印跡。C.使用0B-鈣黏著蛋白siRNA時，0B-鈣黏著蛋白損失功能 對HLF遷移的影響。
[0022] 圖6.上皮至間充質(zhì)轉(zhuǎn)變的標(biāo)志物。在TGF β或TGF β +IL-1 β不存在或存在下的 Α549細(xì)胞中通過RT-PCR測量的ΕΜΤ標(biāo)志物Ν-鈣黏著蛋白水平、波形纖維蛋白水平和Ε-鈣 黏著蛋白水平。
[0023] 圖7.Ν-鈣黏著蛋白功能的損失阻止ΕΜΤ。Α.在TGF0不存在或存在下來自Α549 細(xì)胞和HBEC的Ν-鈣黏著蛋白，波形纖維蛋白和Ε-鈣黏著蛋白的蛋白質(zhì)印跡。Β.來自TGF β 不存在或存在下用陰性對照siRNA或Ν-鈣黏著蛋白siRNA轉(zhuǎn)染的Α549細(xì)胞的Ν-鈣黏著 蛋白和波形纖維蛋白的蛋白質(zhì)印跡。C.使用N-鈣黏著蛋白-Fc時，N-鈣黏著蛋白功能的 增益對EMT的影響。D.使用N-鈣黏著蛋白中性抗體時，N-鈣黏著蛋白功能的損失對EMT 的影響。
[0024] 圖8. IPF動物模型中和IPF患者衍生的肺成纖維細(xì)胞中的N-鈣黏著蛋白表達(dá)。 A.使用石棉模型的時程實驗中來自第14日的小鼠肺切片的N-鈣黏著蛋白免疫組織化學(xué)染 色。使用PBS和Tit02作為陰性對照。B.與非IPF患者衍生（健康）的HLF相比，通過蛋 白質(zhì)印跡法測量并使用光密度測量法定量的IPF患者衍生的HLF中的N-鈣黏著蛋白表達(dá) 水平。
[0025] 圖9. IPF患者肺組織中的N-|丐黏著蛋白表達(dá)。與非IPF患者（健康）肺活組織檢 查樣品相比，通過蛋白質(zhì)印跡法測量并使用光密度測量法定量的IPF患者肺活組織檢查樣 品中的N-鈣黏著蛋白表達(dá)水平。SDS-PAGE圖像上方的每個編號表示不同的患者。統(tǒng)一每 位健康供體的數(shù)據(jù)。RUL，右上葉；RML，右中葉；RLL，右下葉；LUL，左上葉；LML，左中葉；LLL， 左下葉。
[0026] 發(fā)明概述
[0027] IPF的初始事件大多未知，不過認(rèn)為它代表正常修復(fù)途徑的異常激活。在正常傷 口愈合期間，在損傷部位處的受損細(xì)胞造成促炎細(xì)胞因子局部升高，導(dǎo)致召集炎性細(xì)胞以 清除感染并召集成纖維細(xì)胞以修復(fù)受損的組織。與細(xì)胞分化和活化組合的生長因子的局部 上調(diào)導(dǎo)致傷口區(qū)域周圍的組織重塑。最后，炎癥消退并且修復(fù)過程失活（Hinz等人，2007; Tomasek等人，2002b ;Werner和Grose，2003)。認(rèn)為纖維化因炎癥期或修復(fù)途徑激活的慢性 化形成或消退的失敗而引起（Follonier等人，2008 ;Gharaee_Kermani和Phan，2005)。IPF 與其他組織（包括皮膚、肝和腎）中的纖維化共有許多相似性（Border和Noble，1994)。但 是，在大部分病例中，肺纖維化不隨其他器官中的纖維化一起共診斷，表明局部環(huán)境在造成 并維持纖維化中發(fā)揮至關(guān)重要的作用（Meltzer和Noble，2008)。
[0028] 纖維增生性疾病，包括肺纖維化、系統(tǒng)性硬化病、肝硬化和進(jìn)行性腎臟疾病，共有 共同的細(xì)胞成纖維機(jī)制和組織重塑異常。大多數(shù)纖維變性的病癥通常具有刺激物，所述刺 激物維持產(chǎn)生生長因子、蛋白水解酶、血管生成性因子和成纖維性細(xì)胞因子（包括TGFi3) 的，它們一起刺激肌成纖維細(xì)胞分化、增殖和結(jié)締組織組分沉積，這逐漸重塑并摧毀正常組 織構(gòu)造 （Tomasek 等人，2002a ;Friedman，2004 ;Chatziantoniou 和 Dussaule，2005)。因此， 干擾以上過程的N-鈣黏著蛋白阻斷劑可以不僅用于治療IPF，還用于治療其他纖維變性的 病癥。
[0029] 成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞在纖維化中的重要性
[0030] 成纖維細(xì)胞是間質(zhì)譜系的細(xì)胞，其主要功能是為組織提供結(jié)構(gòu)性支撐維持胞外基 質(zhì)穩(wěn)態(tài)。成纖維細(xì)胞分泌胞外基質(zhì)的主要組分，膠原蛋白。與纖維化中過多膠原蛋白產(chǎn)生 的重要性一致，成纖維細(xì)胞是纖維變性的疾病進(jìn)展中的關(guān)鍵細(xì)胞并且在纖維變性的組織的 損傷中發(fā)現(xiàn)其數(shù)目增加（Hinz，2007 ;Tomasek等人，2002b)。認(rèn)為纖維變性的損傷中的成纖 維細(xì)胞源自3個可能來源：首先，常駐性成纖維細(xì)胞增殖并遷移至纖維變性的病灶（Zhang 等人，1994)。第二，成纖維細(xì)胞據(jù)信通過上皮細(xì)胞在稱作上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變（EMT) 的過程中反分化而形成（Kim等人，2006 ;Willis等人，2005)并且第三，據(jù)信招募了稱作纖 維細(xì)胞的循環(huán)型間充質(zhì)祖細(xì)胞（Abe等人，2001 ;Hinz，2007 ;Phillips等人，2004)。這些過 程中每一個過程在IPF形成中的相對作用仍待確定。除成纖維細(xì)胞數(shù)目增加之外，細(xì)胞的 表型還改變。這些細(xì)胞正常情況下是相對靜息的，然而在纖維化部位處，成纖維細(xì)胞呈現(xiàn) 過度增殖、過度分泌和促炎，更為能動并更有收縮性并且抵抗凋亡（Horowitz等人，2004 ; Horowitz 等人，2006 ;Raghu 等人，1988 ;Zhang 和 Phan，1999 ;Zhang 等人，1994)。實現(xiàn)這 些表型改變的機(jī)制之一是成纖維細(xì)胞在稱作成纖維細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變（FMT)的過程 中反分化成肌成纖維細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞以表達(dá)收縮性細(xì)胞骨架蛋白平滑肌肌動蛋白為特 征。平滑肌肌動蛋白提供更大的機(jī)械強(qiáng)度，導(dǎo)致細(xì)胞促遷移和促收縮（pro-migratory and pro-contractile) (Hinz 等人，2003 ;Hinz 和 Gabbiani，2003a ;Tomasek 等人，2002b)。
[0031] 此外，相對于靜息的成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞具有促增殖性和促分泌性（Sebe 等人，2008)。在正常傷口愈合過程期間，F(xiàn)MT由分泌型介質(zhì)如TGF0誘導(dǎo)，肌成纖維細(xì)胞 遷移至傷口部位中，在那里它們介導(dǎo)組織重塑并且隨后發(fā)生凋亡。在IPF中，肌成纖維細(xì) 胞具有上文描述的促纖維變性的表型，高度富集于纖維變性的損傷中并發(fā)現(xiàn)它們抵抗凋亡 (Horowitz 等人，2004 ;Vittal 等人，2005 ;Zhang 和 Phan，1999)。
[0032] 傷口愈合和纖維化中的細(xì)胞-細(xì)胞接觸
[0033] 胞間黏附由涉及特定分子復(fù)合體的細(xì)胞-細(xì)胞接觸介導(dǎo)，所述分子復(fù)合體在細(xì) 胞-細(xì)胞通訊中發(fā)揮特殊作用（Gumbiner，2005a ;Gumbiner，2005b ;Nelson 和 Nusse， 2004)。這些連接復(fù)合物限定細(xì)胞-細(xì)胞粘附的強(qiáng)度和功能。最常見類型的胞間連接之一 是黏著連接。黏著連接以存在稱作鈣黏著蛋白的鈣依賴性黏附分子為特征，所述鈣依賴性 黏附分子通過跨細(xì)胞同型相互作用直接介導(dǎo)細(xì)胞 -細(xì)胞接觸（Gumbiner，2005b ;Patel等 人，2003)。經(jīng)典的鈣黏著蛋白，其包括E-鈣黏著蛋白和N-鈣黏著蛋白，在它們的相互作用 方面顯示高水平的特異性，與相鄰細(xì)胞上的相同鈣黏著蛋白同工型偏好地結(jié)合，并在細(xì)胞 識別和組織維持中發(fā)揮重要作用（Takeichi，1991)。通過激活聯(lián)蛋白并且通過直接相互作 用并與RTK交互作用，鈣黏著蛋白與對RTK信號傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架重排和基因表達(dá)的多種效應(yīng) 偶聯(lián)（Nelson和Nu SSe，2004)。不同的鈣黏著蛋白導(dǎo)致對信號傳導(dǎo)途徑的差異性影響并且 因此對增殖反應(yīng)、遷移反應(yīng)和其他細(xì)胞反應(yīng)賦予不同的影響（Gumbiner，2005b ;Takeichi， 1991) 鈣黏著蛋白在神經(jīng)元中高度表達(dá)，形成相對弱的短壽嗜同性相互作用并因此與細(xì) 胞遷移增加相關(guān)，而E-鈣黏著蛋白在上皮細(xì)胞中表達(dá)，形成緊密的較長壽的嗜同性相互作 用并且因此與不遷移和維持上皮屏障功能相關(guān)。0B-鈣黏著蛋白在成骨細(xì)胞中高度表達(dá)，形 成緊密和穩(wěn)定的黏附作用并偶聯(lián)于促增殖性信號傳導(dǎo)途徑以響應(yīng)于骨萎縮或損傷而增強(qiáng) 骨（Nelson和Nusse，2004;Williams等人，1994)。鈣黏著蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)換與獲得和喪失這 些細(xì)胞特征相關(guān)并且這些所謂"鈣黏著蛋白轉(zhuǎn)換"限定了發(fā)育期間和成年組織中功能轉(zhuǎn)換 方面的關(guān)鍵階段。例如，這類轉(zhuǎn)換是E-鈣黏著蛋白在不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)變成N-鈣黏著蛋白 和當(dāng)血管生成期間需要血管系統(tǒng)塑性時內(nèi)皮細(xì)胞中VE-鈣黏著蛋白轉(zhuǎn)變成N-鈣黏著蛋白 (Luo和Radice，2005 ;Takeichi，1991 ;Thiery等人，2009)。此外，鈣黏著蛋白已經(jīng)與眾多疾 病的病理學(xué)相關(guān)。0B-鈣黏著蛋白與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的骨及關(guān)節(jié)重塑相關(guān)（Farina等人， 2009)。上皮細(xì)胞中從E-鈣黏著蛋白向N-鈣黏著蛋白的轉(zhuǎn)換與EMT相關(guān)，所述EMT導(dǎo)致許 多腫瘤中增加的侵襲力和轉(zhuǎn)移（Cavallaro等人，2002 ;Thiery等人，2009)，并且從VE-鈣 黏著蛋白向N-|丐黏著蛋白的轉(zhuǎn)換與腫瘤進(jìn)展中的血管生成相關(guān)（Blaschuk和Rowlands, 2000 ;Luo和Radice，2005)。先前已經(jīng)顯示在傷口愈合期間，胞間通訊在組織修復(fù)中發(fā)揮關(guān) 鍵作用（Follonier 等人，2008 ;Scotton 和 Chambers，2007)。
[0034] 傷口中增加的活化型肌成纖維細(xì)胞密度導(dǎo)致細(xì)胞-細(xì)胞接觸數(shù)目增加和使胞外 基質(zhì)收縮的機(jī)械性力發(fā)生性胞間網(wǎng)絡(luò)的形成，從而封閉傷口。在健康肺中，成纖維細(xì)胞散在 胞外基質(zhì)的各處，調(diào)節(jié)基質(zhì)蛋白沉積和降解之間的平衡。因此，在正常條件下成纖維細(xì)胞很 少靠近到足以形成細(xì)胞-細(xì)胞接觸。黏著連接不存在于不形成應(yīng)力纖維的正常組織成纖維 細(xì)胞中（Welch等人，1990)。一項先前報道已經(jīng)提出，肌成纖維細(xì)胞分化伴隨協(xié)調(diào)細(xì)胞收縮 性的黏著連接的形成（Hinz等人，2003 ;Hinz和Gabbiani，2003b ;Hinz等人，2004)。又一 項研究展示，不同于不形成黏著連接的正常成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞顯示明顯較高的收 縮協(xié)調(diào)作用（Follonier等人，2008)。
[0035] 纖維化的臨床前模型
[0036] 已經(jīng)開發(fā)幾個動物模型以研究肺纖維化并且已經(jīng)用它們來鑒定可能參與人IPF 形成的關(guān)鍵細(xì)胞、分子和過程。這些模型系統(tǒng)各自具有優(yōu)點和缺點，但是它們均未清晰和充 分地概括這些機(jī)制和人類疾病表現(xiàn)（Moore和Hogaboam，2008)。
[0037] IPF的博來霉素模型是最常使用和表征最充分的鼠模型。這種抗生素的施用在大 量動物-小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬和靈長類中導(dǎo)致肺毒性、肺損傷和纖維化。初始病變影響 肺內(nèi)皮，這允許藥物抵達(dá)肺泡，在肺泡中，病理學(xué)反應(yīng)包括肺泡上皮損傷、液體和血漿泄漏 在肺泡腔中、I型肺泡細(xì)胞壞死和II型肺泡細(xì)胞組織變形。炎性和間充質(zhì)細(xì)胞浸潤、改變 的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞相互作用和纖維化跡象在胸膜下區(qū)域內(nèi)明顯。隨后，清除炎性細(xì) 胞，成纖維細(xì)胞增殖并合成胞外基質(zhì)（Phan等人，1980 ;Thrall等人，1979)。將積累的膠原 蛋白作為所致纖維化的標(biāo)志計量（Muggia等人，1983)。這個模型的缺點是，纖維化不在全 部動物中形成，該過程是株系依賴的（Schrier等人，1983)，并且纖維化具有自限性并消退 而非緩慢進(jìn)展和不可逆（Phan等人，1983)。因此，人IPF的最關(guān)鍵特征之一不存在于這個 模型中。
[0038] 在嚙齒類動物肺中施用礦物纖維導(dǎo)致與人類中與職業(yè)性暴露于礦物粉塵和氣溶 膠后所形成的損傷相似的纖維變性的區(qū)域發(fā)生。這用來形成IPF的石棉模型。這個模型中 的反應(yīng)以支氣管肺泡灌洗液中纖維變性的區(qū)域和炎性浸潤為特征。石棉不從肺清除并且因 此纖維化刺激具有持續(xù)性（Davis等人，1998b ;Davis等人，1998a)。但是，這種反應(yīng)是株系 依賴性的并且抗炎療法無效（Barbarin等人，2005)。
[0039] 其他模型包括FITC誘導(dǎo)型、照射誘導(dǎo)型纖維化模型和病毒靶向的轉(zhuǎn)基因模型。 FITC滴注導(dǎo)致炎性浸潤和上皮增生，但是纖維變性的變化僅在FITC沉積的區(qū)域中明顯 (Roberts等人，1995)。照射模型是株系依賴的（Sharplin和Franko, 1989)。病毒轉(zhuǎn)基因 劑誘導(dǎo)的纖維化沒有持續(xù)性并且優(yōu)勢地影響上皮細(xì)胞（Engelhardt等人，1994)。
[0040] 總之，IPF的動物模型代表了研究和驗證可能促成疾病細(xì)胞、介質(zhì)和過程的良好研 究工具，但是尚未作為人類疾病的預(yù)示性臨床前模型建立，并且最近已經(jīng)描述了動物模型 中和臨床試驗中藥物效果的主要差異（Moeller等人，2008 ;Perel等人，2007)。
[0041] 在本申請的情況下，因此通過體外實驗采用源自健康供體和IPF患者二者的原代 疾病相關(guān)性人肺成纖維細(xì)胞（HLF)以及采用II型肺泡細(xì)胞系（A549)獲得最有預(yù)示性的數(shù) 據(jù)。這些包括目的基因表達(dá)水平比較、功能的損失和增益對HLF中的FMT、增殖、遷移和存 活的影響和對A549細(xì)胞中的EMT的影響。相似的功能性數(shù)據(jù)廣泛地在科學(xué)文獻(xiàn)和藥物發(fā) 現(xiàn)中用來預(yù)測潛在IPF靶的抗纖維變性的作用（King，Jr.等人，2011 ;M〇eller等人，2008 ; Selman 等人，2001)。
[0042] 使用這些方法（見實施例），我們已經(jīng)展示以高細(xì)胞密度培養(yǎng)時，體外在人肺成纖 維細(xì)胞（HLF)中形成胞間接觸。這些細(xì)胞表達(dá)N-鈣黏著蛋白并且這種表達(dá)與SMA表達(dá)相 關(guān)。我們顯示N-鈣黏著蛋白在調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞至肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，膠原蛋白分泌、成纖 維細(xì)胞增殖與遷移和PI3_K、Akt依賴性存活途徑中發(fā)揮作用。另外，N-鈣黏著蛋白表達(dá) 在TGFi3和IL-1 β誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變期間增加，并且針對N-鈣黏著蛋白 的siRNA抑制ΕΜΤ。發(fā)現(xiàn)Ν-鈣黏著蛋白在IPF的石棉臨床前小鼠模型和來自IPF患者的肺 的成纖維細(xì)胞中上調(diào)。綜上，這些數(shù)據(jù)表明N-鈣黏著蛋白在成纖維細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn) 變、成纖維細(xì)胞功能和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變中的新作用并且表明N-鈣黏著蛋白和細(xì) 胞-細(xì)胞黏附作用調(diào)節(jié)纖維變性的表型的形成。N-鈣黏著蛋白是用于治療IPF和其他纖維 變性的病癥的重要新靶。
[0043] 這些研究結(jié)果清晰指出，N-鈣黏著蛋白參與驅(qū)動伴隨纖維化（IPF)的組織重塑， 并且抗N-鈣黏著蛋白療法將是用于患有IPF或其他纖維增生性疾病的受試者的可用治療。
[0044] 人成熟N-鈣黏著蛋白多肽具有如下序列。胞外結(jié)構(gòu)域加下劃線。
[0045] MCRIAGALRTLLPLLAALLQASVEASGEIALCKTGFPEDVYSAVLSKDVHEGQPLLNVKFSNCNGKRKV QYESSEPADFKVDEDGMVYAVRSFPLSSEHAKFLIYAQDKETQEKWQVAVKLSLKPTLTEESVKESAEVEEIVFPRQ FSKHSCHLQRQKRDffVIPPINLPENSRGPFPQELVRIRSDRDKNLSLRYSVTGPGADQPPTGIFIINPISGQLSYTK PLDREQIARFHLRAHAVDINGNQVENPIDIVINVIDMNDNRPEFLHQVffNGTVPEGSKPGTYVMTVTAIDADDPNAL NGMLRYRIVSQAPSTPSPNMFTINNETCDIITVRAGLDREKVQQYTLIIQATDMEGNPTYGLSNTATAVITVTDVND NPPEFTAMTFYGEYPENRYDIIYANLTYTDKDQPHTPAffNAVYRISGGDPTGRFAIQTDPNSNDGLVTVYKPIDFET NRMFVLTVAAENQVPLAKGIQHPPQSTATVSVTVIDVNENPYFAPNPKIIRQEEGLHAGTMLTTFTAQDPDRYMQQN IRYTKLSDPANffLKIDPVNGQITTIAVLDRESPNVKNNIYNATFLASDNGIPPMSGTGTLQIYLLDINDNAPQVLPQ EAETCETPDPNSINITALDYDIDPNAGPFAFDLPLSPVTIKRNffTITRLNGDFAQLNLKIKFLEAGIYEVPIIITDS GNPPKSNISILRVKVCQCDSNGDCTDVDRIVGAGLGTGAIIAILLCIIILLILVLMFVVWMKRRDKERQAKQLLIDP EDDVRDNILKYDEEGGGEEDQDYDLSQLQQPDTVEPDAIKPVGIRRMDERPIHAEPQYPVRSAAPHP⑶I⑶FINEG LKAADNDPTAPPYDSLLVFDYEGSGSTAGSLSSLNSSSSGGEQDYDYLNDWGPRFKKLADMYGGGDD
[0046] 可用于實施本發(fā)明的拮抗劑
[0047] 原則上，抑制或中和N-鈣黏著蛋白活性的任何拮抗劑，如LMW拮抗劑、siRNA拮抗 劑或生物治療性拮抗劑，例如抗體，可以用于本發(fā)明中?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的這類拮抗劑的 例子在以下文獻(xiàn)中公開：
[0048] 第一種測試用于治療癌癥的N-鈣黏著蛋白拮抗劑是ADH-1，一種含有組氨酸-丙 氨酸-纈氨酸（HAV) N-鈣黏著蛋白胞外結(jié)構(gòu)域識別基序的環(huán)狀五肽。用于癌癥治療的N-鈣 黏著蛋白肽拮抗劑的例子在 W02004048411、W02004044000、US20090291967、W02006116737、 W02009055937中描述。已經(jīng)提交了關(guān)于ADH-1的具有改善效力的LMW類似物的眾多專利申 請，但是尚無臨床進(jìn)展報道（Burden-Gulley等人，2009)。
[0049] 用于診斷、評價和治療癌癥的N-鈣黏著蛋白抗體在W02007109347、 W02009124281、W02010054377和W02011119888中描述。一篇最新論文描述了 N-鈣黏著蛋 白抗體在治療前列腺癌臨床前模型中的用途（Tanaka等人，2010))。W02011071543公開了 用于治療多種非纖維變性的疾病的額外N-鈣黏著蛋白抑制劑。
[0050] 可以通過測量促纖維變性的功能性影響（FMT、增殖、膠原蛋白分泌、遷移、存活 等）評估體外N-|丐黏著蛋白活性的抑制或中和，如先前（Hinz等人，2007 ;King，Jr.等人， 2011 ;Phan，2002 ;Raghu 等人，2011 ;Scotton 和 Chambers，2007 ;Zhang 等人，1994)和本申 請中所描述。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗N-鈣黏著蛋白抗體（IgG、沉默型IgG、Fab 或其他）以小于1〇ηΜ、5ηΜ、2. 5ηΜ、1. 0ηΜ、0. 5nM或更小的IC5(I抑制促纖維變性的功能性反 應(yīng)。
[0051] 如本文所用，術(shù)語"抗體"意指包含來自免疫球蛋白基因或其片段的框架區(qū)的多 肽，其中所述抗體如上文所述特異性結(jié)合并識別表位，例如在N-鈣黏著蛋白上存在的表 位。因此，術(shù)語"抗體"包括完整抗體（如單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體和人抗體）， 包括單鏈完整抗體，和其抗原結(jié)合片段。術(shù)語"抗體"包括結(jié)合抗原的抗體片段，包括單鏈 抗體，其可以包含單獨的或與以下多肽元件的全部或部分組合的可變區(qū)：抗體分子的鉸鏈 區(qū)、（?域、CH 2域和CH3域。在該定義內(nèi)部還包括可變區(qū)和鉸鏈區(qū)、（?域、CH2域和CH 3域 的任何組合?？贵w片段例如包括但不限于？813、？313'和？(313'）2、？(1、單鏈？￥8(8〇?￥)、單鏈 抗體、二硫鍵連接的Fvs(sdFv)和包含域或\^域的片段。例子包括（i)Fab片段，一種 由'、V H、（^和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；（ii)F(ab'）2片段，一種包含由二硫鍵在鉸鏈區(qū) 連接的兩個Fab片段的雙價片段；（iii)由V H和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；（iv)由抗體單 臂的' 和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；（v)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段（Ward等人，Nature 341:544-546, 1989 ;Muyldermans 等人，TIBS 24:230-235,2001);和（vi)分離的互補(bǔ)性決 定區(qū)（⑶R)。術(shù)語"抗體"包括單結(jié)構(gòu)域抗體、大抗體（maxibody)、微型抗體（minibody)、胞 內(nèi)抗體、雙抗體、三鏈抗體（triabody)、四體抗體（tetrabody)、v_NAR和雙-scFv (見，例如， Hollinger和Hudson，Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 (2005))?？贵w的抗原結(jié)合部 分可以移植至基于多肽（如纖連蛋白III型（Fn3))的支架中（見美國專利號6, 703, 199， 其描述纖連蛋白多肽單體抗體）?？梢詫⒖乖Y(jié)合部分并入單鏈分子中，其中所述單鏈分子 包含一對串聯(lián)Fd區(qū)段（VH-CH1-VH-CH1)，它們與互補(bǔ)性輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū) (Zapata 等人，Protein Eng. 8 (10) : 1057-1062 (1995);和美國專利號 5, 641，870)。
[0052] 優(yōu)選地，在本發(fā)明中使用的抗體與N-鈣黏著蛋白特異性結(jié)合。優(yōu)選地，在本發(fā)明 中使用的抗體不與除N-鈣黏著蛋白之外的抗原交叉反應(yīng)。
[0053] 如本文所用，"與N-鈣黏著蛋白特異性結(jié)合"的抗體意指以1χ1(Γ8Μ或更小、1x10， 或更小或lxlO^M或更小的K D與Ν-鈣黏著蛋白結(jié)合的抗體。如本文所用，"與非Ν-鈣黏著 蛋白的抗原交叉反應(yīng)"的抗體意指以〇. 5χ1(Γ8Μ或更小、5χ1(Γ9Μ或更小或2χ1(Γ9Μ或更小的 KD與該抗原結(jié)合的抗體。
[0054] 在一個備選實施方案中，在本發(fā)明中使用的抗體是交叉阻斷一種或多種上文提 及的抗體的一種抗體。通過"交叉阻斷"，意指干擾另一種抗體與N-鈣黏著蛋白結(jié)合的抗 體。這種干擾可以例如使用競爭測定法，利用Biacore或ELISA檢測到，這類競爭測定法在 W02008/133722 中描述。
[0055] "纖維化"，"纖維變性的疾病"或"纖維增生性疾病"意指當(dāng)損傷時修復(fù)過程中形成 過多的纖維結(jié)締組織。瘢痕化是消除受累器官或組織構(gòu)造的持續(xù)纖維化的結(jié)果。作為不清 理形成的瘢痕組織的異常修復(fù)過程的結(jié)果，纖維化進(jìn)一步發(fā)展。纖維化可以存在于多種組 織中，包括肺、肝、皮膚和腎。纖維化的例子包括肺纖維化、肝硬化、系統(tǒng)性硬化病和進(jìn)行性 腎臟疾病。
[0056] "特發(fā)性肺纖維化（IPF) "是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎（IIP)(-種類型的間質(zhì)性肺?。?的特定表現(xiàn)。間質(zhì)性肺病，也稱作彌散性實質(zhì)性肺?。―PLD)，指一組影響間質(zhì)的肺疾病。在 微觀上，來自IPF患者的肺組織顯示稱作普通間質(zhì)性肺炎（UIP)的組織學(xué)特征的特征性集 合。UIP因此是IPF的病理展示。
[0057] 其他形式的IIP包括非特異性間質(zhì)性肺炎（NSIP)、剝脫性間質(zhì)性肺炎（DIP)和急 性間質(zhì)性肺炎（AIP)。間質(zhì)性肺病的已知病因的例子包括肉樣瘤病、過敏性肺炎、肺朗格漢 斯細(xì)胞組織細(xì)胞增多癥、石棉肺和膠原蛋白血管疾病如硬皮病及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
[0058] 詞"治療"指其結(jié)局是病情至少部分逆轉(zhuǎn)，即纖維化至少部分逆轉(zhuǎn)的療法。
[0059] 詞"防止"指其結(jié)局是停止或至少減緩病情進(jìn)展，即至少減緩纖維化進(jìn)展的療法。
[0060] 藥物組合物
[0061] 在本發(fā)明中使用的抗體通常配制為含有與可藥用載體配制在一起的一種單克隆 抗體或單克隆抗體組合的組合物，例如，藥物組合物。例如，在本發(fā)明中使用的藥物組合物 可以包含與N-鈣黏著蛋白上不同表位結(jié)合或具有互補(bǔ)活性的抗體的組合。
[0062] 在本發(fā)明中使用的藥物組合物也可以在聯(lián)合療法中施用，即，與其他藥劑組合。例 如，聯(lián)合療法可以包括與吡非尼酮或干擾素組合的抗-N-鈣黏著蛋白抗體。這類組合可以 同時或依次地施用。如果依次施用，在施用每種藥物之間的時間可以是一周或更短（例如 一日或更短時間、12小時或更短時間、6小時或更短時間、1小時或更短時間、30分鐘或更短 時間）。該組合物優(yōu)選地在生理pH配制。
[0063] 如本文所用，"可藥用載體"包括生理上相容性的任何和全部溶劑、分散介質(zhì)、包 衣、抗菌藥和抗真菌藥、等滲劑和吸收延遲劑等。載體應(yīng)當(dāng)適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、 脊髓或表皮施用（例如，通過注射或輸注）。取決于施用途徑，活性化合物（即抗體、免疫綴 合物或雙特異性分子）可以包覆于保護(hù)該化合物免遭可能使這種化合物失活的酸和其他 天然條件作用的材料內(nèi)。
[0064] 這類藥物組合物可以還包含可藥用的抗氧化劑?？伤幱每寡趸瘎┑睦影ǎ核?溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；油溶性 抗氧化劑，如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基苯甲醚（BHA)、丁羥甲苯（BHT)、卵磷脂、掊酸 丙酯、α-生育酚等；和金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸 等。
[0065] 這些組合物也可以含有輔助劑如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^上文 的消毒方法和通過納入多種抗菌劑和抗真菌劑例如，對羥苯甲酸、三氯叔丁醇、苯酚、山梨 酸等確保防止存在微生物。還可能想要將等滲劑如糖、氯化鈉等納入所述組合物。此外，可 注射藥物形式的延長吸收可以通過納入延遲吸收的物質(zhì)如單硬脂酸鋁和明膠而實現(xiàn)。
[0066] 可藥用載體包括無菌水溶液或分散體和用于現(xiàn)場制備無菌可注射溶液劑或分散 劑的無菌粉末。用于藥學(xué)活性物質(zhì)的此類介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域已知的。除了任何常 規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容的情況下之外，構(gòu)思了所述介質(zhì)或試劑在本發(fā)明藥物組 合物中的用途。補(bǔ)充性活性化合物也可以并入組合物中。
[0067] 治療性組合物一般必須是無菌和在制備和儲存條件下穩(wěn)定的。該組合物可以配制 為溶液、微乳液、脂質(zhì)體或適合高藥物濃度的其他有序結(jié)構(gòu)。載體可以是溶劑或含有例如 水、乙醇、多元醇（例如丙三醇、丙二醇和液體聚乙二醇等）的分散介質(zhì)，及其合適的混合 物?？梢岳缤ㄟ^使用包衣如卵磷脂、在分散體的情況下通過維持要求的粒度和通過使用 表面活性劑，維持適宜的流動性。在許多情況下，可以在組合物中包括等滲劑例如糖、多元 醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延長吸收可以通過在組合物中包含延遲吸 收的物質(zhì)例如單硬脂酸鹽和明膠而實現(xiàn)。
[0068] 可以通過將活性化合物以要求的量連同上文所列舉的一種成分或成分組合加入 到合適的溶劑中，根據(jù)需要，隨后無菌微量過濾，制備無菌可注射溶液劑。通常，通過將所述 活性化合物并入無菌溶媒中來制備分散體，所述無菌溶媒含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和來自上文所 列舉那些成分中的所要求的其他成分。在用于現(xiàn)場制備無菌可注射溶液劑的無菌粉末情況 下，制備方法是真空干燥法和冷凍干燥（凍干）法，所述方法產(chǎn)生有效成分的粉末，該粉末 還含有來自先前無菌過濾的溶液中的任何額外的想要的成分。
[0069] 可以與載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型的有效成分的量將根據(jù)正在治療的受試者 和具體施用模式變動?？梢耘c載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型的有效成分的量通常將是組合 物的產(chǎn)生治療效果的量?？傮w上，以100%計，這個量將是與可藥用載體組合時約0. 01 %至 約99 %的有效成分，約0. 1 %至約70 %，或約1 %至約30 %的有效成分。
[0070] 調(diào)整劑量方案以提供最佳的想要的反應(yīng)（例如，治療反應(yīng)）。例如，可以施用單次 快速濃注，可以隨時間推移施用幾個分開的劑量，或可以如治療情況的危急性所示，按比例 減少或增加該劑量。特別有利的是以劑量單位形式配制腸胃外組合物以易于劑量的施用和 均勻性。如本文所用的劑量單位形式指適合作為用于待治療受試者的單一劑量的物理分立 的單元；每個單元含有預(yù)定量的活性化合物和所需要的藥用載體，所述的預(yù)定量經(jīng)計算產(chǎn) 生所需的治療效果。用于本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)格由活性化合物的獨特特征和待實現(xiàn)的 特定治療效果以及本領(lǐng)域配藥法的內(nèi)在局限性所決定并且完全取決于此，所述內(nèi)在局限性 例如是所述用于治療的活性化合物的個體敏感性。
[0071] 為了施用抗體，劑量是約0. 0001mg/kg宿主體重至約100mg/kg宿主體重和更常見 地約0. 01mg/kg宿主體重至約5mg/kg宿主體重。例如，齊[J量可以是約0. 3mg/kg體重、約 lmg/kg體重、約3mg/kg體重、約5mg/kg體重、約10mg/kg體重、約20mg/kg體重、約30mg/ kg體重或在約1-約30mg/kg或約1-約10mg/kg范圍內(nèi)。示例性治療方案需要施用約每周 一次、約每兩周一次、約每三周一次、約每四周一次、約每月一次、約每三個月一次、約每三 個月至六個月一次、約每六個月一次或約每年一次。用于本發(fā)明抗N-鈣黏著蛋白抗體的劑 量方案包括通過靜脈內(nèi)施用約lmg/kg體重或約3mg/kg體重，同時使用以下給藥方案之一 給予抗體：約每四周給予六個劑量，隨后約每三個月；約每三周；約3mg/kg體重一次，隨后 每三周約lmg/kg體重。
[0072] 在一些方法中，同時或依次施用具有不同結(jié)合特異性的兩種或更多種單克隆抗 體，在這種情況下，施用的每種抗體的劑量落在所示的范圍內(nèi)。組合可以是抗IL4抗體與 抗N-鈣黏著蛋白抗體的組合。通常在多個時刻上施用抗體。單次劑量之間的間隔期可以 例如是每周、每月、每三個月、每六個月或每年。間隔期也可以是不規(guī)則的，如通過測量患 者中針對靶抗原的抗體的血液水平所指示。在一些方法中，調(diào)整劑量以實現(xiàn)約1 μ g/ml-約 1000 μ g/ml的血楽抗體濃度，并且在一些方法中實現(xiàn)約25 μ g/ml-約300 μ g/ml的血楽抗 體濃度。
[0073] 可選地，抗體可以作為持續(xù)釋放形式施用，在這種情況下需要較少頻率的施用。齊IJ 量和頻率根據(jù)抗體在患者中的半壽期變動。通常，人抗體顯示最長的半壽期，隨后是人源化 抗體、嵌合抗體和非人抗體。施用的劑量和頻率可以根據(jù)治療是否為預(yù)防性或治療性而變 動。在預(yù)防性應(yīng)用中，相對低的劑量以相對地不頻繁的間隔期在長的時間范圍內(nèi)施用。一 些患者繼續(xù)接受治療持續(xù)其余生。在治療性應(yīng)用中，有時需要以相對短的間隔期上相對高 的劑量直至疾病的進(jìn)展減低或終止或直至患者顯示出部分或完全的疾病癥狀改善。此后， 患者可以按預(yù)防性方案施用。
[0074] 可以變動有效成分在本發(fā)明藥物組合物中的實際劑量水平，從而以獲得有效成分 的量，其中對于特定患者、組合物和施用模型，所述的量有效實現(xiàn)想要的治療反應(yīng)，而對患 者無毒。選擇的劑量水平將取決于多種藥物代謝動力學(xué)因素，包括所用的本發(fā)明特定組合 物或其酯、鹽或酰胺的活性、施用途徑、施用時間、正在使用的化合物的排泄速率、治療的持 續(xù)期、與所用特定組合物聯(lián)合使用的其他藥物、化合物和/或材料、正在治療的患者的年 齡、性別、重量、狀況、總體健康和既往醫(yī)史等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟知的因素。
[0075] 本發(fā)明的抗N-鈣黏著蛋白抗體的"治療有效劑量"導(dǎo)致疾病癥狀的嚴(yán)重性減低、 無疾病癥狀期的頻率和持續(xù)期增加或防止因疾病侵襲所致的損傷或致殘。
[0076] 可以使用本領(lǐng)域已知的多種方法中的一種或多種，通過一種或多種施用途徑施用 本發(fā)明中使用的組合物。如技術(shù)人員將理解，施用的途徑和/或模式將取決于所希望的結(jié) 果而變動。施用本發(fā)明抗體的途徑包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊髓或其他腸胃 外施用途徑，例如通過注射或輸注。如本文所用，短語"腸胃外施用"意指除了腸內(nèi)和局部 施用之外的施用模式，通常通過注射施用，并且包括而不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、 囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、被膜下、蛛網(wǎng)膜下、脊髓內(nèi)、 硬膜外和胸骨內(nèi)（intrastemal)注射和輸注。特別優(yōu)選靜脈內(nèi)和皮下施用。
[0077] 備選地，在本發(fā)明中使用的抗體可以通過非腸胃外途徑，如局部、表皮或粘膜施用 途徑，例如鼻內(nèi)、口服、陰道、直腸、舌下或局部地施用。
[0078] 吸入施用特別優(yōu)選用于治療肺纖維化，如IPF。
[0079] 活性化合物可以連同將保護(hù)該化合物免于快速釋放的載體一起制備，如控釋制 齊U，包括植入物、經(jīng)皮貼劑和微囊化遞送系統(tǒng)。可以使用生物可降解、生物相容性聚合物， 如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制備此類 制劑的多種方法是專利授權(quán)的或總體上是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。見，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson,編著,Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
[0080] 可以用本領(lǐng)域已知的醫(yī)療裝置施用治療組合物。例如，在一個實施方案中，該組合 物可以用無針皮下注射裝置如美國專利號5, 399, 163 ;5, 383, 851 ;5, 312, 335 ;5, 064, 413 ; 4, 941，880 ;4, 790, 824或4, 596, 556中所示的裝置施用。可用于本發(fā)明中的熟知植入物 和模塊的例子包括：US4, 487, 603,其顯示用于以受控速率分配藥物的可植入式微量輸注 泵；US4,486, 194,其顯示用于經(jīng)皮膚施用藥物的治療裝置；舊4,447,233，其顯示用于以 精確輸注速率遞送藥物的藥物輸注泵；US4, 447, 224,其顯示用于連續(xù)遞送藥物的可變流 量的可植入式輸注裝置；US4, 439, 196,其顯示具有多腔區(qū)室的滲透性藥物遞送系統(tǒng)；和 US4, 475, 196,其顯示滲透性藥物遞送系統(tǒng)。這些專利通過引用的方式并入本文。許多其他 的此類植入物、遞送系統(tǒng)和模塊是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0081] 本發(fā)明也提供一種包含第一組分和第二組分的試劑盒，其中第一組分是如上文所 述的抗-N-鈣黏著蛋白抗體或藥物組合物并且第二組分是說明書。在一種實施方式中，所 述說明書教授了用于治療纖維化的抗體的用途。該試劑盒還可以包括第三組分，所述第三 組分包括以下一者或多者：注射器或其他遞送裝置、輔藥或可藥用的配制溶液。
[0082] 關(guān)于治療IPF的一般指導(dǎo)原則已經(jīng)由美國胸科學(xué)會、歐洲呼吸學(xué)會和英國胸科學(xué) 會公開（美國胸科學(xué)會，2000 ;Β· T. SOCIETY 和 S. 0· COMMITTEE，1999 ;Raghu 等人，2011)。
[0083] 概述
[0084] 術(shù)語"包含"意指"包括"以及"由組成"，例如一種包含"X"的組合物可以完全由 X組成或可以包括額外的某物，例如X+Y。
[0085] 相對于數(shù)值X，術(shù)語"約"例如意指X+10 %。
[0086] 對兩個氨基酸序列之間序列同一性百分?jǐn)?shù)的提及意指，當(dāng)比對時，這個百分?jǐn)?shù) 的氨基酸在比較兩個序列中是相同的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的軟件程序，例如Current Protocols in Molecular Biology (F.M.Ausubel 等人（編著）1987)附錄 30,第 7. 7. 18 部 分中描述的那些軟件程序，確定這個比對結(jié)果和同源性或序列同一性百分?jǐn)?shù)。使用仿射空 位檢索法，采用空位開口罰分12和空位延伸罰分2, BL0SUM矩陣62,通過Smith-Waterman 同源性檢索算法確定優(yōu)選的比對結(jié)果。Smith-Waterman同源性檢索算法在Smith和 Waterman(1981)Adv. Appl. Math. 2:482-489 中公開。 實施例
[0087] 材料和方法
[0088] 細(xì)胞培養(yǎng)物和siRNA轉(zhuǎn)染流程
[0089] 將原代性人肺成纖維細(xì)胞（Promocell)在補(bǔ)充有10 %熱滅活FBS、lmM丙酮 酸鈉和1 %青霉素/鏈霉素的DMEM中維持，并且每4日用胰蛋白酶消化處理。通過 nucleofection(Amaxa電穿孔系統(tǒng)）用siRNA電穿孔轉(zhuǎn)染近匯合性HLF。
[0090] 將IPF供體HLF(從密歇根大學(xué)獲得）在相同條件下維持。
[0091] 將A549上皮II型肺泡細(xì)胞（ATCC)在補(bǔ)充有10%熱滅活FBS和1%青霉素/鏈 霉素的DMEM中維持，并且每4日用胰蛋白酶消化處理。
[0092] 近匯合性細(xì)胞用于全部功能測定法中的鋪種。
[0093] RT-PCR、siRNA 合成和實時 RT-PCR
[0094] 將總RNA從HLF提取，轉(zhuǎn)錄成cDNA并用于RT-PCR。驗證過的TaqmanN-鈣黏著蛋 白、0B- |丐黏著蛋白、波形纖維蛋白或E- |丐黏著蛋白引物和探針從Applied Biosystems購 買。
[0095] 針對N-鈣黏著蛋白和0B-鈣黏著蛋白的小干擾性RNA從Applied Biosystems購 買。通過使用實時RT-PCR檢驗敲減效率并且證實所述效率在不同功能測定法中在刺激時 是 95%。
[0096] 共聚焦光學(xué)顯微術(shù)
[0097] 將1:1000稀釋的小鼠抗N-鈣黏著蛋白（BD Biosciences)、兔抗0B-鈣黏著蛋白 (Santa Cruz)、小鼠抗 SMA (Sigma)和兔抗 β-聯(lián)蛋白抗體（CellSignaling Technology) 用于染色4% PFA固定的HLF細(xì)胞或來自先前描述的IPF石棉模型的石蠟包埋小鼠肺切片 (De 等人，2004 ;Tan 等人，2006)。第二抗體與 AlexaFluor488 或 AlexaFluor647 (Molecular Probes)綴合。DAPI (Sigma)用來染色細(xì)胞核。通過使用Leica共聚焦顯微鏡獲得共聚焦 圖像。
[0098] 蛋白質(zhì)印跡
[0099] 在RIPA緩沖液中制備HLF、IPF供體細(xì)胞、A549細(xì)胞裂解物或肺組織裂解物。患 者肺活組織檢查研究利用生物標(biāo)本和數(shù)據(jù)由國家心臟、肺和血液研究所（NHLBI)資助的肺 組織研究聯(lián)盟（LTRC)提供。對于蛋白質(zhì)印跡，將1:1000稀釋的小鼠抗N-鈣黏著蛋白（BD Biosciences)、兔抗0B- |丐黏著蛋白（Santa Cruz)、小鼠抗SMA (Sigma)、小鼠抗波形蛋白 (DAC0)、小鼠抗E-I丐黏著蛋白（Abeam)、兔抗 β-聯(lián)蛋白（Cell Signaling Technology)、抗 兔-p-Ser562_i3-聯(lián)蛋白（Cell Signaling Technology)、兔抗 β-肌動蛋白（Santa Cruz) 和小鼠抗GAPDH(Santa Cruz)與HRP綴合的第二抗體（GE Healthcare)組合使用。使用ECL 系統(tǒng)（GE Healthcare)顯影蛋白質(zhì)印跡物。使用NIH ImageJ軟件進(jìn)行條帶強(qiáng)度的定量。 [0100] 基于細(xì)胞的功能測定法
[0101]為評估功能性反應(yīng)，將未轉(zhuǎn)染的HLF或用siRNA轉(zhuǎn)染的HLF鋪種在完全生長培養(yǎng) 基中并使其生長過夜，在無血清培養(yǎng)基中使其饑餓24小時并用不同的生長因子刺激另外 24 小時。對于 FMT 評估，將 HLF 細(xì)胞用 5ng/ml TGF β (R&D Systems)或 10 μ g/ml 人 N-鈣 黏著蛋白_Fc(R&D Systems)刺激，對于膠原蛋白分泌，用lng/mlTGFP刺激；對于增殖-用 FBS、10ng/mL PDGF-BB(R&D Systems)或 10ng/mLFGF-2(R&D Systems)并且對于遷移，用 10μ g/ml人N-鈣黏著蛋白-Fc(R&D Systems)或人0B-鈣黏著蛋白-Fc(R&D Systems)刺 激。在功能損失FMT實驗中，使用50 μ g/mlN-鈣黏著蛋白中和抗體（克隆GC-4, Sigma)。 通過針對SMA的蛋白質(zhì)印跡法評價FMT的水平。通過Sircol膠原蛋白測定法（Biocolor Life Science)測量膠原蛋白分泌。使用DELFIA系統(tǒng)（PerkinElmer)進(jìn)行增殖測定法，并 且用 Oris 系統(tǒng)（Platypus Technology)評估遷移。
[0102] 對于 EMT 評估，A549 細(xì)胞用 5ng/mlTGFP (R&D Systems)，5ng/mlTGFP (R&D Systems)和 2.5ng/mLIL_li3 (R&D Systems)組合或 N-I丐黏著蛋白 _Fc(R&D Systems)刺 激。通過針對波形纖維蛋白和E-鈣黏著蛋白的RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法或通過針對E-鈣 黏著蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)評價EMT的水平。在功能損失EMT實驗中，在18 μ g/ml N-鈣黏 著蛋白-Fc(R&D Systems)存在下使用N-|丐黏著蛋白中和工具抗體或IgG同種型對照。
[0103] 統(tǒng)計分析
[0104] 通過使用采用雙尾分布和雙樣品不等方差的Student's t-檢驗，確定統(tǒng)計顯著 性。在全部檢驗中，比較僅一個參數(shù)改變的兩個組。
[0105] 實施例1
[0106] 人肺成纖維細(xì)胞之間的細(xì)胞-細(xì)胞接觸誘導(dǎo)FMT
[0107] 為了研究HLF之間的細(xì)胞-細(xì)胞接觸是否可以誘導(dǎo)FMT，我們以低細(xì)胞密度并以 高細(xì)胞密度（LCD和HCD)鋪種原代HLF并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法以評估肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物 (SMA)的表達(dá)。重要地，在加載到凝膠上之前，將總蛋白量歸一化。在TGFi3存在和不存在 下進(jìn)行實驗。如預(yù)期，TGFi3誘導(dǎo)IXD和HCD二者中SMA表達(dá)的明顯增加。先前已經(jīng)報道 未刺激的細(xì)胞中存在少量SMA并且這歸因于培養(yǎng)物中的某種自發(fā)表達(dá)（Hinz等人，2004)。 有趣地，在基態(tài)（未刺激）條件和TGFi3刺激條件，相對于以LCD鋪種的細(xì)胞，SMA表達(dá)在 以HCD鋪種的細(xì)胞中增加。這些數(shù)據(jù)表明細(xì)胞-細(xì)胞接觸可以誘導(dǎo)FMT。
[0108] 為了進(jìn)一步研究造成HLF中SMA上調(diào)的胞間接觸的性質(zhì)，我們研究了在HLF中兩 種主要間充質(zhì)鈣黏著蛋白在LCD和在HCD時的表達(dá)水平（圖1A)。與LCD相比，N-鈣黏 著蛋白表達(dá)在HCD時大幅度上調(diào)。0B-鈣黏著蛋白表達(dá)也在HCD時增加，盡管這種增加與 N-鈣黏著蛋白相比較不明顯。TGFi3處理在兩種鋪種條件均上調(diào)N-鈣黏著蛋白和0B-鈣 黏著蛋白的表達(dá)。為了進(jìn)一步研究N-鈣黏著蛋白和SMA表達(dá)之間的聯(lián)系，將HLF針對SMA 和N-鈣黏著蛋白二者染色。形成胞間接觸的細(xì)胞傾向于呈SMA陽性并表達(dá)N-鈣黏著蛋白 (圖1B)。這些數(shù)據(jù)表明，以高細(xì)胞密度鋪種時，HLF形成細(xì)胞-細(xì)胞連接，表達(dá)N-鈣黏著 蛋白和發(fā)生FMT，因此代表IPF中臨床上有意義的高細(xì)胞密度成纖維細(xì)胞病灶。
[0109] 實施例2
[0110] N-鈣黏著蛋白在體外參與人肺成纖維細(xì)胞至肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變
[0111] 為了進(jìn)一步在成纖維細(xì)胞中研究N-鈣黏著蛋白信號傳導(dǎo)的功能性影響，我們分 別使用N-鈣黏著蛋白-Fc融合蛋白和siRNA進(jìn)行功能獲得實驗和損失實驗。將HLF用 10 μ g/mlN-鈣黏著蛋白-Fc或?qū)φ誇c片段在TGF0存在和不存在下處理24小時，并且通 過蛋白質(zhì)印跡法測量SMA (圖2A)。先前已經(jīng)展示N-鈣黏著蛋白-Fc模擬N-鈣黏著蛋白 的跨細(xì)胞嗜同性相互作用并激活N-鈣黏著蛋白信號傳導(dǎo)（Utton等人，2001)。N-鈣黏著 蛋白-Fc誘導(dǎo)SMA表達(dá)明顯增加到與采用TGF0時所見到的相似水平。對照Fc-蛋白不誘 導(dǎo)SMA表達(dá)。這個結(jié)果表明N-鈣黏著蛋白激活作用可以誘導(dǎo)FMT至類似于TGFi3的程度。 有趣地，采用TGF β和N-鈣黏著蛋白-Fc的組合時，我們沒有在這個時間觀察到對SMA表 達(dá)的加合或協(xié)同效應(yīng)。
[0112] 為了檢驗N-鈣黏著蛋白是否為FMT的原因或效果，我們用針對N-鈣黏著蛋白的 siRNA轉(zhuǎn)染HLF并檢查SMA的表達(dá)。與對照siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，用針對N-鈣黏著蛋白 的siRNA轉(zhuǎn)染的HLF具有較低的N-鈣黏著蛋白表達(dá)（圖2B)。此外，敲減N-鈣黏著蛋白導(dǎo) 致基礎(chǔ)HLF培養(yǎng)物中SMA表達(dá)顯著減少（圖2B)，表明N-鈣黏著蛋白是FMT的原因。
[0113] 為了檢驗如下假設(shè)：干擾N-鈣黏著蛋白功能而非對其蛋白質(zhì)表達(dá)敲減影響FMT， 我們還在TGFi3存在或不存在下將HLF與N-鈣黏著蛋白阻斷性抗體溫育（圖2C)并測量 SMA表達(dá)。相對于高劑量和低劑量TGFi3，N-鈣黏著蛋白阻斷性抗體抑制FMT。這些結(jié)果證 實表面N-鈣黏著蛋白的功能阻斷足以阻止TGF β誘導(dǎo)的SMA表達(dá)。
[0114] 總之，這些實驗顯示，Ν-鈣黏著蛋白調(diào)節(jié)FMT并且抑制Ν-鈣黏著蛋白功能將阻止 這個過程。
[0115] 實施例3
[0116] N-鈣黏著蛋白敲減抑制人肺成纖維細(xì)胞中的促纖維變性的功能性影響
[0117] 增加的遷移是肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志并且認(rèn)為有助于IPF的病理學(xué)。因此，我們研究 N-鈣黏著蛋白功能獲得和功能損失對HLF遷移潛力的影響。我們用細(xì)胞進(jìn)行體外傷口閉 合測定法，其中所述細(xì)胞用重組N-鈣黏著蛋白-Fc嵌合體或用N-鈣黏著蛋白siRNA處理。 用N-鈣黏著蛋白-Fc激活的N-鈣黏著蛋白信號傳導(dǎo)導(dǎo)致HLF遷移入傷口明顯增加。用 siRNA敲減N-鈣黏著蛋白減少向傷口中遷移（圖3A)。
[0118] 由于N-鈣黏著蛋白信號傳導(dǎo)已經(jīng)顯示在一些細(xì)胞類型中誘導(dǎo)增殖（Mariotti等 人，2007)，所以我們評估了 N-鈣黏著蛋白對HLF增殖的可能影響。將細(xì)胞用N-鈣黏著蛋白 siRNA轉(zhuǎn)染并且檢查它們響應(yīng)于不同濃度血清時的增殖。N-鈣黏著蛋白敲減導(dǎo)致顯著減少 的血清誘導(dǎo)增殖（圖3B)。為了更詳細(xì)地研究這種作用，我們研究了 N-鈣黏著蛋白siRNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞響應(yīng)于FGF-2和TOGF-BB的增殖性反應(yīng)（圖3B)。N-鈣黏著蛋白敲減導(dǎo)致響應(yīng) 于兩種因子的增殖的明顯喪失。這些結(jié)果顯示N-鈣黏著蛋白信號傳導(dǎo)影響響應(yīng)于一系列 生長因子的HLF增殖。
[0119] 由于膠原蛋白沉積是IPF中的關(guān)鍵事件，所以我們評估了 N-鈣黏著蛋白在來自 HLF的膠原蛋白分泌中的作用。與對照siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，N-鈣黏著蛋白siRNA轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞分泌顯著較少的膠原蛋白（圖3C)。
[0120] 總之，N-鈣黏著蛋白的激活導(dǎo)致獲得肌成纖維細(xì)胞表型，細(xì)胞展示出增加的遷移 性和增殖性反應(yīng)。N-鈣黏著蛋白功能損失導(dǎo)致全部這些作用明顯下降和膠原蛋白沉積減 少，因此表明，抑制N-鈣黏著蛋白可能在治療IPF中有益。
[0121] 實施例4
[0122] 人肺成纖維細(xì)胞中的N-鈣黏著蛋白下游信號傳導(dǎo)
[0123] N-鈣黏著蛋白與β-聯(lián)蛋白（Wnt途徑中的一種下游效應(yīng)子）直接相互作用，所述 β -聯(lián)蛋白或者與α -聯(lián)蛋白結(jié)合，使黏著連接直接連接至細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，或者轉(zhuǎn)位至胞核 并充當(dāng)啟動多種生長與分化基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。此外，已經(jīng)展示Ν-鈣黏著蛋白信號傳導(dǎo) 以細(xì)胞類型特異性方式與FGFR、c-Met、Wnt和PI3K-Akt交互作用（De等人，2004 ;Nelson 和 Nusse，2004 ;Takeichi，1991 ;Utton 等人，2001 ;Wallerand 等人，2010 ;Williams 等人， 1994)。
[0124] 為了評估HLF中響應(yīng)于纖維變性的刺激對β -聯(lián)蛋白的調(diào)節(jié)，將細(xì)胞用TGF3刺 激并且通過蛋白質(zhì)印跡法評估β-聯(lián)蛋白的表達(dá)水平和磷酸化狀態(tài)（圖4Α)。在TGFi3-刺 激的細(xì)胞中不存在總β_聯(lián)蛋白表達(dá)水平的差異。但是，當(dāng)細(xì)胞裂解物用磷酸特異性β_聯(lián) 蛋白抗體探測時，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)TGF0處理時Ser552的磷酸化增加。這個磷酸化位點最近 已經(jīng)證實是AKT的底物，并且激活這條途徑與增加的細(xì)胞存活率相關(guān)（Fang等人，2007 ; Horowitz等人，2004)。為了研究TGF0-刺激的HLF中β-聯(lián)蛋白Ser552磷酸化是否在 N-鈣黏著蛋白下游，將HLF用N-鈣黏著蛋白siRNA轉(zhuǎn)染并使用磷酰-Ser552特異性抗體探 測（圖4B)。敲減N-鈣黏著蛋白導(dǎo)致在不影響細(xì)胞中總β-聯(lián)蛋白水平的情況下幾乎徹底 抑制β -聯(lián)蛋白上的Ser552磷酸化。這些結(jié)果表明通過與ΡΙ3Κ-ΑΚΤ途徑交互作用，Ν-鈣 黏著蛋白參與肌成纖維細(xì)胞中TGFi3誘導(dǎo)的促存活信號。由于Wnt途徑和PI3K-AKT途徑 二者在IPF中均上調(diào)，這些結(jié)果突出顯示N-鈣黏著蛋白在IPF中的治療潛力。
[0125] 實施例5
[0126] 人肺成纖維細(xì)胞中N-鈣黏著蛋白至0B-鈣黏著蛋白轉(zhuǎn)變
[0127] 0B-鈣黏著蛋白是成骨細(xì)胞中高度表達(dá)的非經(jīng)典鈣黏著蛋白（Boscher和Mege， 2008)。0B-鈣黏著蛋白形成強(qiáng)相互作用并且與穩(wěn)定粘附和激活增殖性信號傳導(dǎo)途徑相關(guān) (Boscher 和 Mege，2008 ;Cavallaro 等人，2002 ;Gumbiner，2005b ;Nelson 和 Nusse，2004 ; Patel等人，2003)。由于OB-鈣黏著蛋白在間質(zhì)譜系的細(xì)胞中表達(dá)，所以我們在基態(tài)和刺激 的HLF中研究這種蛋白質(zhì)的表達(dá)。在培養(yǎng)下生長的HLF中以低水平檢測到0B-鈣黏著蛋白 表達(dá)。有趣地，0B-鈣黏著蛋白響應(yīng)于TGFP上調(diào)。0B-鈣黏著蛋白的這種上調(diào)似乎與SMA 和N-鈣黏著蛋白的表達(dá)上調(diào)同時出現(xiàn)（圖1A)。為了進(jìn)一步剖析事件的順序并且為了研究 FMT中0B-鈣黏著蛋白的作用，將HLF用對照或0B-鈣黏著蛋白siRNA轉(zhuǎn)染并且測量SMA的 表達(dá)。與對照細(xì)胞相比，用0B-鈣黏著蛋白siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)降低水平的0B-鈣黏著 蛋白（圖5A)。然而令人驚訝地，0B-鈣黏著蛋白siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)更多的SMA。由于 這與我們采用N-鈣黏著蛋白時的觀察結(jié)果形成鮮明對比，我們還評估了 0B-鈣黏著蛋白敲 減對N-鈣黏著蛋白水平的影響。與對照細(xì)胞相比，0B-鈣黏著蛋白siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá) 顯著增加水平的N-鈣黏著蛋白（圖5B)。這些結(jié)果顯示N-鈣黏著蛋白表達(dá)與TGFi3刺激 的HLF中的SMA表達(dá)相關(guān)并且盡管0B-鈣黏著蛋白表達(dá)與對照HLF中的SMA表達(dá)相關(guān)，在 0B-鈣黏著蛋白siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，存在因 N-鈣黏著蛋白補(bǔ)償性上調(diào)所致的SMA表達(dá)增 力口?？傊?，這些結(jié)果表明，用TGFi3刺激的成纖維細(xì)胞依次表達(dá)N-鈣黏著蛋白并且隨后表 達(dá)0B-鈣黏著蛋白，并且敲減0B-鈣黏著蛋白誘使細(xì)胞處于N-鈣黏著蛋白表達(dá)階段。這隨 后導(dǎo)致SMA表達(dá)增加。由于N-鈣黏著蛋白信號傳導(dǎo)的功能性影響之一是增加細(xì)胞遷移，所 以我們測試了 0B-鈣黏著蛋白siRNA對這種反應(yīng)的影響。與上文結(jié)果一致，0B-鈣黏著蛋 白siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示遷移增加（圖5C)。
[0128] 因此，在IPF中抑制N-鈣黏著蛋白并且不抑制0B-鈣黏著蛋白更可能提供治療益 處。
[0129] 實施例6
[0130] EMT期間的N-鈣黏著蛋白表達(dá)
[0131] 存在日益增長的證據(jù)：IPF進(jìn)展期間上皮細(xì)胞發(fā)生EMT (Horowitz和Thannickal， 2006 ;Kim等人，2006 ;Nieman等人，1999 ;Selman等人，2008)。在EMT期間，上皮細(xì)胞喪失 E-鈣黏著蛋白表達(dá)并且出現(xiàn)鈣黏著蛋白轉(zhuǎn)換成從頭表達(dá)的N-鈣黏著蛋白。喪失由E-鈣黏 著蛋白介導(dǎo)的穩(wěn)定細(xì)胞-細(xì)胞接觸和獲得更為動態(tài)的N-鈣黏著蛋白連接為這些細(xì)胞提供 了從上皮層脫離并遷移的信號。這種間充質(zhì)表型的獲得以損失上皮標(biāo)志（包括E-鈣黏著 蛋白）和獲得間充質(zhì)標(biāo)志（包括波形纖維蛋白）為特征（Cavallaro等人，2002 ;Shintani 等人，2008 ;Thiery 等人，2009)。
[0132] 在體外，可以通過用TGFi3和IL-1 β的組合處理上皮細(xì)胞模擬這個過程（Border 和 Noble，1994 ;Leivonen 等人，2002 ;Massague，2008 ;Willis 等人，2005)。
[0133] 使用A549細(xì)胞（源自人II型肺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞系）或原代人支氣管上皮細(xì)胞 (HBEC)，我們研究了 EMT期間N-鈣黏著蛋白的表達(dá)和作用。
[0134] 將A549細(xì)胞用與IL-Ιβ組合的TGF0處理48小時以誘導(dǎo)EMT。與先前報道（Kim 等人，2006 ;Willis等人，2005) -致，這引起E-鈣黏著蛋白的損失，波形纖維蛋白表達(dá)的獲 得和細(xì)胞伸長。在這種過程期間，使用實時PCR監(jiān)測這些EMT標(biāo)志和N-鈣黏著蛋白的表達(dá) 水平（圖6)。用TGF β和IL-1 β處理A549細(xì)胞導(dǎo)致N-鈣黏著蛋白mRNA表達(dá)增加5倍， 因此證實N-鈣黏著蛋白可以用作為EMT的標(biāo)志（Kim等人，2006 ;Willis等人，2005)。
[0135] 實施例7
[0136] N-鈣黏著蛋白損失功能阻止EMT
[0137] 在用TGF0與IL-1 β組合處理的細(xì)胞中的N-鈣黏著蛋白表達(dá)增加經(jīng)證實為N-鈣 黏著蛋白增加（圖7Α)。重要的是，我們在未處理的Α549細(xì)胞中檢測到基態(tài)Ν-鈣黏著蛋白 和波形纖維蛋白表達(dá)，這很可能歸因于該細(xì)胞是轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的事實。為了證實在未處理時 不表達(dá)Ν-鈣黏著蛋白的原代上皮細(xì)胞中的觀察結(jié)果，我們使用原代HBEC。我們用來自未處 理的和TGFi3外加 IL-Ιβ處理的細(xì)胞的裂解物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析并且檢測到Ν-鈣黏著 蛋白的從頭表達(dá)（圖7A)。為了研究N-鈣黏著蛋白功能損失對EMT的影響，我們用N-鈣黏 著蛋白siRNA或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞并評估EMT (圖7B)。TGF β和IL-1 β處理對照 siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞誘導(dǎo)ΕΜΤ特異性形態(tài)改變，S卩，細(xì)胞延伸和細(xì)胞團(tuán)中喪失特征性牢固上皮 粘附作用。通過使用蛋白質(zhì)印跡，我們還可以檢測到波形纖維蛋白表達(dá)增加。但是，在N-鈣 黏著蛋白敲減細(xì)胞中，細(xì)胞上皮形態(tài)部分地保留。另外，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)TGFi3和IL-Ιβ處理 時，N-鈣黏著蛋白敲減徹底地阻止波形纖維蛋白表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果顯示N-鈣黏著蛋白 調(diào)節(jié)引導(dǎo)EMT的關(guān)鍵細(xì)胞過程。
[0138] 為了證實N-鈣黏著蛋白功能獲得和功能損失調(diào)節(jié)EMT，而非siRNA介導(dǎo)的敲減調(diào) 節(jié)EMT，我們在工具N-鈣黏著蛋白中和抗體存在或不存在下用重組N-鈣黏著蛋白-Fc處 理A549細(xì)胞（圖7C)。我們通過使用針對E-鈣黏著蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)測量EMT。在實 驗的功能獲得設(shè)定下，添加重組N-鈣黏著蛋白-Fc造成明顯的EMT，由減少的E-鈣黏著蛋 白信號度量。EMT的程度與用TGFi3和IL-1 β處理的對照的那種程度相當(dāng)。在功能損失設(shè) 定下，用Ν-鈣黏著蛋白-Fc處理之前，將細(xì)胞與中和抗體預(yù)溫育。這導(dǎo)致徹底抑制ΕΜΤ，因 此證實，抑制N-鈣黏著蛋白導(dǎo)致阻止IPF中的這種過程。
[0139] 實施例8
[0140] 肺纖維化動物模型中和IPF患者衍生的肺成纖維細(xì)胞中的N-鈣黏著蛋白表達(dá)
[0141] 為了評估N-鈣黏著蛋白在IPF中的可能作用，我們分析N-鈣黏著蛋白在肺纖維 化臨床前動物模型-石棉小鼠模型中的表達(dá)（Tan等人，2006)。石棉是天然存在的硅酸鹽礦 物，如果吸入，則它造成進(jìn)行性肺纖維化。我們用石棉、對照礦物質(zhì)-二氧化鈦（Tit0 2)或 鹽水溶液處理小鼠64天時間，在各個時間點處死動物，收獲肺并處理獨立的樣品用于IHC 分析。在來自3個組的肺組織的切片中，通常在血管周圍血管平滑肌細(xì)胞中觀察到對SMA 的免疫染色。然而重要地，在石棉處理組中，纖維變性的組織內(nèi)一致地存在SMA信號的增 力口。對N-鈣黏著蛋白的免疫染色顯示，發(fā)生重塑的區(qū)域是表達(dá)N-鈣黏著蛋白的區(qū)域，并且 N-鈣黏著蛋白在對照動物中不表達(dá)（圖8A)。這些數(shù)據(jù)顯示N-鈣黏著蛋白在IPF臨床前 小鼠模型中肺的纖維變性的區(qū)域內(nèi)上調(diào)。
[0142] 為了尋找疾病相關(guān)的細(xì)胞類型特異性N-鈣黏著蛋白表達(dá)，我們通過蛋白質(zhì)印跡 法分析從IPF患者的肺中純化的成纖維細(xì)胞中的N-鈣黏著蛋白表達(dá)。使用來自不患IPF 的供體的人肺成纖維細(xì)胞作為對照。在IPF細(xì)胞中存在N-鈣黏著蛋白表達(dá)的高程度變異。 但是，患者細(xì)胞比對照細(xì)胞表達(dá)顯著更多的N-鈣黏著蛋白（圖8B)。
[0143] 實施例9
[0144] IPF患者肺組織活組織檢查樣品中的N-鈣黏著蛋白表達(dá)。
[0145] 另外，與健康對照相比，我們已經(jīng)通過蛋白質(zhì)印跡法分析IPF患者肺活組織檢查 樣品中N-鈣黏著蛋白的表達(dá)（圖9)。我們發(fā)現(xiàn)與健康對照相比，N-鈣黏著蛋白在大多數(shù) 分析的IPF患者肺組織中顯著上調(diào)，因此為N-鈣黏著蛋白在IPF中的作用提供額外的臨床 支持。
[0146] 討論
[0147] 生理性傷口愈合是生物中響應(yīng)于損傷時天然發(fā)生的防御機(jī)制。傷口愈合過程的不 同階段受直接和間接細(xì)胞通訊緊密調(diào)節(jié)。廣泛接受FMT是傷口愈合中的關(guān)鍵事件，是為恢 復(fù)組織構(gòu)造提供機(jī)械基礎(chǔ)必需的。類似于其他纖維化適應(yīng)癥，如硬皮病、腎與肝纖維化，認(rèn) 為IPF代表因重復(fù)性微觀損傷和消退失效所致的異常傷口愈合反應(yīng)。
[0148] 將TGF0稱作各種纖維化病狀中的成纖維總開關(guān)，與其他細(xì)胞因子協(xié)同以激發(fā) 對IPF形成和進(jìn)展的各種影響（du Bois，2010)。日益增長的眾多研究顯示IPF進(jìn)展的多 個方面受細(xì)胞-胞外基質(zhì)相互作用和直接細(xì)胞-細(xì)胞相互作用調(diào)節(jié)（Hinz和Gabbiani， 2003a)。例如，對成纖維細(xì)胞施加機(jī)械應(yīng)力導(dǎo)致SMA表達(dá)的誘導(dǎo)，而移除機(jī)械應(yīng)力減少SMA 表達(dá)（Follonier 等人，2008 ;Hinz 等人，2001 ;Hinz 和 Gabbiani，2003b ;Hinz 和 Gabbiani， 2003a)?；|(zhì)的機(jī)械特征似乎調(diào)節(jié)TGFi3作用以促進(jìn)遷移或收縮（Wipff等人，2007)。另 外這可能形成正反饋回路，因為響應(yīng)在非順從性微觀環(huán)境下的細(xì)胞收縮性，組織更剛性地 增加潛在的TGFi3激活。
[0149] 先前已經(jīng)提出，一旦肺中損傷，分隔間質(zhì)細(xì)胞與上皮的基底膜的完整性受損，因 此允許成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間的直接細(xì)胞-細(xì)胞接觸。有趣地，顯示這些直接接觸 誘導(dǎo)FMT并在成纖維細(xì)胞中促進(jìn)存活，并且同時在上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡（Horowitz和 Thannickal，2006)，表明直接干擾細(xì)胞-細(xì)胞粘附可能是治療IPF的有效治療策略。與這 種觀點一致，本文呈獻(xiàn)的數(shù)據(jù)說明細(xì)胞-細(xì)胞接觸和N-鈣黏著蛋白在驅(qū)動纖維變性的細(xì)胞 反應(yīng)中的重要作用。另外，N-鈣黏著蛋白在IPF患者肺活組織檢查樣品中、IPF石棉臨床前 模型和來自IPF患者的肺成纖維細(xì)胞中上調(diào)。
[0150] IPF形成和進(jìn)展的最新提出的方面是EMT從受損上皮供應(yīng)額外的肌成纖維細(xì)胞源 (Selman等人，2006 ;Selman等人，2008)。充分分化的上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)變成為間充質(zhì)細(xì)胞。 鈣黏著蛋白從E-鈣黏著蛋白轉(zhuǎn)換成N-鈣黏著蛋白為正在發(fā)生的EMT的細(xì)胞提供遷移潛能 并可能調(diào)節(jié)進(jìn)一步FMT、增殖和存活率。我們已經(jīng)展示N-鈣黏著蛋白抑制阻止II肺泡型 上皮細(xì)胞系中的EMT。因此，在體內(nèi)抑制N-鈣黏著蛋白活性可能阻止或減少EMT，并且限制 IPF肺中肌成纖維細(xì)胞積累的來源之一。
[0151] 肌成纖維細(xì)胞代表全部纖維化疾病的核心。在本研究中，我們顯示與正常成纖維 細(xì)胞相反，N-鈣黏著蛋白由肌成纖維細(xì)胞優(yōu)勢表達(dá)。這個觀察結(jié)果與關(guān)于成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 物中連接形成的先前報道一致（Hinz等人，2004)。另外，我們?yōu)镹-鈣黏著蛋白在肌成纖維 細(xì)胞中的功能提供證據(jù)。類似于正在發(fā)生EMT的上皮細(xì)胞，正在發(fā)生FMT的成纖維細(xì)胞從 頭表達(dá)N-鈣黏著蛋白，并且這為它們提供促遷移、促增殖和促存活表型。這在本研究中得 到證實，因為干擾N-鈣黏著蛋白功能導(dǎo)致遷移、增殖和存活的下調(diào)。肌成纖維細(xì)胞的形成 本身取決于N-鈣黏著蛋白信號傳導(dǎo)，因為N-鈣黏著蛋白的激活誘導(dǎo)SMA表達(dá)和N-鈣黏著 蛋白的敲減抑制FMT。重要地，在我們的研究中通過使用功能阻斷性抗體干擾N-鈣黏著蛋 白功能導(dǎo)致TGFi3誘導(dǎo)的FMT下調(diào)。這個觀察結(jié)果表明，用于抑制N-鈣黏著蛋白的阻斷性 抗體方案可能證明IPF療法有治療效果。
[0152] N-鈣黏著蛋白還調(diào)節(jié)由活化的肌成纖維細(xì)胞所致的異常膠原蛋白分泌（IPF病變 的關(guān)鍵特征）?？傊?，N-鈣黏著蛋白參與促成IPF的許多肌成纖維細(xì)胞功能以及通過FMT 和EMT形成肌成纖維細(xì)胞（Nieman等人，1999)。因此，阻斷N-|丐黏著蛋白功能的藥物可能 抑制受細(xì)胞-細(xì)胞連接形成驅(qū)動的成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞的促纖維變性的功能并導(dǎo)致 延緩或停滯疾病進(jìn)展（Hinz，2004)。N-鈣黏著蛋白還與促存活信號傳導(dǎo)途徑偶聯(lián)并且N-鈣 黏著蛋白阻斷可以導(dǎo)致纖維變性的損傷清除和肺纖維化逆轉(zhuǎn)。
[0153] N-鈣黏著蛋白已經(jīng)是其中它促進(jìn)血管生成和腫瘤細(xì)胞遷移、增殖和存活的多種腫 瘤學(xué)適應(yīng)癥的藥物革巴（Augustine等人，2008 ;Mariotti等人，2007)。環(huán)狀肽N-|丐黏著蛋白 拮抗劑，Exherin或ADH-1，已經(jīng)臨床測試并且目前在癌癥中正處于II期試驗，并且一項最 近研究建議N-鈣黏著蛋白抗體用于診斷、評價和治療N-鈣黏著蛋白相關(guān)的癌癥并且描述 了這類抗體在治療前列腺癌臨床前模型中的用途（Tanaka等人，2010)。這些數(shù)據(jù)顯示用抗 體或低分子量分子干擾N-鈣黏著蛋白功能是一種有效治療方案。有趣地，已經(jīng)顯示N-鈣 黏著蛋白拮抗劑ADH-1，在不影響周圍組織中正常血流量的情況下通過破壞惡性黑色素瘤 周圍的新血管系統(tǒng)影響腫瘤血流量。在更穩(wěn)定VE-鈣黏著蛋白介導(dǎo)的連接接任之前，這些 血管的完整性由N-鈣黏著蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞連接維持。在IPF中，纖維變性的病灶周圍的 區(qū)域以與腫瘤微環(huán)境中那些畸形血管相似的畸形血管高度血管化，并且因此誘人的是猜測 N-鈣黏著蛋白阻斷可能影響IPF肺的這些區(qū)域以及致密填充的纖維變性的病灶。
[0154] 總之，我們已經(jīng)探究N-鈣黏著蛋白在疾病相關(guān)性成纖維細(xì)胞或來自正常人和IPF 患者的組織中的表達(dá)和功能作用。我們發(fā)現(xiàn)N-鈣黏著蛋白在纖維變性的區(qū)域內(nèi)和負(fù)責(zé)IPF 表型的主要細(xì)胞類型-肌成纖維細(xì)胞中上調(diào)。N-鈣黏著蛋白功能損失導(dǎo)致抑制了與這種 纖維變性的表型相關(guān)的全部過程-FMT、增殖、膠原蛋白分泌、遷移和EMT。因此，我們得出 結(jié)論，在IPF患者中抑制N-鈣黏著蛋白很可能提供治療益處。
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【權(quán)利要求】
1. 一種抑制或中和N-鈣黏著蛋白活性的N-鈣黏著蛋白拮抗劑，用于治療或預(yù)防纖維 化。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的N-鈣黏著蛋白拮抗劑，其中拮抗劑是抗N-鈣黏著蛋白抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的N-鈣黏著蛋白抗體，其中纖維化是特發(fā)性肺纖維化。
4. 抑制或中和N-鈣黏著蛋白活性的N-鈣黏著蛋白拮抗劑在制備用于治療或預(yù)防纖維 化的藥物中的用途。
5. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中拮抗劑是抗N-鈣黏著蛋白抗體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中纖維化是特發(fā)性肺纖維化。
7. -種治療或預(yù)防纖維化的方法，包括向有需求的受試者施用抑制或中和N-鈣黏著 蛋白活性的N-鈣黏著蛋白拮抗劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中拮抗劑是抗N-鈣黏著蛋白抗體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中纖維化是特發(fā)性肺纖維化
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項所述的抗體、用途或方法，其中抗體用可藥用載體配 制。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項所述的抗體、用途或方法，其中將抗體與吡非尼酮或 干擾素依次或同時共施用。
【文檔編號】A61P19/04GK104203280SQ201380016888
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月27日
【發(fā)明者】I·魯梅諾娃康斯坦丁諾娃, A·C·皮爾斯 申請人:諾華股份有限公司