含有西洛他唑及銀杏葉提取物作為有效成分的聽覺障礙預(yù)防或治療用藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及含有西洛他唑及銀杏葉提取物作為有效成分的用于預(yù)防或治療聽覺障礙的藥物組合物，所述藥物組合物抑制由于活性氧(ROS)生成引起的聽覺細胞的凋亡，從而能夠有效預(yù)防或治療噪聲性聽覺障礙或耳毒性聽覺障礙。
【專利說明】含有西洛他唑及銀杏葉提取物作為有效成分的聽覺障礙預(yù) 防或治療用藥物組合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及含有西洛他唑及銀杏葉提取物作為有效成分的用于預(yù)防或治療聽覺 障礙的藥物組合物。

【背景技術(shù)】
[0002]聽覺障礙是由于多種原因引起的聽覺上的異常，是指聽力下降或喪失的狀態(tài)，耳 朵由外耳（耳廓至鼓膜）、中耳（鼓膜至耳蝸入口）及內(nèi)耳（耳蝸內(nèi)部）組成，其中只要有 一處發(fā)生問題就會導(dǎo)致聽覺障礙。聽覺障礙分為外耳和中耳的損傷引起的聽覺障礙（傳導(dǎo) 性聽覺障礙）及內(nèi)耳和聽覺神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的聽覺神經(jīng)障礙（感覺神經(jīng)性聽覺障礙），外 耳及中耳損傷引起的聽覺障礙只要治療上述損傷就可以使聽覺障礙恢復(fù)，但是內(nèi)耳和聽覺 神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的聽覺障礙即使治療了上述損傷時也多數(shù)情況下無法恢復(fù)，因此給患者 帶來很大的不便。
[0003]所述內(nèi)耳及神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的聽覺障礙可分為老年性聽覺障礙、小兒聽覺障 礙、梅尼埃病、突發(fā)性聽覺障礙、噪聲性聽覺障礙、耳毒性聽覺障礙等，其中噪音引起的噪聲 性聽覺障礙及藥物引起的耳毒性聽覺障礙最為普遍。
[0004]噪聲性聽覺障礙（noise-induced hearing loss ;acoustic trauma)在聽力損 失和耳蝸病變的形態(tài)發(fā)面與耳毒性聽覺障礙非常相似。噪聲性聽覺障礙是因為暴露于強 噪音，聽覺細胞受到氧化應(yīng)激，結(jié)果生成活性氧（Mh壽包紐S巹(reactive oxygen species，ROS)，所生成的ROS誘導(dǎo)細胞的凋亡（apopt〇si s)而發(fā)生。暴露于強噪音后，細胞 損傷程度由細胞的抗氧化狀態(tài)而決定，可以通過增進抗氧化狀態(tài)并使之維持，從而減少損 傷的程度。但是，事實上到目目U為止還沒有開發(fā)出能夠預(yù)防或治療噪聲性聽覺障礙的藥物。 [000 5]耳毒性（ototoxicity)聽覺障礙是由于使用耳毒性藥物而發(fā)生的副作用，已知氨 基糖苷（aminoglycoside)抗生素及一些抗癌劑等誘發(fā)耳毒性。
[0006]熱基糖音類抗生素有鏈霉素（streptomycin)、卡那霉素 （kanamy cin)、慶大霉 素（gentamicin)、新霉素（neomycin)、阿米卡星（ami kac in)、妥布霉素（tobramycin)、 奈替米星（netilmicin)、地貝卡星（dibekacin)、紫蘇霉素（sisomycin)、利波多麥星 (Iivodomycin)等。氨基糖苷抗生素主要用于與普通抗生素不太反應(yīng)的革蘭氏陰性菌感染、 結(jié)核、深部感染等。氨基糖苷抗生素在長期給藥或部分情況下短期給藥時顯示耳毒性副作 用。氨基糖苷抗生素通過結(jié)合于細菌 3OS核糖體亞單位而抑制蛋白合成，從而顯示出抗菌 作用，這種氨>基糖苷抗生素持續(xù)暴露在耳蝸細胞（cochlear cell)時，科爾蒂（corti)器官 的外毛細胞（outer hair cell)和感覺毛細胞（sensory hair cell)會凋亡。凋亡機制已 知為氨基糖苷抗生素和Ca2+復(fù)合體形成的活性氧而引起。
[0007]此外，誘發(fā)耳毒性的抗癌劑可以例舉順鉑（Cisplatin)和卡鈾（C arboplatin)。 [0008]順鉑（順一二胺二氯鉑（II )，CDDP)是用于治療包括乳癌、膀胱癌、胃癌、宮頸癌、 頭頸部癌等多種腫瘤的抗腫瘤藥物。
[0009]順鉑是含有鉑的重金屬化合物，以鉑原子為中心以順勢（Cis)形式結(jié)合有2個氯 原子和2個氨分子，與DNA鏈上的2個相鄰鳥嘌呤結(jié)合，形成鏈內(nèi)交聯(lián)，從而抑制DNA合 成。即，已知為順銷附著在存在于癌細胞的核內(nèi)的DNA雙重螺旋結(jié)構(gòu)，阻礙 DNA的復(fù)制，由 此抑制癌細胞生長及增殖，從而顯示出抗癌效果。但是順鉬由于耳毒性（Qtotoxicity)聽 覺障礙等嚴重副作用而在臨床上的使用受到限制。實際上已知，使用順拍治療頭頸部癌的 多數(shù)患者經(jīng)受耳毒性聽覺障礙。這種耳毒性在初期顯現(xiàn)為高頻聽力損失，但是漸進地不僅 引起全頻聽力損失，還誘發(fā)平衡異常等前庭功能降低。順鉬顯示耳毒性聽覺障礙的機制已 知為活性氧（ROS)的增加和由此導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化及 DNA的損傷等。目前為了預(yù)防耳毒性 聽覺障礙，正在研究硫代硫酸鈉等巰基類藥物；N-乙酰半胱氨酸、D-及L-蛋氨酸、氟桂嗪 (flunar izin)等鈣通道阻斷劑；半胱天冬酶（caspase)抑制劑等，但實情是還沒有實用化 的藥物。因此需要能夠預(yù)防耳毒性藥物引起的副作用耳毒性聽覺障礙的有效的方法及藥 物。
[0010]如上所述，噪聲性聽覺障礙及耳毒性聽覺障礙被認為是由于噪音及耳毒性藥物生 成ROS誘發(fā)細胞凋亡而發(fā)生。因此能夠有效抑制活性氧生成的物質(zhì)可以成為顯示出耳毒性 的預(yù)防或治療效果的候選物質(zhì)。
[0011] 此外，西洛他唑（cilostazol)是強力的選擇性磷酸二酯酶in型（PDE III)抑制 劑，表不為6-[4-(1-環(huán)己基-IH-四唑-5-基）丁氧基]-3,4-二氫-2-(lH)-喹啉。西洛 他唑可以用作血小板凝集抑制劑及血管擴張劑，主要用于治療末梢動脈疾病及間歇性跛行 患者。
[0012] 此外，銀杏葉提取物（Ginkgo biloba Extract，GbE)是由24%的類黃酮和6%的 萜類構(gòu)成，已知對支氣管哮喘和支氣管炎、末梢血液障礙及腦功能不全等有效。
[0013]目前已經(jīng)公知包含上述兩種物質(zhì)的復(fù)合制劑的抗血栓用途（參照韓國專利第 10-0963268及韓國專利公開第10_2〇1〇-0040281號），所述復(fù)合制劑作為抗凝劑、抗血小板 劑及血栓溶解劑而在市售。
[0014] 本發(fā)明發(fā)明人對含有西洛他唑和銀杏葉提取物的復(fù)合制劑進行研究的過程中，確 認了所述制劑能夠有效預(yù)防或治療聽覺障礙，由此完成了本發(fā)明。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 發(fā)明概述
[0016] 從而，本發(fā)明的目的在于提供能夠預(yù)防或治療聽覺障礙的藥物組合物。
[0017] 本發(fā)明的另一目的在于，提供能夠預(yù)防或治療聽覺障礙的藥物制劑。
[0018]本發(fā)明的又一目的在于，提供耳毒性聽覺障礙改善的含有氨基糖苷抗生素的抗生 組合物。
[0019] 本發(fā)明的再一目的在于，提供耳毒性聽覺障礙改善的含有耳毒性抗癌劑的抗癌用 組合物。
[0020] 根據(jù)上述目的，本發(fā)明提供含有西洛他唑和銀杏葉提取物作為有效成分的用于預(yù) 防或治療聽覺障礙的藥物組合物。
[0021] 根據(jù)上述另一目的，本發(fā)明提供含有西洛他唑和銀杏葉提取物作為有效成分的用 于預(yù)防或治療聽覺障礙的藥物制劑。
[0022]根據(jù)上述又一目的，本發(fā)明提供含有西洛他唑和銀杏葉提取物及氨基糖苷抗生素 作為有效成分的耳毒性聽覺障礙改善的抗生組合物。
[0023]根據(jù)上述再一目的，本發(fā)明提供含有西洛他唑和銀杏葉提取物及耳毒性抗癌劑作 為有效成分的耳毒性聽覺障礙改善的抗癌用組合物。
[0024]含有西洛他唑及銀杏葉提取物作為有效成分的本發(fā)明的藥物組合物能夠抑制活 性氧（ROS)的生成引起的聽覺細胞的凋亡，從而能夠治療噪聲性聽覺障礙或耳毒性聽覺障 礙。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]本發(fā)明的上述及其他目的和特征，通過隨附的附圖及對本發(fā)明的說明將更加明 確：
[0026]圖1是向大鼠單獨施用順鉬，或組合雷那新（renexin)、銀杏葉提取物或西洛他唑 施用后，在16KHz(上部圖表）和32KHz(下部圖表）測定的聽力閾值（hearing threshold) 的結(jié)果的圖表。各個圖中，Pre是表示施用藥物之前，P-5表示開始施用順鉑5天之后， a至 e表示實施例<1-2>的第一組至第五組。
[0027]圖2是向大鼠單獨施用順鉑，或組合雷那新、銀杏葉提取物或西洛他唑施用后，通 過懸尾試驗測定頭部旋轉(zhuǎn)次數(shù)的結(jié)果的圖表。圖2中Pre、P-5、a至e分別與圖1中說明的 相同。
[0028]圖3是向大鼠單獨施用順鉑，或組合雷那新、銀杏葉提取物或西洛他唑施用后，通 過游泳試驗測定的游泳時間（秒）的圖表。圖3中Pre、P-5、a至e分別與圖1中說明的相 同。
[0029]圖4是向大鼠單獨施用順鉑，或組合雷那新、銀杏葉提取物或西洛他唑施用后，用 掃描電子顯微鏡（SEM)對柯蒂氏器官的中部（m iddle turn，上部圖）和底部（basal turn， 下部圖）進行拍攝的截面圖。圖4中a至e分別與圖1中說明的相同。
[0030]圖5是向大鼠單獨施用順鉑，或組合雷那新、銀杏葉提取物或西洛他唑施用后，測 定柯蒂氏器官的中部（middle turn，上部圖）和底部（basal turn，下部圖）的外毛細胞 (outer hair cell, 0HC)的數(shù)量的結(jié)果的圖表。圖5中a至e分別與圖1中說明的相同。 [0031]圖6是向大鼠單獨施用順鈾，或組合雷那新、銀杏葉提取物或西洛他唑施用后，用 掃描電子顯微鏡（SEM)對球囊（saccule,上部圖）和小囊（utricle，下部圖）進行拍攝的 截面圖。圖6中3至6分別與圖1中說明的相同。
[0032]圖7是向大鼠單獨施用順鉑，或組合雷那新、銀杏葉提取物或西洛他唑施用后，測 定球囊和小囊的毛細胞（hair cell, HC)的數(shù)量的結(jié)果的圖表。上部圖是球囊的毛細胞數(shù) 量，下部圖是小囊的毛細胞數(shù)量。圖7中a至e分別與圖1中說明的相同。
[0033]圖8是向聽覺細胞系HEI-OCl處理20 ii M的順鉑后，通過MTS分析法測定細胞存 活率（％)的圖表。
[0034]圖9是表示向HEI-OCl細胞處理不同濃度的雷那新（a:3. 5、b:7.0、c: 14. 1、 d:28_ l、e:56. 3、f: 122. 5、g:225_ 0、h:450_ 0 及 i:900_ Ou g/ml)后，通過 MTS 分析法測定的 吸光度的圖表。
[0035] 圖10是表示處理不同濃度的雷那新（a:3. 5、b:7. 0、c: 14. 1、d:28. 1、e:56. 3、 f: 122_ 5、g:225. 0、h:450. O 及 i :900. O u g/ml)和 20 u M 的順鈾后，通過 MTS 分析法測定的 吸光度的圖表。
[0036]圖11表示向JEI-OCl細胞處理雷那新、CDDP和雷那新+CDDP后，用膜聯(lián)蛋白 V-FITC/碘化丙陡（PI)染色，并用流式細胞分析儀（fl〇w Cyt〇meter)分析的結(jié)果。圖Ii 的上部圖表示流式細胞分析結(jié)果，下部圖表示細胞凋亡率（％ )。
[0037]圖12是向HEI-OCl細胞處理雷那新、CDDP和雷那新+CDDP后，利用免疫印跡試驗 測定細胞內(nèi)信號傳遞蛋白聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP)、BCL-XL、BAX、細胞色素C、剪 切的半胱天冬酶3 (cleaved caspaSe3)、ERK及JNK的表達量的結(jié)果。上部圖表表示各信^ 傳遞蛋白的表達量，下部圖是免疫印跡試驗的照片。
[0038] 圖13是向HEI-OCl細胞處理CDDP和雷那新+CDDP后，利用熒光顯微鏡觀察活性 氧（ROS)的照片。
[0039] 發(fā)明詳述
[0040]本發(fā)明提供含有西洛他唑及銀杏葉提取物作為有效成分的用于預(yù)防或治療聽覺 障礙的藥物組合物。
[0041]本發(fā)明的藥物組合物中使用的西洛他唑是具有6-[4-(1_環(huán)己基-IH-四 唑_5_基）丁氧基]_3, 4-二氫_2_ (IH)-喹啉的化合物名稱的物質(zhì)，可以使用現(xiàn)在市售的 藥物。此外，本發(fā)明中使用的銀杏葉提取物是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的工序提取的，可以 通過使用水和低級醇或低級酮的混合溶劑的傳統(tǒng)溶劑提取法、先用堿性水溶液提取后再用 低級醇和低級乙酸酯或低級酮的混合溶劑提取的方法，或超臨界提取等已知的任何方法提 取也無妨，這樣提取的銀杏葉提取物優(yōu)選含有主成分黃酮苷為15重量％以上的，尤其是優(yōu) 選含有黃酮苷及萜內(nèi)酯的。
[0042] 在一具體例中，本發(fā)明的藥物組合物可以以1:0. 1-1:4. 8的重量比包含西洛他唑 及銀杏葉提取物。優(yōu)選具體例中，本發(fā)明的藥物組合物可以以1:0.8的重量比包含西洛他 唑及銀杏葉提取物
[0043]本發(fā)明的藥物組合物的特征為預(yù)防或治療聽覺障礙。在一實施例中，本發(fā)明的藥 物組合物能夠預(yù)防或治療噪音引起的聽覺障礙（稱為噪聲性聽覺障礙）。在另一實施例中， 本發(fā)明的藥物組合物能夠預(yù)防或治療施用耳毒性藥物引起的聽覺障礙（稱為耳毒性聽覺 障礙）。
[0044]所述耳毒性藥物包括氨基糖苷抗生素及抗癌劑，優(yōu)選地，可以選自鏈霉素、卡那 霉素、慶大霉素、新霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、地貝卡星、紫蘇霉素、利波多麥星 (Iivodomycin)及順怕和卡鉑中的任意一種以上。
[0045]本發(fā)明實施例中公開了本發(fā)明藥物組合物對代表性耳毒性藥物順怕引起的耳毒 性聽覺障礙的效果。但是，上述的藥物通過與順鉑類似的機制，即生成活性氧誘導(dǎo)細胞凋亡 從而引起耳毒性聽覺障礙，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員可以知道本發(fā)明的藥物組合物對除了順鈾 之外的耳毒性藥物引起的耳毒性聽覺障礙會顯示同樣的效果。此外，噪聲性聽覺障礙也具 有與耳毒性聽覺障礙相同的機制，因此可以知道本發(fā)明的藥物組合物對噪聲性聽覺障礙也 具有同樣的效果。
[0046] 具體而言，以大鼠作為實驗對象的體內(nèi)（in vivo)研究中，施用順鉬時會發(fā)生聽力 功能及前庭功能降低的耳毒性副作用。但是，施用本發(fā)明的藥物組合物時，聽力功能及前庭 功能降低幅度顯著減少。此外，從形態(tài)學(xué)分析結(jié)果可以知道，與使用順鉑時毛細胞損傷且其 數(shù)量減少的情況相比，施用本發(fā)明的藥物組合物時，能夠阻止毛細胞損傷及其數(shù)量的減少 (參照實施例1及2)。
[0047] 尤其，本發(fā)明的藥物組合物在預(yù)防或治療耳毒性聽覺障礙方面，相比單獨使用西 洛他唑及銀杏葉提取物具有更顯著的上升效果。
[0048] 本發(fā)明的藥物組合物可以劑型化為適合于經(jīng)腸給藥，即口服給藥的藥物制劑。所 述制劑可以是片劑、泡騰片劑、顆粒劑或膠囊劑的形態(tài)。所述藥物制劑優(yōu)選為單位給藥劑 型，此時各給藥劑型含有規(guī)定量的西洛他唑和銀杏葉提取物，此外可以根據(jù)通常的藥劑學(xué) 方法選擇與適當(dāng)?shù)南♂寗?、載體或其他賦形劑一起混合而劑型化。例如，片劑除了活性填充 劑之外，還可以含有通常的顆?；瘎?、稀釋劑、結(jié)合劑、崩解劑、潤滑劑、穩(wěn)定化劑、著色劑、 遮光劑、甜味劑及調(diào)味劑。此外，如果藥物之間的相互作用而使得穩(wěn)定性變差時,可以使用 制備分層片劑等其它的制劑化工藝。
[0049] 本發(fā)明的藥物制劑以單位制劑為準，可以含有50-100mg的西洛他唑以及40_80mg 的銀杏葉提取物，優(yōu)選含有IOOmg的西洛他唑和80mg的銀杏葉提取物。根據(jù)本發(fā)明的藥物 制劑1日給藥量可以根據(jù)給藥方法或治療條件而有所不同，但是經(jīng)口給藥時優(yōu)選為每日給 藥2-4次。
[0050] 此外，本發(fā)明提供含有西洛他唑、銀杏葉提取物及氨基糖苷抗生素作為有效成分 的耳毒性聽覺障礙改善的抗生組合物。
[0051] 此外，本發(fā)明提供含有西洛他唑、銀杏葉提取物及耳毒性抗癌劑作為有效成分的 耳毒性聽覺障礙改善的抗癌用組合物。
[0052] 所述各組合物中的氨基糖苷抗生素及耳毒性抗癌劑的具體實例如前所述。
[0053] 所述本發(fā)明的各組合物在包含氨基糖苷抗生素及耳毒性抗癌劑的基礎(chǔ)上，進一步 含有西洛他唑和銀杏葉提取物，因此能夠減少所述抗生素或抗癌劑引起的耳毒性副作用即 聽覺障礙。所述進一步添加的西洛他唑和銀杏葉提取物的復(fù)合物以順鈾的重量為基準，優(yōu) 選使用5-20倍的含量，但不特別地限定于此。

【具體實施方式】
[0054] 以下通過實施例更詳細地說明本發(fā)明，但這些實施例僅用于例示本發(fā)明，本發(fā)明 的范圍并不由這些實施例限定。
[0055] 實施例1 :根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合制劑對聽力功能及前庭功能的效果分析
[0056] 〈1_1>復(fù)合制劑的制備
[0057] 將西洛他唑（CS，SK化學(xué)）及銀杏葉提取物（GbE，SK化學(xué)）以5:4的重量比混合 后，溶解于〇? 5% (w/v)羧甲基纖維素鈉（CMCNa，西格瑪公司）水溶液中，以18mg/mL的濃 度制得復(fù)合制劑（以下稱為雷那新（renexin))。
[0058] <1-2>試料的施用
[0059] 將 8-10 周齡的 SD(Sprague-Dawley)大鼠（200-250g)52 只，分為以下 6 組，并按 照下述施用各藥物。
[0060] _第一組：正常對照組（n = 3);
[0061] _第二組：順怕（CDDP)單獨給藥組（n = 13);
[0062]-第三組：雷那新+CDDP給藥組（n = 12);
[0063] _第四組：銀杏葉提取物+CDDP給藥組（n = 12);和
[0064]-第五組：西洛他唑+CDDP給藥組（n = 12)。
[0065]順鉑（西格瑪公司）用生理鹽水溶解為〇? 15mg/mL的濃度，以16mg/kg/天的用 量從0-3日每天通過腹腔注射給藥；雷那新作為預(yù)處理（pre-treatment)在順鈾給藥7天 前（-7天）開始，作為后處理（p ost-treatment)在順鉑給藥開始后的第5天為止，每天以 180mg/kg/天的用量經(jīng)口給藥；西洛他唑和銀杏葉提取物分別以i〇〇 mg/kg/天和8〇mg/kg/ 天的用量與雷那新相同的時間期間每日經(jīng)口給藥。
[0066] 〈1_3>聽力功能評價：聽腦干反應(yīng)試驗
[0067] 以實施例<1_2>的大鼠作為對象，利用Biosig32系統(tǒng)（Tucker-Da vis技術(shù)，蓋 恩斯維爾（Gainesville)，F(xiàn)L，美國）進行了聽腦干反應(yīng)（auditory brainstem response ； ABR)試驗，從而評價了聽力功能。ABR試驗在施用藥物之前（Pre)和施用順鉑開始5天 (P-5)后進行了測定。
[0068] 在ABR試驗之前，實施例<1-2>的大鼠至少在飼養(yǎng)室適應(yīng)3天。試驗前一天，麻醉 大鼠并在耳內(nèi)設(shè)置耳麥，用耳鏡（otoscope)檢查鼓膜的外觀是否正常。試驗當(dāng)日，將大鼠 放入防音箱內(nèi)，在皮下內(nèi)利用經(jīng)皮滅菌電極針記錄ABR。將活性電極位于頭頂點（vertex)， 標準電極位于相同側(cè)的乳突（mastoid process)，然后接地電極位于相反側(cè)的乳突。向大 鼠腹腔內(nèi)注射含有唑拉西泮（zolazepam;Zoletil50,維克（Virbac),法國）50mg/kg和隆 朋（Rompun) 5mg/kg的溶液麻醉大鼠。然后，通過位于耳道（ear canal)內(nèi)的耳麥，以5dB S PL為階段從75開始到IOdB提供16KHz和32KHz的猝發(fā)音（tone burst)。1024次的刺激 (swe印）中所得到的反應(yīng)結(jié)果進行平均，將出現(xiàn)wave V的波形的最小猝發(fā)音大?。╠B)作為 聽力閾值。
[0069] 將在16KHz和32KHZ的聽力閾值測定結(jié)果分別在圖1的上部和下部圖表中示出。 各圖中Pre表不施用藥物之前，P-5表不開始施用順鈾5天后，a至e表示實施例<1-2>的 第一組至第五組。如圖1所示，可以確認在16KHz和32KHz,⑶DP單獨給藥組（b)的情況相 比正常對照組（a)聽力閾值均顯著升高（P二〇? 〇〇〇)，CDDP的施用時由于耳毒性而引起聽 力功能損傷。但是renexin+CDDP給藥組（c)的情況相比CDDP單獨給藥組（b)聽力閾值顯 著降低。尤其是，雷那新+CDDP給藥組（c)的情況相比銀杏葉提取物+CDDP給藥組（d)及 西洛他唑+⑶DP給藥組（e)聽力閾值低，顯示為聽力功能改善。
[0070] 上述結(jié)果表示雷那新能夠預(yù)防或治療⑶DP施用引起的聽力損失，且雷那新相比 單獨施用銀杏葉提取物及西洛他唑時，具有活性成分的混合引起的協(xié)同效果。
[0071] 〈卜4>前庭功能評價：懸尾試驗
[0072] 以實驗例〈1-2>的大鼠為對象通過懸尾試驗（tail hanging test)評價前庭功 能。前庭功能評價在施用藥物之前和開始施用順怕5天之后進行測定。懸尾試驗通過將各 組的大鼠尾部提起懸掛在30cm的高度后，用攝像機進行記錄，計數(shù)每10秒鐘的頭部旋轉(zhuǎn)的 次數(shù)，從而完成。
[0073] 試驗結(jié)果在圖2中示出。如圖2所示，⑶DP-單獨給藥組（b)的情況下頭部旋轉(zhuǎn) 次數(shù)為21. 8±9次，相比正常對照組（a)顯著增加（P = 〇. 〇〇〇);相反，雷那新+CDDP給藥 組（c)的情況下為S. 3±5. 3次,相比CDDP-單獨給藥組（b)頭部旋轉(zhuǎn)次數(shù)顯著減少（P = 0. 002)。尤其是，雷那新+CDDP給藥組（C)頭部旋轉(zhuǎn)次數(shù)相比銀杏葉提取物+CDDP給藥組 (d)和西洛他唑+CDDP給藥組（e)減少更多。
[0074] 上述結(jié)果表示施用雷那新能夠預(yù)防或治療順鉬引起的前庭功能的損傷，且雷那新 相比單獨施用銀杏葉提取物和西洛他唑的情況，具有活性成分的混合引起的協(xié)同效果。
[0075] <1-5>前庭功能的評價：游泳試驗
[0076] 以實驗例<1_2>的大鼠為對象通過游泳試驗評價前庭功能。前庭功能評價在施用 藥物之前和開始施用順鉑5天之后進行測定。
[0077] 具體地，在不銹鋼水槽（長28cm，寬45cm，深25cm)中以19cm的深度添加與體溫 相似溫度的水。將大鼠的尾部提起，從20cm的高度將其丟入水槽中間。由單獨的觀察者來 記錄大鼠接觸水的時刻開始逃出到平臺上的時刻的時間。
[0078] 實驗結(jié)果示出圖3中。如圖3所示，CDDP-單獨給藥組（b)的情況下平均游泳時 間為29.6±17.4秒，相比正常對照組（ a)顯著增加（P = 〇. 006);相反，雷那新+CDDP給藥 組（c)的情況下為14.9±5.7秒，相比⑶DP-單獨給藥組（b)平均游泳時間顯著減少（P = 0? 048)。尤其是，雷那新+CDDP給藥組（c)平均游泳時間相比銀杏葉提取物+CDDP給藥組 (d)和西洛他唑+CDDP給藥組（e)減少更多。
[0079] 上述結(jié)果表示施用雷那新能夠預(yù)防或治療順鉬引起的前庭功能的損傷，且雷那新 相比單獨施用銀杏葉提取物和西洛他唑的情況，具有活性成分的混合引起的協(xié)同效果。
[0080] 實施例2 :根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合制劑施用的聽覺及前庭毛細胞的形態(tài)評價
[0081] 〈2-1>中部及底部的形態(tài)評價
[0082] 將實施例<1-2>各組的大鼠進行麻醉后，摘取了顳骨（temporal bone)。在解剖顯 微鏡下，在耳蝸:（巧卒.1的圓窗（round window)和卵圓窗（oval window)上鉆孔，用巴斯 德吸管在外淋巴隙（perilymphatic space)灌流4%的戊二醛（EMgrade，產(chǎn)地，Inc. CA，美 國），然后將各試料在4%戊二醛溶液中固定24小時。耳蝸表面及外淋巴隙用磷酸緩沖液 (PBS)洗滌3次后，灌流1%的四氧化鋨（〇 smium tetroxide)，在組織旋轉(zhuǎn)器上放置15分 鐘。然后，用PBS洗滌試料3次，在解剖顯微鏡下去除耳蝸的骨囊（bony capsule)，切開側(cè) 壁（lateral wall)將科爾蒂器官露出。通過卵圓窗將球囊（saccule)完全打開直至銀色耳 石（otolith)露出，將耳石從囊斑（saccule mac ula)上去除。上述過程中小囊（utricle) 的毛細胞露出。將摘取的組織使用5〇%、70%、 9〇%、95%和1〇〇%丙酮逐漸增加濃度進行 脫水。脫水的試料暴露于六甲基二娃氣焼（hexamethyIdisiIazane)中，進行空氣干燥后， 放置在l 3mm的涂覆鉑的短柱（stub)上，用JSM-5410LV掃描電子顯微鏡（SEM)(日本電子 光學(xué)實驗室，東京，日本）觀察，用寶麗來551andfilm進行照相。
[0083]拍攝的照片示于圖4。圖4的上部照片為提供16KHZ猝發(fā)音時中部（middle turn) 的截面圖，下部照片為提供32KHz的猝發(fā)音時底部（basal turn)的截面圖，a至e表示實 施例<1-2>的第一組至第五組。
[0084] 從上述中部截面圖及底部截面圖中可以確認，CDDP單獨給藥組（b)的外毛細胞不 均勻，其數(shù)量顯著減少；相反雷那新+CDDP給藥組（c)的外毛細胞均勻,其數(shù)量顯著增加。 [0085] 〈2-2>外毛細胞數(shù)量的測定
[0086]為了觀察根據(jù)使用本發(fā)明的復(fù)合制劑的毛細胞分布及數(shù)量變化，參照文獻 (Viberg and Canlon，Hear Res_，I97 (I-2) : 1-10, 2〇〇4)測定實施例 <2-1> 的中部及底部 的外毛細胞（outer hair cell，OHC)的數(shù)量。
[0087]測定結(jié)果示于圖5。如圖5所示，CDDP單獨給藥組（b)的外毛細胞數(shù)量相比正常 對照組（a)顯著減少，聽力功能受損；但是雷那新+CDDP給藥組（c)相比CDDP單獨給藥組， 外毛細胞的數(shù)量顯著增加。尤其是，雷那新+CDDP給藥組（c)的外毛細胞數(shù)量相比銀杏葉 提取物+CDDP給藥組（d)和西洛他唑+CDDP給藥組（e)顯著增加。
[0088] <2-3>球囊及小囊的形態(tài)評價
[0089]從前庭細胞得到球囊和小囊，與實施例<2-1>相同地使用掃描電子顯微鏡（SEM) 觀察。
[0090] 掃描電子顯微鏡照片不于圖6。如圖6所示，可以確認CDDP單獨給藥組（b)的球 囊及小囊的毛細胞均不均勻，數(shù)量顯著減少，相反雷那新+CDDP給藥組（c)的情況時毛細胞 均勻，數(shù)量增加。尤其是，雷那新+⑶DP給藥組（c)的情況相比銀杏葉提取物+CDDP給藥組 (d)及西洛他唑+CDDP給藥組（e)，毛細胞的均勻性及數(shù)量顯著良好。
[0091] <2-4>毛細胞的數(shù)量測定
[0092]為了確認根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合制劑施用的毛細胞的分布及數(shù)量變化，參照文獻 (Viberg and Canlon，Hear Res.，197 (1-2) : 1-10,2〇〇4)測定實施例 <2-3> 得到的球囊及 小囊的毛細胞（HC)數(shù)量。
[0093]測定結(jié)果示于圖7。如圖7所示，CDDP單獨給藥組（b)的情況相比正常對照組（a) 毛細胞的數(shù)量顯著減少（P = 0. 000)，但是雷那新+CDDP給藥組（c)的情況相比CDDP單獨 給藥組（b)，毛細胞的數(shù)量顯著增加（P = 〇.〇〇2)。尤其是，雷那新+CDDP給藥組（c)相比 銀杏葉提取物+CDDP給藥組（d)和西洛他唑+CDDP給藥組（ e)，毛細胞的數(shù)量增加。
[0094] 實施例3 :對CDDP-誘導(dǎo)細胞毒性的本發(fā)明復(fù)合制劑的體外效果分析
[0095] 〈3-DCDDP-誘導(dǎo)細胞毒性的確認
[0096]為了確認〇〇〇?-誘導(dǎo)細胞毒性，聽覺細胞系（冊1-〇(：101'(：(：，美國）在33。(：、1〇% C02條件的培養(yǎng)器中，用添加了 1〇% FBS的達爾伯克必需基本培養(yǎng)基（DMEM，Dulbecco' s minimum essential me dium)中進行培養(yǎng)。所培養(yǎng)的細胞以3000細胞/孔的濃度分株于 96孔板中，然后添加2〇 p M的順鉑進行培養(yǎng)。培養(yǎng)第〇、12、24和48小時時，在各孔中分別 加入2〇 U I MTS溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后利用全自動定量繪圖酶標儀在490nm處測定甲 瓚的吸光度，從而測定存活細胞比例。
[0097]測定結(jié)果示于圖8。如圖8所示，根據(jù)順鉑的處理，時間依賴性地出現(xiàn)細胞存活率 減少，由此可以確認CDDP-誘導(dǎo)的細胞毒性。
[0098] <3_2>本發(fā)明的復(fù)合制劑的效果分析（1)
[00"]為了調(diào)查雷那新對HEI-OCl細胞的用量效果，在96孔板中以3000細胞/孔的濃 度進行接種，并添加不同濃度的雷那新（a:3.5、b:7.〇、c:14. l、d:28. l、e:56.3、f:122.5、 g:225_0、h:45〇.0及i: 9〇〇.〇y g/ml)培養(yǎng)24小時。為了 MTS分析，向各孔中添加2〇 y I MT S溶液，在33°C、10% C02條件的培養(yǎng)器中培養(yǎng)4小時，然后利用全自動定量繪圖酶標儀 在49〇nm處測定甲瓚的吸光度。
[0100]測定結(jié)果示于圖9。如圖9所示，可以知道與CON(單獨培養(yǎng)基）相比，在3. 5 Ug/ ml(a;P = 0_019)、7.0ug/ml(b;P = 0.028)和 14_ lug/ml(c;p = 〇.〇〇3)濃度下，雷那新 能夠顯著地促進HEI-OCl細胞的成長。
[0101] 〈3_3>本發(fā)明復(fù)合制劑的效果分析（2)
[0102] 為了觀察與順鉑聯(lián)用時本發(fā)明的復(fù)合制劑的預(yù)防效果，按照上述實施例〈3-1>向 HEI-OCl細胞添加不同濃度的雷那新預(yù)處理1小時后，添加20 PM的順鉑后培養(yǎng)24小時。 此后，通過如上所述的MTS分析測定甲瓚的吸光度。
[0103]測定結(jié)果示于圖10。如圖10所示，與CDDP單獨處理組相比，在14. In g/ml(c, P = 0. 000)和28_ I u g/ml (d，P = 0. 019)濃度下，雷那新能夠顯著地保護聽覺細胞免受 CDDP-誘導(dǎo)細胞毒性。
[0104] 實施例4 :對CDDP-誘導(dǎo)細胞凋亡的本發(fā)明復(fù)合制劑的體外效果分析 [0105]為了分析對CDDP-誘導(dǎo)細胞凋亡的本發(fā)明復(fù)合制劑的體外效果，用雷那新處理的 HEI-OCl細胞使用膜聯(lián)蛋白（Armexin)V-FITC/碘化丙啶（PI)染色后用流式細胞儀（ flow cytometer)進行分析。
[0106] 具體地，HEI-OCl細胞在6孔板隔夜培養(yǎng)，對照組沒有添加任何物質(zhì)，雷那新處理 組用14. I u g/ml的雷那新預(yù)處理1小時，CDDP處理組用20 u M的CDDP處理，雷那新+CDDP 處理組用14. I Ii g/ml的renexin預(yù)處理1小時后，用20 u M的CDDP處理。此后，用PBS洗 滌細胞，用胰蛋白酶分離后，在2, OOOrpm下離心分離3分鐘。收得的細胞在200W1 PBS中 小心地進行重懸，離心分離收得細胞后，在100 U I IX結(jié)合緩沖液中重懸。然后,分別添加 5 Ul的膜聯(lián)蛋白V-FIT C及PI，在常溫下培養(yǎng)15分鐘。添加400 ul IX結(jié)合緩沖液后，通 過利用FACScantoTMII (BD，圣地亞哥，加拿大）的流式細胞分析進行分析。
[0107] 上述結(jié)果示于圖11。圖11的上部表示流式細胞分析結(jié)果，下部圖表表示凋亡的比 例（％)。如圖11所示，可以知道通過CDDP處理誘導(dǎo)的聽覺細胞的細胞凋亡由于雷那新處 理而減少。這表示根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合制劑具有預(yù)防CDDP-誘導(dǎo)細胞凋亡的效果。
[0108] 實施例5 :本發(fā)明復(fù)合制劑對細胞內(nèi)信號傳遞的效果分析
[0109] 為了確認本發(fā)明的復(fù)合制劑對細胞內(nèi)信號傳遞產(chǎn)生的影響，進行了免疫印 跡試驗。細胞內(nèi)信號傳遞蛋白質(zhì)使用聚腺苷二憐酸-核糖聚合酶（poly ADP ribose polymerase，PARP)、BCL-XL、BAX、細胞色素 C、剪切的半胱天冬酶 3 (cleaved caspase3)、 ERK及JNK，對照組蛋白使用P -肌動蛋白（P-Actin)的1抗，均購自細胞信號技術(shù)公 司（Cell Signaling Technology，丹佛斯，馬薩諸塞州）。實施例4的4個組的HEI-0C1 細胞用PBS洗滌2次后，在冷RIPA緩沖液[2 y g/mL蛋白抑制劑，ImM苯甲基磺酰氟 (phenymethylsulfonyl fluoride，PMSF)、lmM NaF、lraM Na3V04]中溶解，在冰上反應(yīng) 30 分 鐘。將勻楽在4°C以13, OOOrpm離心分離30分鐘，然后上層液用于進一步分析。
[0110] 蛋白質(zhì)濃度通過DC蛋白質(zhì)分析（Bio-Rad，赫科斯（Hercules)，加拿大）確定。含 有蛋白質(zhì)（20 Ug)的試料立即在100°C下加熱10分鐘后，通過SDS-PAGE分離。在凝膠中電 泳之后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用PBS中的5%脫脂牛奶處理，封閉膜后，在4°C下與最 終稀釋至1:1〇〇〇濃度比例的1次多克隆抗體一同培養(yǎng)。在含有〇? 〇5%吐溫的PBS(PBS-T) 中洗滌后，蛋白質(zhì)條帶根據(jù)制造商的指示在X線薄膜上利用增強的化學(xué)發(fā)光分析進行視覺 化[West-Q 化學(xué)發(fā)光底物試劑盒（Chemiluminescent substrate kit)，GenDEPOT，首爾韓 國]。
[0111] 免疫印跡試驗結(jié)果示于圖12。圖12的上部圖表表示各信號傳遞蛋白的表達量，下 部表示免疫印跡試驗的照片。如圖12所示，處理雷那新的情況相比CDDP單獨處理組，通過 BCL-XL抗-細胞凋亡基因而編碼的蛋白質(zhì)表達顯著增加，BAX、細胞色素C、剪切的半胱天冬 酶3及剪切的PARP的表達顯著減少。上述結(jié)果表示雷那新抑制線粒體路徑。此外，雷那新 減少P-ERK的表達，這表示雷那新通過MAPK/ERK路徑阻斷CDDP-誘導(dǎo)細胞凋亡。
[0112] 實施例6 :本發(fā)明復(fù)合制劑對細胞內(nèi)活性氧生成的效果分析
[0113] 以對照組、CDDP單獨處理組及雷那新+CDDP處理組為對象，利用總ROS檢測試劑盒 (Enzo生命科學(xué)，ENZ-5010)測定主要在病理狀態(tài)下產(chǎn)生的細胞內(nèi)活性氧的變化。所述試劑 盒的主成分包括氧化應(yīng)激檢測試劑。所述非熒光性及細胞滲透性的總ROS檢測染料與過氧 化氫、過氧化亞硝酸鹽及羥基自由基等廣泛的活性氧粒子直接反應(yīng)，生成表示不同R0S/RNS 型的細胞生成的綠色熒光物質(zhì)。HEI-OCl細胞在12孔板中培養(yǎng)，用⑶DP (20 PM)和雷那新 (14. I ii g/mL)處理后，向細胞上樣（呈目）ROS檢測溶液，培養(yǎng)1小時。細胞用IX洗滌緩 沖液洗滌后，在熒光顯微鏡下觀察。
[0114]熒光顯微鏡照片示于圖13。如圖13所示，處理雷那新時相比CDDP單獨處理組，細 胞內(nèi)ROS的生成顯著降低。
[0115]本發(fā)明以上述具體實施例為具體例進行了說明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在隨附 的權(quán)利要求書定義的本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明進行多種變形或變更。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于預(yù)防或治療聽覺障礙的藥物組合物，其特征在于，含有西洛他唑和銀杏葉 提取物作為有效成分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述西洛他唑及銀杏葉提取物以 1:0. 1至1:4. 8的重量比包含。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于，所述西洛他唑及銀杏葉提取物以 1 :〇. 8的重量比包含。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述聽覺障礙是噪音引起的聽覺 障礙或施用耳毒性藥物引起的聽覺障礙。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于，所述耳毒性藥物是氨基糖苷抗生 素或抗癌劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述耳毒性藥物選自鏈霉素、卡那 霉素、慶大霉素、新霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、地貝卡星、紫蘇霉素、利波多麥星 及順鉬和卡鉬中的1種以上。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述耳毒性藥物為順鉬。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物抑制聽覺細胞中 的活性氧的生成及由此引起的聽覺細胞的細胞凋亡。
9. 一種用于預(yù)防或治療聽覺障礙的藥物制劑，其特征在于，該藥物組合物含有西洛他 唑和銀杏葉提取物作為有效成分。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑含有50-100mg的西洛 他唑以及40-80mg的銀杏葉提取物。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑含有1〇〇的mg西洛 他唑和80mg的銀杏提取物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物制劑，其特征在于，所述聽覺障礙是噪音引起的聽覺障 礙或施用耳毒性藥物引起的聽覺障礙。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物制劑，其特征在于，所述耳毒性藥物是氨基糖苷抗生 素或抗癌劑。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物制劑，其特征在于，所述耳毒性藥物選自鏈霉素、卡那 霉素、慶大霉素、新霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、地貝卡星、紫蘇霉素、利波多麥星 及順鉬和卡鉬中的1種以上。
15. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑是片劑、泡騰片劑、顆 粒劑或膠囊劑。
16. -種耳毒性聽覺障礙改善的抗生組合物，其特征在于，該組合物含有西洛他唑、銀 杏葉提取物及氨基糖苷抗生素作為有效成分。
17. -種耳毒性聽覺障礙改善的抗癌用組合物，其特征在于，該組合物含有西洛他唑、 銀杏葉提取物及耳毒性抗癌劑作為有效成分。
【文檔編號】A61K36/16GK104244950SQ201380016531
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月30日
【發(fā)明者】柳根鎬, 韓蕙英, 李素英 申請人:Sk化學(xué)公司