一種十二溫經(jīng)丸的制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種十二溫經(jīng)丸的制備方法，由吳茱萸90g、當歸60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿膠珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、黨參60g、半夏（制）90g、麥冬120g、蜜炙甘草60g作為原料藥制成，采用超臨界萃取制備而成，使得有效成分含量增加，服用量減少，本發(fā)明還提供了十二溫經(jīng)丸在制備抑制人黑色素瘤細胞M14細胞增殖藥物中的應用。
【專利說明】一種十二溫經(jīng)丸的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥制劑【技術領域】，具體涉及一種十二溫經(jīng)丸的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002]十二溫經(jīng)丸記載于衛(wèi)生部標準WS3-B-0005-89，處方為吳茱萸90g、當歸60g、川芎(酒制)60g、白茍60g、阿膠珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、黨參60g、半夏(制)90g、麥冬120g、甘草(蜜炙)60g,以上十二味，粉碎成細粉，過篩，混勻。每100g粉末加煉蜜50g與適量的水，泛丸，低溫干燥，即得，能溫經(jīng)散寒，養(yǎng)血祛瘀。用于沖任虛寒，瘀血阻滯，月經(jīng)不調(diào)，或先或后，或多或少，小腹冷痛以及宮寒不孕。行氣活血，制酸止痛。
[0003]現(xiàn)有技術中，尚未有十二溫經(jīng)丸在提取制備方面采用超臨界技術的報道，而采用打粉的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導致患者用量過大，不方便服用，嚴重影響了本品在臨床上應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種十二溫經(jīng)丸的制備方法。
[0005]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種十二溫經(jīng)丸在制備抑制人黑色素瘤細胞M14細胞增殖藥物中的應用。
[0006]技術方案:本發(fā)明的目的是通過如下的方案實現(xiàn)的:
[0007]一種十二溫經(jīng)丸的制備方法，由吳茱萸90g、當歸60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿膠珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、黨參60g、半夏(制)90g、麥冬120g、蜜炎甘草60g作為原料藥制成，其特征在于所述的方法由下列步驟組成:取吳茱萸90g、當歸60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿膠珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、黨參60g、半夏(制)90g、麥冬120g、蜜炙甘草60g，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.min，萃取時間150-180min，得超臨界萃取物，粉碎成細粉，過篩，混勻，每100g粉末加煉蜜50g與適量的水，泛丸，低溫干燥，即得600g水泛丸，每粒丸重0.3g。
[0008]上述一種十二溫經(jīng)丸的制備方法，所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
[0009]上述一種十二溫經(jīng)丸的制備方法，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C, CO2 流量 2ml/g 生藥.min,萃取時間 160min。
[0010]上述十二溫經(jīng)丸在制備抑制人黑色素瘤細胞M14細胞增殖藥物中的應用，十二溫經(jīng)丸由吳茱萸90g、當歸60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿膠珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、黨參60g、半夏(制)90g、麥冬120g、蜜炙甘草60g作為原料藥制成，其特征在于所述的方法由下列步驟組成:取吳茱萸90g、當歸60g、酒制川彎60g、白茍60g、阿膠珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜1·5g、黨參60g、半夏(制)90g、麥冬120g、蜜炙甘草60g，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，C02流量l_3ml/g生藥.π?η，萃取時間150_180min，得超臨界萃取物，粉碎成細粉，過篩，混勻，每100g粉末加煉蜜50g與適量的水，泛丸，低溫干燥，即得600g水泛丸，每粒丸重0.3g。
[0011]上述十二溫經(jīng)丸在制備抑制人黑色素瘤細胞M14細胞增殖藥物中的應用，十二溫經(jīng)丸制備方法中所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
[0012]上述十二溫經(jīng)丸在制備抑制人黑色素瘤細胞M14細胞增殖藥物中的應用，十二溫經(jīng)丸制備方法中所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.min,萃取時間160min。
[0013]現(xiàn)有技術中，十二溫經(jīng)丸每丸0.3g，每次6_9g，一日2次，采用本發(fā)明制備成的十二溫經(jīng)丸每丸0.3g，但含有的藥材量是原來的2倍，因此每次僅需3-4.5g，一日服用2次，在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量，增加了藥品的順應性。
【具體實施方式】
[0014]以下通過實施例形式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。
[0015]實施例1
[0016]取吳茱萸90g、當歸60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿膠珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、黨參60g、半夏(制)90g、麥冬120g、蜜炙甘草60g，加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，C02流量lml/g生藥.min，萃取時間150min，得超臨界萃取物，粉碎成細粉，過篩，混勻，每100g粉末加煉蜜50g與適量的水，泛丸，低溫干燥，即得600g水泛丸，每粒丸重0.3g。
[0017]實施例2
[0018]取吳茱萸90g、當歸60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿膠珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、黨參60g、半夏(制)90g、麥冬120g、蜜炙甘草60g，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，CO2流量3ml/g生藥.min，萃取時間180min，得超臨界萃取物，粉碎成細粉，過篩，混勻，每100g粉末加煉蜜50g與適量的水，泛丸，低溫干燥，即得600g水泛丸，每粒丸重0.3g。
[0019]實施例3
[0020]取吳茱萸90g、當歸60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿膠珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、黨參60g、半夏(制)90g、麥冬120g、蜜炙甘草60g，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.min，萃取時間160min，得超臨界萃取物，粉碎成細粉，過篩，混勻，每100g粉末加煉蜜50g與適量的水，泛丸，低溫干燥，即得600g水泛丸，每粒丸重0.3g。
[0021]實施例4:十二溫經(jīng)丸抑制M14細胞增殖的實驗研究資料
[0022]1實驗材料
[0023]1.1實驗用細胞株
[0024]人黑色素瘤細胞M14細胞，南京醫(yī)科大學實驗室細胞庫，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。[0025]1.2實驗藥物
[0026]研究藥物:本發(fā)明十二溫經(jīng)丸:按實施例3方法制備。
[0027]藥液儲液:稱取IOOmg十二溫經(jīng)丸，溶于5ml無水乙醇中，0.2 μ m濾器過濾，500 μ Idoff管分裝，-20°C存儲，同時0.2 μ m濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。[0028]1.3實驗試劑
[0029]DMEM (GIBC0 公司 Cat.N0.12100_061Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419)；NaHC03 (上海久億化學試劑有限公司Cat.N0.11810_033Lot.N0.1088387)；Trypsin (AMRESC0 公司批號:2010/04)；EDTA (AMRESC0 公司批號:2009/10);Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0公司批號:2010242);Str印tomycin SulfateCAMRESCO公司批號:2010382);無水乙醇(南京化學試劑有限公司批號:080310182);MTT(Biosharp批號:0793) ;PBS (實驗室自配)；
[0030]1.4實驗器材
[0031]萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號:DM1L);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型號:SPECTRA MAX190) ；C02培養(yǎng)箱(FORMA型號:3111);超凈臺(蘇凈集團安泰公司制造型號:SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號:S/N020579);精密移液器(法國吉爾森公司型號:P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號:BT323S);全自動高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號:MLS-3020);臺式電熱鼓風干燥箱(上海精密實驗設備公司型號:DHG9123A);冰箱(西門子公司型號:KG18V21TI);液氮罐(CBS型號:2001);低速離心機(上海安亭科學儀器廠型號:ΚΑ-1000) ;0.2μπι濾器(MILLIP0RE型號:SLGP033RB) ;10cm培養(yǎng)皿(NEST公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細胞計數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0032]2實驗方法
[0033]I )M14細胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進行常規(guī)培養(yǎng)(IOcm培養(yǎng)皿)，當細胞生長至對數(shù)期時，收集細胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA,37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應，吹打細胞后將其轉入離心管中，1000rpm離心5min，調(diào)整細胞懸液濃度3X 104個/ml。
[0034]2)將細胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液180 μ I,培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中(37 °C，5%C02 )常規(guī)培養(yǎng)。
[0035]3)根據(jù)細胞生長情況，一般長至50%_70%，加入十二溫經(jīng)丸溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0036]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0037]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0038]6)同時設置本底(不加細胞，只加培養(yǎng)液)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設定6個復孔。
[0039]7)結果以藥物對細胞的抑制率表示:
[0040]細胞增值抑制率(％)=(對照孔OD值-給藥孔OD值)/對照孔OD值X 100%。實驗重復3次。
[0041]3統(tǒng)計處理
[0042]采用Microsoft Excel2003軟件中的相關分析和Student t檢驗，數(shù)據(jù)以mean+ S.D.表不。[0043]4實驗結果
[0044]MTT法實驗后統(tǒng)計結果顯示，與對照組比較，當劑量達到5mg/ml時，對M14細胞增殖抑制有差異(P〈0.05)，劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性(P〈0.01)，當劑量達到15-20mg/ml時有極顯著性差異(Ρ〈0.001)。
[0045]表1十二溫經(jīng)丸對Μ14細胞增殖抑制影響研究廠(X土SD)
[0046]
【權利要求】
1.一種十二溫經(jīng)丸的制備方法，由吳茱萸90g、當歸60g、酒制川彎60g、白茍60g、阿膠珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、黨參60g、半夏(制)90g、麥冬120g、蜜炎甘草60g作為原料藥制成，其特征在于所述的方法由下列步驟組成:取吳茱萸90g、當歸60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿膠珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、黨參60g、半夏(制)90g、麥冬120g、蜜炙甘草60g，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.min，萃取時間150-180min，得超臨界萃取物，粉碎成細粉，過篩，混勻，每100g粉末加煉蜜50g與適量的水，泛丸，低溫干燥，即得600g水泛丸，每粒丸重0.3g。
2.根據(jù)權利要求1所述一種十二溫經(jīng)丸的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3.根據(jù)權利要求1所述一種十二溫經(jīng)丸的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa,溫度40°C, CO2流量2ml/g生藥.min,萃取時間160min。
4.根據(jù)權利要求1所述一種十二溫經(jīng)丸在制備抑制人黑色素瘤細胞M14細胞增殖藥物中的應用，其特征在于十二溫經(jīng)丸由吳茱萸90g、當歸60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿膠珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、黨參60g、半夏(制)90g、麥冬120g、蜜炎甘草60g作為原料藥制成，其特征在于所述的方法由下列步驟組成:取吳茱萸90g、當歸60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿膠珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、黨參60g、半夏(制)90g、麥冬120g、蜜炙甘草60g，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.min，萃取時間150-180min，得超臨界萃取物，粉碎成細粉，過篩，混勻，每100g粉末加煉蜜50g與適量的水，泛丸，低溫干燥，即得600g水泛丸，每粒丸重0.3g。
5.根據(jù)權利要求4所述一種十二溫經(jīng)丸在制備抑制人黑色素瘤細胞M14細胞增殖藥物中的應用，其特征在于十`二溫經(jīng)丸制備方法中所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
6.根據(jù)權利要求4所述一種十二溫經(jīng)丸在制備抑制人黑色素瘤細胞M14細胞增殖藥物中的應用，其特征在于十二溫經(jīng)丸制備方法中所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C, CO2 流量 2ml/g 生藥.min,萃取時間 160min。
【文檔編號】A61K9/20GK103656600SQ201310712990
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月22日 優(yōu)先權日:2013年12月22日
【發(fā)明者】李強 申請人:青島琴誠醫(yī)藥技術有限公司