一種呼吸道合胞病毒樣顆粒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及呼吸道合胞病毒樣顆粒，建立了一種新的制備呼吸道合胞病毒樣顆粒的方法，并用于動物免疫。本發(fā)明按照哺乳動物細(xì)胞密碼子偏性，對M、F、G基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，分別克隆到穿梭載體中，獲得重組腺病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染，獲得重組腺病毒FGAd-Msyn，F(xiàn)GAd-Fsyn、FGAd-Gsyn；將重組腺病毒感染Vero細(xì)胞，獲得病毒樣顆粒；采用蔗糖密度梯度離心的方法進(jìn)行病毒樣顆粒純化；并用于動物免疫。本發(fā)明采用腺病毒載體制備病毒樣顆粒，建立了一種新的病毒樣顆粒制備方法，并通過密碼子優(yōu)化，提高蛋白表達(dá)量，提高病毒樣顆粒的產(chǎn)量，獲得較好的免疫效果，并且相對安全。
【專利說明】一種呼吸道合胞病毒樣顆粒及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus, RSV)病毒樣顆粒(Virus like particles, VLPs)及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus, RSV)廣泛分布于世界各地，是引起嬰幼兒下呼吸道感染最重要的病毒性病原，發(fā)病高峰期為出生后的6周至6個月，尤其是2~6個月嬰幼兒，發(fā)病率高，出生一年內(nèi)約有70%嬰兒被感染。RSV也是我國嬰幼兒急性下呼吸道感染的主要病毒病原，引起嬰幼兒流行性喘憋性肺炎或毛細(xì)支氣管炎，分布廣泛，流行發(fā)病率為0.24%~21.9%，住院病死率為0.5%~4%。老人和免疫缺陷人群也易遭受RSV引起的嚴(yán)重感染。世界衛(wèi)生組織等估計全球每年發(fā)病人數(shù)為6400萬、死亡人數(shù)為16-100萬。近期研究認(rèn)為，RSV感染引起的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)可能比季節(jié)性流感更加嚴(yán)重，但由于RSV的診斷、預(yù)防及治療均缺乏有效、可靠的方法，面對RSV感染，人們因缺乏治本之策，常將其統(tǒng)稱為“普通感冒”或“病毒性感染。為此，世界衛(wèi)生組織及美國醫(yī)學(xué)研究院有關(guān)21世紀(jì)疫苗報告中均將開發(fā)RSV疫苗列為最優(yōu)先發(fā)展的疫苗項目之一。
[0003]RSV屬于副黏病毒科，肺炎病毒屬，基因組為單股負(fù)鏈，編碼11種蛋白，包括3種跨膜包膜糖蛋白(F、G和SH)，4種核殼體蛋白(N、P、L和M2-1)，2種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl和NS2)，I種基質(zhì)蛋白(M)和I種RNA調(diào)節(jié)因子(M2-2)。其中G、F為RSV主要中和抗原。
[0004]盡管RSV作為呼吸道病原體的重要性已在50多年前就被廣泛認(rèn)識，已嘗試過多種形式的RSV疫苗，例如:以傳統(tǒng)方法獲得的減毒RSV活疫苗、福爾馬林滅活疫苗(Formalin-1nactivated RSV vaccine, F1-RSV)、核酸疫苗、病毒載體疫苗和亞單位疫苗等。由于作為RSV疫苗主要接種對象的2-6個月低齡嬰幼兒存在免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟及母傳抗體干擾等問題，上述疫苗在安全性或免疫原性等方面均有不足，至今尚未有能夠用于預(yù)防人RSV感染的疫苗問世。
`[0005]病毒樣顆粒(Virus-like particles, VLPs)是一種不含病毒核酸，在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與病毒類似的顆粒狀物質(zhì)，與蛋白疫苗相比，VLPs疫苗不僅有很好的安全性，而且由于VLPs保留了天然病毒顆粒的空間構(gòu)象和誘導(dǎo)中和抗體的抗原表位，能迅速、有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)大的體液免疫應(yīng)答。在新型疫苗的研究中，取得了巨大成功。如美國默克公司(Merck)的人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV) HPV6/ll/16/18VLPs 四價疫苗Gardasil和葛蘭素史克公司(GSK)的HPV16和HPV18雙價疫苗Cervarix已經(jīng)用于臨床，這兩種VLPs疫苗均可預(yù)防宮頸癌。用于臨床的VLPs疫苗還有乙肝病毒(hepatitis B virus)疫苗和流感病毒(influenza virus)疫苗。由我國自主研發(fā)的戍型肝炎病毒(hepatitis Evirus, HEV)疫苗也已經(jīng)上市。另外,至少有12種VLPs疫苗相繼進(jìn)入臨床試驗,如LigoCyte公司的諾瓦克病毒(Norwalk virus)疫苗和MedImmune公司的細(xì)小病毒(parvovirus)疫苗等。這些進(jìn)展顯示VLPs疫苗是一種具有很好發(fā)展前景的新型疫苗。
[0006]RSV VLPs疫苗的研究已見文獻(xiàn)報道，以往多采用桿狀病毒載體系統(tǒng)或真核質(zhì)粒制備RSV VLPs，但均存在明顯的缺點，如利用桿狀病毒載體系統(tǒng)制備RSV VLPs時，VLPs在出芽過程中攜帶了大量昆蟲細(xì)胞的膜蛋白，該VLPs應(yīng)用于人時，可能會引起過敏反應(yīng)；真核質(zhì)粒制備RSV VLPs時，存在表達(dá)量低的問題。因而，迫切需要建立一種新的RSV VLPs制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明解決的第一個技術(shù)問題是提供一種呼吸道合胞病毒樣顆粒。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0009]本發(fā)明提供了一種呼吸道合胞病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒包含呼吸道合胞病毒M蛋白，所述蛋白由密碼子優(yōu)化的M基因進(jìn)行編碼。
[0010]進(jìn)一步地，所述密碼子優(yōu)化的M基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。 [0011]進(jìn)一步地，所述呼吸道合胞病毒顆粒還可包含呼吸道合胞病毒F蛋白或呼吸道合胞病毒G蛋白或其組合，所述F蛋白和G蛋白分別由密碼子優(yōu)化的F基因和G基因進(jìn)行編碼。
[0012]進(jìn)一步地，所述密碼子優(yōu)化的F基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示，密碼子優(yōu)化的G基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.3所示。
[0013]本發(fā)明對RSV A亞型Long株F、M、G蛋白基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，目的是增加蛋白的表達(dá)量。
[0014]本發(fā)明解決的第二個技術(shù)問題是一種呼吸道合胞病毒樣顆粒的制備方法，利用重組腺病毒制備呼吸道合胞病毒病毒樣顆粒，該方法同樣適于其他病毒的病毒樣顆粒制備，采用的技術(shù)方案為，將所述的含有M蛋白的重組腺病毒FGAd-Msyn單獨感染Vero細(xì)胞，或?qū)GAd-Msyn與含有呼吸道合胞病毒F蛋白的重組腺病毒FGAd-Fsyn和/或含有呼吸道合胞病毒G蛋白的重組腺病毒FGAd-Gsyn，按適當(dāng)比例混合感染Veix)細(xì)胞，獲得病毒樣顆粒，其中，所述F蛋白和G蛋白分別由密碼子優(yōu)化的F基因和G基因進(jìn)行編碼，其步驟包括:
[0015](I)針對哺乳動物細(xì)胞對密碼子的偏好性，對M、F和G基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，分別命名Msyn、Fsyn> Gsyn,將Msyn、Fsyn> Gsyn分別克隆到穿梭載體pShuttle_CMV中,得到重組穿梭質(zhì)粒 pShuttle-CMV-Msyn、pShuttle-CMV-Fsyn、pShuttle-CMV-Gsyn ；
[0016](2)將重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的RecA+E.coliBJ5183/p的感受態(tài)細(xì)胞，篩選鑒定，獲得分別有Msyn、Fsyn, Gsyn基因的重組腺病毒質(zhì)粒pAdeasy-Msyn, pAdeasy-Fsyn,pAdeasy-Gsyn ；
[0017](3)分別將 pAdeasy-Msyn,pAdeasy-Fsyn,pAdeasy-Gsyn 轉(zhuǎn)染 293 細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，獲得重組腺病毒 FGAd-Msyn、FGAd-Fsyn、FGAd-Gsyn ；
[0018](4)將 FGAd-Msyn 單獨接種 Vero 細(xì)胞，或?qū)?FGAd-Msyn 與 FGAd-Fsyn 和 / 或FGAd-Gsyn混合感染Vero細(xì)胞，獲得含病毒樣顆粒的上清液；
[0019](5)蔗糖密度梯度離心進(jìn)行純化，獲得純化后的病毒樣顆粒。
[0020]進(jìn)一步地，步驟(5)中蔗糖密度梯度離心的步驟為:
[0021](I)將上清液離心；
[0022](2)棄掉上清，將沉淀重懸，分別加入60%、50%、30%蔗糖墊層，離心；
[0023](3)收集目的條帶位置的蛋白帶，再分別加入60%、50%、40%、30%、20%蔗糖墊層，離心;
[0024](4)收集密度接近的樣品，加入預(yù)冷的NTE混勻，離心；
[0025](5)棄掉上清，用預(yù)冷的NTE重懸沉淀，分裝。
[0026]包含所述呼吸道合胞病毒樣顆粒的疫苗。
[0027]進(jìn)一步地，所述疫苗為注射劑、口服劑、滴鼻劑、噴霧劑或透皮劑形式。
[0028]所述呼吸道合胞病毒樣顆粒在制備用于預(yù)防呼吸道合胞病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
[0029]所述呼吸道合胞病毒樣顆粒用于制備呼吸道合胞病毒抗體。
[0030]所述呼吸道合胞病毒樣顆粒用于制備呼吸道合胞病毒診斷試劑。
[0031]本發(fā)明采用的是腺病毒載體系統(tǒng)，即復(fù)制缺陷型腺病毒載體系統(tǒng)。該復(fù)制缺陷型腺病毒載體系統(tǒng)為El和/或E3區(qū)缺失的腺病毒，容許攜帶6.5~8kb的外源基因，外源基因表達(dá)盒(包括外源啟動子、目的基因以及終止子)一般被插入到El區(qū)所對應(yīng)的部分。該腺病毒載體被廣泛用于基因治療和疫苗研究，我們在實踐中發(fā)現(xiàn)該載體能用于大量表達(dá)外源蛋白，于是采用該載體建立一種新的病毒樣顆粒的制備方法。
[0032]密碼子優(yōu)化(codon optimization)遺傳密碼有64種,但是絕大多數(shù)生物傾向于利用這些密碼子中的一部分。那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子(optimal codons),那些不被經(jīng)常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子(rare or low-usage codons)。實際上用做蛋白表達(dá)或生產(chǎn)的每種生物(包括大腸桿菌，酵母，哺乳動物細(xì)胞，Pichia，植物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞)都表現(xiàn)出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛。大腸桿菌、酵母、果蠅、靈長類等每種生物都有獨特的8個密碼子極少被利用。有趣的是，靈長類和酵母有6個同樣的利用率低的密碼子。大腸桿菌、酵母和果蠅中編碼豐度高的蛋白質(zhì)的基因明顯避免低利用率的密碼子。因此，重組蛋白的表達(dá)受密碼子利用的影響(尤其在異源表達(dá)系統(tǒng)中)。基因利用的密碼子可能不是蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)進(jìn)行高水平表達(dá)所偏愛的密碼子。利用偏愛密碼子(preferredcodons)并避免利用率低的或稀有的密碼子可以基因合成，基因的這種重新設(shè)計叫密碼子優(yōu)化。其他因素也可以影響蛋白表達(dá)，包括使mRNA去穩(wěn)定的序列。重新設(shè)計合成基因可以去除或改變這些序列，導(dǎo)致高水平表達(dá)。消除稀有密碼子、去除任何去穩(wěn)定序列和利用最佳密碼子的基因的重新設(shè)計都可能增加蛋白產(chǎn)量，使得蛋白生產(chǎn)更有效和經(jīng)濟(jì)。
[0033]本發(fā)明的有益效果是:密碼子優(yōu)化可以大大提高蛋白表達(dá)量，提高病毒樣顆粒的產(chǎn)量；通過復(fù)制缺陷型腺病毒系統(tǒng)來生產(chǎn)病毒樣顆?？蓽p少例如使用桿狀病毒等系統(tǒng)制備出的病毒樣顆粒對人體的致敏性。本實驗應(yīng)用的Vero細(xì)胞是WHO批準(zhǔn)的可用于疫苗研制的細(xì)胞之一，相對安全。
[0034]下面結(jié)合說明書附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1為pMA-T-Msyn酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖，I是DL15000DNA marker, 2是目的基因Msyn，大小是774bp ；
[0036]圖2為pMA-T-Fsyn酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖，I是DL15000DNA marker, 2是目的基因Fsyn，大小是1728bp;[0037] 圖3為重組穿梭質(zhì)粒酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖，I是目的基因Msyn，大小是774bp,2 是 DL15000DNA marker。
[0038]圖4為重組穿梭質(zhì)粒酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖，I是目的基因Fsyn，大小是1728bp，2 是 DL15000DNA marker;
[0039]圖5為重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-Msyn經(jīng)Pac I酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖，I是目的基因Msyn，條帶大小是4.5Kb和33Kb的片段，2是DL15000DNA marker ；
[0040]圖6為重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-Fsyn經(jīng)Pac I酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖，I是DL15000DNA marker, 2是目的基因Fsyn，條帶大小是4.5Kb和33Kb的片段；
[0041]圖7為重組腺病毒FGAd-Msyn轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，引起293細(xì)胞發(fā)生病變，A為病變的293細(xì)胞，B為正常的293細(xì)胞；
[0042]圖8為重組腺病毒FGAd-Msyn感染293細(xì)胞約72h后的Western blot鑒定結(jié)果，I為上清中M蛋白；2細(xì)胞中M蛋白；
[0043]圖9為重組腺病毒FGAd-Fsyn感染293細(xì)胞約72h后，收獲細(xì)胞的Western blot鑒定結(jié)果;
[0044]圖10為重組腺病毒FGAd-Msyn與重組腺病毒FGAd-Fsyn共同感染293細(xì)胞后培養(yǎng)基上清經(jīng)蔗糖密度梯度離心后的Western blot鑒定結(jié)果；
[0045]圖11為經(jīng)蔗糖密度梯度離心后的VLPs形成的條帶；
[0046]圖12為由RSV Msyn形成VLPs的電鏡觀察結(jié)果(1%磷鎢酸pH6.8負(fù)染，JEM-1400，10000X )；
[0047]圖13為由RSV Msyn與RSV Fsyn共同形成VLPs的電鏡觀察結(jié)果(1%磷鎢酸pH6.8負(fù)染，JEM-1400,15000X )；
[0048]圖14為動物免疫后數(shù)據(jù)分析圖。
【具體實施方式】
[0049]本發(fā)明所用的呼吸道合胞病毒和重組腺病毒由北京交通大學(xué)生物工程與生命科學(xué)研究院基因工程實驗室保存。
[0050]實施例1:重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建
[0051]1.構(gòu)建:針對哺乳動物細(xì)胞對密碼子的偏好性，對野生型RSV M、F、G進(jìn)行密碼子的優(yōu)化，分別命名Msyn、Fsyn、Gsyn,以提高其在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)量；全基因合成密碼子優(yōu)化的M、F、G基因，pMA-T-Msyn、pMA-T-Fsyn和pMA-T-Gsyn ;分別利用限制性內(nèi)切酶Hind III與 EcoR V雙酶切 pMA-T-Msyn、pMA-T-Fsyn 和 pMA-T-Gsyn,回收目的片段。
[0052]瓊脂糖凝膠電泳后，在近774bp處(見圖1)和1728bp處(見圖2)各有一特異性條帶，分別與Msyn基因和Fsyn基因長度一致。
[0053]采用限制性內(nèi)切酶把11(1111與￡(301?乂雙酶切穿梭載體口31111?16-01^，回收載體片段，分別與目的片段Msyn、Fsyn、Gsyn片段12°C~16°C連接過夜，連接產(chǎn)物分別命名為pShuttle-Msyn、pShuttle-Fsyn、pShuttle-Gsyn。用限制性內(nèi)切酶 Hind III與 EcoR V進(jìn)行雙酶切鑒定，凝膠電泳分別在774bp、7500bp處(見圖3)以及1728bp、7500bp處(見圖4)出現(xiàn)特異性條帶，表明重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0054]2.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞:[0055]a取感受態(tài)菌E.coli DH5 a 一管，加10 U I連接產(chǎn)物，混勻，冰浴30min ；
[0056]b42°C，熱休克 90s ;
[0057]c 冰浴 2min ；
[0058]d加800 u I不含抗生素的液體LB，37°C，振搖培養(yǎng)，200rpm, Ih ；
[0059]e取約100 ill~200 U I菌液涂板，37°C孵箱培養(yǎng)12~15h。
[0060]3.提取:
[0061 ] (I)超凈工作臺中挑取單個菌落接種Kana+LB液體培養(yǎng)基，37 °C，250rpm振搖12~16h。
[0062](2)使用OMEGA試劑盒進(jìn)行小量提取質(zhì)粒
[0063]a取約1.2ml菌液于1.5ml Ep管中，1000Orpm離心Imin,棄上清,吸水紙吸干；
[0064]b加入250 Ul溶液I，在旋渦震蕩器上劇烈震蕩混勻，重懸菌體；
[0065]c加入250 U I溶液II，快速輕柔顛倒混勻4~5次，室溫放置2min，至溶液變澄清；
[0066]d再加350 U I溶液III，劇烈顛倒混勻4~5次，至溶液出現(xiàn)白色絮狀沉淀；
[0067]el3000g,離心IOmin,將上清液小心轉(zhuǎn)移至結(jié)合柱內(nèi)，1000Og,離心Imin ；
[0068]f棄去收集管中的液體將結(jié)合住重新裝入收集管，加入Buffer HB500iU，離心lOOOOg，Imin ；`
[0069]g棄去收集管中的液體將結(jié)合住重新裝入收集管，加入Wash Buffer700iil，離心10000g, lmin,重復(fù)一次；
[0070]h 空離結(jié)合柱，13000g, 2min ；
[0071]i將結(jié)合住重新裝入新的EP管中，向結(jié)合住中間部分緩慢加入30-50 ill Elutionbuffer,室溫靜置 I ~2min ;離心 13000g, lmin。
[0072]4.鑒定:由于片段兩端分別有Hind III與EcoR V酶切位點，取質(zhì)粒用Hind III與EcoR V雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，370C，2h。
[0073]實施例2:構(gòu)建含有Msyn、Fsyn或Gsyn基因的重組腺病毒質(zhì)粒
[0074]1.在RecA+E.coli BJ5183細(xì)胞內(nèi)的同源重組:
[0075]Pme I 酶切線性化 pShuttle-Msyn、pShuttle-Fsyn、pShuttle-Gsyn, 37°C,過夜酶切。取約 500ng Pme I 酶切線性化后的 pShuttle-Msyn DNA 分子、pShuttle-Fsyn DNA 分子、pShuttle-Gsyn DNA 分子,加 H2O 補(bǔ)至 400 U I,加入 40 u 13mol/L 乙酸鈉(pH5.2),再加A 2-2.5倍體積的無水乙醇，置于_20°C沉淀30min。4°C，12000rpm離心lOmin。用75%乙醇洗滌沉淀I次，晾干后溶解于10 U I ddH20中，置于_20°C保存?zhèn)溆谩Ｈ〖s5 上個步驟獲得的 pShuttle-Msyn DNA 分子、pShuttle-Fsyn DNA 分子、pShuttle-Gsyn DNA,化學(xué)轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的RecA+E.coli BJ5183/p感受態(tài)細(xì)胞，涂Kana+的LB平板，37°C培養(yǎng)過夜，挑取單個菌落，接種Kana+的5ml LB培養(yǎng)液內(nèi)，37°C培養(yǎng)過夜，獲得的重組腺病毒質(zhì)粒分別命名為pAdEasy-Fsyn、pAdEasy-Msyn、pAdEasy-Gsyn。以堿裂解法小量制備質(zhì)粒，方法同上，Pac I鑒定重組腺病毒質(zhì)粒。
[0076]由于穿梭質(zhì)粒pShuttle-Msyn、pShuttle_Fsyn的右臂(right arm)與腺病毒骨架載體pAdEasy-1的右臂(right arm)同時共有Ad5病毒基因組3534_5772bp的序列,可有效介導(dǎo)二者同源重組；而穿梭質(zhì)粒的左臂(left arm)與骨架載體的左臂(left arm)同時共有腺病毒Ad5的右側(cè)末端34931-35935bp的序列，同源重組可在此區(qū)發(fā)生，或在其共有的質(zhì)粒復(fù)制原點ori處發(fā)生。為確定同源重組發(fā)生的位置，我們可用一組限制性內(nèi)切酶予以鑒定。若同源重組發(fā)生在兩者的左臂與右臂同源序列之間，這種情況下所獲得的重組腺病毒質(zhì)粒有兩個EcoR I和兩個BamH I的酶切位點。則EcoR I的酶切結(jié)果應(yīng)為兩條帶，分別約為24Kb，13Kb ；BamH I的酶切結(jié)果也應(yīng)為兩條帶，分別約為12Kb，25Kb ；Pac I酶切會有兩條
3.0Kb和34Kb的片段。若同源重組發(fā)生在兩者的ori與右臂同源序列之間,pShuttle-Msyn、pShuttle-Fsyn左臂的EcoR I酶切位點將不會出現(xiàn)在腺病毒重組質(zhì)粒上，所獲得的重組腺病毒質(zhì)粒有一個EcoR I和兩個BamH I的酶切位點。EcoR I的酶切結(jié)果應(yīng)為一條帶，約37Kb ;而BamH I的酶切結(jié)果仍為兩條帶，分別約12Kb及25Kb ；Pac I酶切酶切會有兩條約
4.5Kb和33Kb的片段。電泳結(jié)果表明同源重組發(fā)生在兩者的ori與右臂同源序列之間，見圖5、圖6。
[0077]2.用 PEG8000 大量制備和純化 pAdEasy-Fsyn、pAdEasy-Msyn、pAdEasy-Gsyn
[0078](I)取鑒定正確的陽性菌液于LB平板上進(jìn)行四區(qū)劃線，37°C培養(yǎng)過夜。挑取單菌落分別接種到500ml含Kana的LB培養(yǎng)液內(nèi)，于37°C，250~300rpm震搖過夜。
[0079](2)收集500ml菌液至干凈的離心管，4°C，8000rpm，離心15min。(肉眼觀察上清液應(yīng)澄清透明)
[0080](3)棄上清，在洗水紙上扣干。先后加入IOml溶液I (用吸管將細(xì)菌充分懸起，混勻)，20ml溶液II (上下顛倒混勻20次，室溫靜置5min)和15ml溶液IIK上下顛倒混勻20次)。4°C, 8000rpm,離心 15min。
[0081]其中，溶液I 為:50mM 葡萄糖 / 25mM Tris - Cl / IOmM EDTA，pH8.0 ;溶液 II 為:
0.2N NaOH/1%SDS ;溶液III為:3M 醋酸鉀 / 2M 醋酸；
[0082](4)轉(zhuǎn)移上清至干凈的50ml離心管，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻。4°C，4000rpm,離心 15min。
[0083](5)棄上清，用3ml TE(pH8.0)充分溶解所有沉淀(用吸管操作)，加入等體積5MLiCl (此時總體積為61111)，混勻(此時溶液呈白色混濁狀)，41:，4000印111，離心15min。
[0084](6)轉(zhuǎn)移上清至干凈的50ml離心管，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻。4°C，4000rpm,離心 15min。
[0085](7)棄上清，用0.5ml TE充分溶解沉淀，分兩步溶解，先加300 U I充分溶解并轉(zhuǎn)移DNA后，再用200 ill溶解剩余沉淀并轉(zhuǎn)移，溶解時，使用吸管，并將溶液轉(zhuǎn)移至1.5ml Ep管，此時溶液為白色不透明液體，加入5 ill RNaseA, 37 °C lh。加入等體積的1.6mol/L NaCl含13%PEG8000，可觀察到大量絮狀沉淀。4°C，13000rpm，離心lOmin。
[0086](8)棄上清，加入0.5ml TE溶解EP管底部的白色沉淀，將沉淀輕輕彈起，55°C，放置Ih或更長時間。期間倒置數(shù)次以促進(jìn)DNA溶解(EP管蓋受熱后極易彈開，要小心操作或者用膠帶將EP管蓋固定，DNA充分溶解后，溶液為無色粘稠液體。)
[0087](9)酚/氯仿/異戊醇和氯仿抽提DNA。首先加入500 苯酚(取酚時，應(yīng)注意避開水相)，劇烈倒置混勻數(shù)次，13000rpm,離心8min。用200 移液器轉(zhuǎn)移含DNA的上層水相到新的EP管中，避免吸到酚層液體。加入等量氯仿，劇烈倒置混勻數(shù)次，13000rpm，離心8min，移液器轉(zhuǎn)移含DNA的上層水相到新的EP管中，避免吸到氯仿層液體。
[0088](10)直接加入無水乙醇500 iU，倒置混勻數(shù)次，可見明顯的絮狀沉淀，13000rpm,離心lOmin，肉眼觀察，在Ep管底部有白色或無色透明的DNA沉淀，有時沉淀也會出現(xiàn)在管壁上，小心棄取上清，37 0C，干燥30min。
[0089](11)用200~500 ill TE，充分溶解DNA (無色、透明物質(zhì))，55°C，30min，并用移液
器反復(fù)吹吸數(shù)次直至完全溶解。
[0090]實施例3:將重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)，獲得重組腺病毒
[0091]1.用 Pac I 酶切重組腺病毒質(zhì)粒 pAdEasy-Fsyn、pAdEasy_Msyn 和 pAdEasy-Gsyn:
[0092]用Pac I 過夜酶切重組腺病毒質(zhì)粒 pAdEasy-Fsyn、pAdEasy-Msyn、pAdEasy_Gsyn,完全消化以去除ori和Kana抗性基因等質(zhì)粒構(gòu)件，并暴露其ITR，酶切后無水乙醇沉淀，干燥，20 ill無菌H2O溶解。 [0093]2.轉(zhuǎn)染293細(xì)胞
[0094]293細(xì)胞由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制研究所惠贈。
[0095]當(dāng)293細(xì)胞生長豐度約50%~70%時，取用Pac I酶分別消化重組的腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-Fsyn>pAdEasy-Msyn 和 pAdEasy-Gsyn 各 10 U I 與 240 U I opti — MEM (GIBCO)充分混勻(溶液 A),室溫溫育 5min ;同時將 10 u I Lipofectamine2000 與 240 u I opti — MEM(GIBCO)充分混勻(溶液B)，室溫溫育5min。溫育后將溶液A與溶液B混勻，室溫繼續(xù)作用30min。在上述等候的時間里，移去293細(xì)胞的原培養(yǎng)液，用2ml opti 一 MEM液洗細(xì)胞二次。30min后將500 y I Lipofectamine-DNA的復(fù)合物加至洗漆過的細(xì)胞中，再補(bǔ)加1.5mlopt1- MEM,置37°C，5%C02培養(yǎng)箱中，孵育5h。5h后更換完全培養(yǎng)液，次日更換維持液。轉(zhuǎn)染后7d左右，293細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，圓縮、細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞折光性增強(qiáng)等典型的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，顯微鏡下觀察，見圖7。于第10天收集細(xì)胞與上清液一起置-80°C、37°C反復(fù)凍融3次后，此為PassageO代毒種。取PassageO代的毒種，接種于293細(xì)胞，37°C、5%C02培養(yǎng)至細(xì)胞病變。約48h — 72h左右，細(xì)胞已經(jīng)完全病變、脫落，按上述方法處理293細(xì)胞，獲得Pl代病毒。重復(fù)上述操作，直至獲得P3代病毒。獲得的含有MsyruFsyn或Gsyn基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒分別命名為FGAd-Msyn、FGAd-Fsyn, FGAd-Gsyn。
[0096]實施例4:重組腺病毒的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物鑒定
[0097]取生長豐度達(dá)到90%以上的293細(xì)胞，分別接種P3FGAd_Msyn、FGAd-Fsyn、FGAd-Gsyn,待出現(xiàn)80%CPE后，將細(xì)胞放置于冰上10_30min (目的讓培養(yǎng)基冷卻)，刮下病變的細(xì)胞收集于預(yù)冷的離心管中，4°C，5000rpm，離心lOmin，保留上清并凍干，重復(fù)用PBS清洗一次。將細(xì)胞沉淀用100 u I含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液(碧云天)重懸，置冰上裂解Ih,然后4°C, 12000rpm,離心lOmin,收集上清，立即加入適量5 X SDS Loading buffer,進(jìn)行WB鑒定。
[0098](I)采用12%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳完畢后取出帶有凝膠的玻璃板，用割膠刀順其下緣小心撬開玻璃板，按樣品的多少切下合適大小的凝膠，浸泡在IX電轉(zhuǎn)液中5min左右，以平衡離子強(qiáng)度。用IX膜轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡預(yù)先剪好的合適大小的3M濾紙6片和硝酸纖維素膜一片，將3層濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、3層濾紙依次疊加在一起，修剪成同樣大小，用玻璃棒輕輕搟壓濾紙以趕出氣泡。
[0099](2)置于電轉(zhuǎn)儀內(nèi)，硝酸纖維素膜位于正極，合上陽極板，接好電線。
[0100](3)轉(zhuǎn)膜條件:電流為膜面積(cm2) X0.8，電轉(zhuǎn)移時間為I小時10分鐘至2小時。
[0101](4)電轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取下硝酸纖維素膜，裝入雜交袋中。[0102](5)用含5%脫脂奶的TBST封閉液封閉硝酸纖維素膜2h，用1: 3000稀釋的羊抗人RSV多抗(Chemicon)與膜4°C孵育過夜，TBST洗滌3次，IOmin/次。用1: 5000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG (購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)與膜室溫孵育lh，TBST洗漆3次，IOmin/次。
[0103](6)用ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)曝光顯跡:在暗室中，按膜面積(cm2) X0.125ml的用量，等體積混合化學(xué)發(fā)光試劑的A液與B液(購于Thermo)。將混合后的液體逐滴加到膜上，暗室中可見到膜上出現(xiàn)綠色熒光條帶，甩干膜上多余液體，用保鮮膜將膜包好，蛋白面朝上。在暗室內(nèi)對底片曝光5~lOmin。取出底片放置于顯影液中顯影2min,再放置于定影液中定影5min，大量水沖洗，晾干保存。
[0104]由圖8、圖9可見,在FGAd-Msyn和FGAd-Fsyn感染的細(xì)胞分別出現(xiàn)特異的Msyn和Fsyn蛋白條帶。
[0105]實施例5:病毒樣顆粒制備
[0106]在Vero細(xì)胞生長豐度為90%時，更換不含血清以及雙抗的DMEM培養(yǎng)基，用重組腺病毒FGAd-Msyn感染Vero細(xì)胞，48~72小時收集培養(yǎng)基上清，5000rpm,4°C，離心lOmin，離心后棄掉細(xì)胞保留上清，獲得病毒顆粒。在Vero細(xì)胞生長豐度為90%時，更換不含血清以及雙抗的DMEM培養(yǎng)基，分別將重組腺病毒FGAd-Fsyn和重組腺病毒FGAd-Msyn按照適當(dāng)比例混合感染Vero細(xì)胞，48~72小時收集培養(yǎng)基上清，5000rpm，4°C，離心lOmin，離心后棄掉細(xì)胞保留上清，獲得病毒顆粒。在Vero細(xì)胞生長豐度為90%時，更換不含血清以及雙抗的DMEM培養(yǎng)基，分別將重組腺病毒FGAd-Gsyn和重組腺病毒FGAd-Msyn按照適當(dāng)比例混合感染Vero細(xì)胞， 48~72小時收集培養(yǎng)基上清，5000rpm，4°C，離心lOmin，離心后棄掉細(xì)胞保留上清，獲得病毒顆粒。在Vero細(xì)胞生長豐度為90%時，更換不含血清以及雙抗的DMEM培養(yǎng)基，分別將重組腺病毒FGAd-Fsyn、重組腺病毒FGAd-Gsyn和重組腺病毒FGAd-Msyn按照適當(dāng)比例混合感染Vero細(xì)胞,48~72小時收集培養(yǎng)基上清,5000rpm, 4°C,離心lOmin,離心后棄掉細(xì)胞保留上清，獲得病毒樣顆粒。
[0107]實施例6:采用蔗糖密度滴度離心進(jìn)行病毒樣顆粒的純化，并電鏡觀察
[0108]1.病毒樣顆粒的純化:
[0109]將實施例5中獲得的含病毒樣顆粒的上清轉(zhuǎn)移至SW28轉(zhuǎn)子中，22000rpm，12h，4°C離心；棄掉上清，用預(yù)冷的 NTE (25mM Tris-HCl, pH7.4, 150mM NaCl，0.1M MgSO4,0.01MEDTA)約5ml將沉淀重懸，此時分別加入60%、50%、30%蔗糖墊層于SW40轉(zhuǎn)子中，最上層加入重懸的沉淀，35000rpm, 2.5h,4°C離心；離心收集目的條帶位置的蛋白帶于SW40轉(zhuǎn)子中，此時再分別加入60%、50%、40%、30%。20%蔗糖墊層，最后加入蛋白條帶，35000rpm，18h，4°C離心；離心完畢按每0.5ml體積收集樣品稱重計算密度，將密度接近的樣品收集于SW55轉(zhuǎn)子中，再加入預(yù)冷的NTE混勻，22000rpm，2.5h，4°C離心。離心后棄掉上清，用適量預(yù)冷的NTE重懸沉淀，分裝，用于Western blot鑒定，鑒定結(jié)果見圖10。其中，離心過程中收集的條帶見圖11。
[0110]2.透射電鏡樣品的制備:
[0111]取適量的待檢測樣品，將銅網(wǎng)放置于樣品上Imin后用濾紙吸干多余的樣品，之后再將銅網(wǎng)放置于磷鎢酸(PH6.8)上lmin，吸干多余的液體，放入透射電鏡中進(jìn)行觀察，見圖12、圖13，表明成功制備病毒樣顆粒。[0112]實施例7:動物免疫
[0113]本發(fā)明采用的實驗動物為:雌性BALB/c小鼠，6~8周齡(購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，飼養(yǎng)于清華大學(xué)醫(yī)學(xué)測試中心實驗動物平臺P2動物實驗室。
[0114]1.采取隨機(jī)編號，5只一組，其中RSV VLPs實驗組，采用滴鼻免疫方式給予VLPsdOiigASiU/只；陽性對照組為RSV，同樣采用滴鼻免疫方式給予RSV病毒，5 X 106pfu/25 u I/只；陰性對照組，采用滴鼻免疫方式給予NTE，25 U I/只。
[0115]2.于初次免疫后兩周內(nèi)眥靜脈采血，為檢測血清中特異性IgG效價。
[0116]3.ELISA方法檢測RSV特異性抗體的效價，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，方法如下:
[0117]a.將純化的RSV作為包被抗原，按1:4000稀釋度包被，4°C過夜；
[0118]b.將包被液甩干，PBST洗96孔板，3min/次，洗三次；
[0119]c.用10%胎牛血清(PBS配制)進(jìn)行封閉，37°C，I小時。
[0120]d.將基礎(chǔ)血清、初免后血清用抗體稀釋液(5%胎牛血清)按倍比稀釋的方法進(jìn)行稀釋，加到96孔板中，37°C，1小時。
[0121]e.一小時后，用PBST洗96孔板，3min/次，洗三次。
[0122]f.將HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG按1:5000的比例進(jìn)行稀釋，加到96孔板中，37°C，I小時
[0123]g.一小時后，用PBST洗96孔板，3min/次，洗六次。
[0124]h.加顯色液，暗處37°C顯色約15min。
`[0125]1.加入2M H2SO4終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀中讀取0D450值。
[0126]數(shù)據(jù)分析結(jié)果見圖14，動物實驗表明，在初次免疫后第2周進(jìn)行血清抗體滴度的檢測，實驗組即免疫VLPs組與陽性對照組即免疫RSV組沒有顯著差異，而這兩組的結(jié)果與陰性對照組即免疫NTE組有顯著性差異，說明實驗組可產(chǎn)生與陽性對照組相同的免疫效果。同樣的，在初次免疫后第6周進(jìn)行血清抗體滴度的檢測，實驗組即免疫VLPs組與陽性對照組即免疫RSV組沒有顯著差異，而這兩組的結(jié)果與陰性對照組即免疫NTE組有顯著性差異，進(jìn)一步說明實驗組可產(chǎn)生與陽性對照組相同的免疫效果。
【權(quán)利要求】
1.一種呼吸道合胞病毒樣顆粒，其特征在于，包含呼吸道合胞病毒M蛋白，所述M蛋白由密碼子優(yōu)化的M基因進(jìn)行編碼。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種呼吸道合胞病毒樣顆粒，其特征在于，還可包含呼吸道合胞病毒F蛋白或呼吸道合胞病毒G蛋白或其組合，所述F蛋白和G蛋白分別由密碼子優(yōu)化的F基因和G基因進(jìn)行編碼。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種呼吸道合胞病毒樣顆粒，其特征在于，所述密碼子優(yōu)化的M基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種呼吸道合胞病毒樣顆粒，其特征在于，所述密碼子優(yōu)化的F基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示，密碼子優(yōu)化的G基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.3所示。
5.一種呼吸道合胞病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，利用重組腺病毒制備呼吸道合胞病毒病毒樣顆粒，該方法同樣適于其他病毒的病毒樣顆粒制備，其步驟包括: (1)按照哺乳動物細(xì)胞密碼子偏性，對M、F和G基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，分別命名Msyn、Fsyn > Gsyn ； (2)將Msyn、Fsyn>Gsyn分別克隆到穿梭載體中,得到重組穿梭質(zhì)粒,將重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有腺病毒骨架質(zhì)粒PAdEasy-1的RecA+E.coli BJ5183/p的感受態(tài)細(xì)胞，篩選鑒定，獲得重組腺病毒質(zhì)粒 pAdeasy-Msyn, pAdeasy-Fsyn, pAdeasy-Gsyn ； (3)將pAdeasy-Msyn, pAdeasy-Fsyn, pAdeasy-Gsyn 分別轉(zhuǎn)染 293 細(xì)胞,獲得重組腺病毒 FGAd-Msyn, FGAd-Fsyn、FGAd-Gsyn ； (4)將FGAd-Msyn單獨感染Vero細(xì)胞，或者將FGAd-Msyn與FGAd-Fsyn和/或FGAd-Gsyn感染Vero細(xì)胞，獲得含有病毒樣顆粒的上清液； (5 )蔗糖密度梯度離心進(jìn)行純化，獲得純化后的病毒樣顆粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種呼吸道合胞病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，步驟(5)中蔗糖密度梯度離心的步驟為: (1)將上清液離心； (2)棄掉上清，將沉淀重懸，分別加入60%、50%、30%蔗糖墊層，離心； (3)收集目的條帶位置的蛋白帶，再分別加入60%、50%、40%、30%、20%蔗糖墊層，離心； (4)收集密度接近的樣品，加入預(yù)冷的NTE混勻，離心； (5)棄掉上清，用預(yù)冷的NTE重懸沉淀，分裝。
7.包含權(quán)利要求1-4任一所述呼吸道合胞病毒樣顆粒的疫苗，所述疫苗優(yōu)選為注射劑、口服劑、滴鼻劑、噴霧劑或透皮劑形式。
8.權(quán)利要求1-4任一所述呼吸道合胞病毒樣顆粒在制備用于預(yù)防呼吸道合胞病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1-4任一所述呼吸道合胞病毒樣顆粒用于制備呼吸道合胞病毒抗體。
10.權(quán)利要求1-4任一所述呼吸道合胞病毒樣顆粒用于制備呼吸道合胞病毒的診斷試劑。
【文檔編號】A61P31/14GK103642761SQ201310667523
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】何金生, 付遠(yuǎn)輝, 焦月盈, 洪濤 申請人:北京交通大學(xué)