一種雙姜胃痛片的制備方法及其在制備抑制小鼠前列腺癌細(xì)胞rm-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種雙姜胃痛片的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的雙姜胃痛片的制備方法，由姜黃200g、紫色姜200g、地不容200g、石菖蒲200g、苦菜子200g作為原料藥制成，采用微波萃取和大孔樹(shù)脂吸附制備而成，使得姜黃素含量有很大提高。本發(fā)明還提供了雙姜胃痛片在制備抑制小鼠前列腺癌細(xì)胞RM-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種雙姜胃痛片的制備方法及其在制備抑制小鼠前列腺癌細(xì)胞RM-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種雙姜胃痛片的制備方法及其在制備抑制小鼠前列腺癌細(xì)胞RM-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]雙姜胃痛丸標(biāo)準(zhǔn)號(hào)WS-11105 (ZD-1105)_2002，記載于國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科脾胃分冊(cè)。由姜黃200g、紫色姜200g、地不容200g、石菖蒲200g、苦菜子200g作為原料藥制成，具有理氣止痛，和胃降逆的功效。用于中焦氣滯所致胃脘痞滿脹痛，噯氣吞酸，慢性淺表性胃炎見(jiàn)上述證候者。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有雙姜胃痛片在提取制備方面采用微波技術(shù)和大孔樹(shù)脂吸附技術(shù)提取的報(bào)道，而中藥直接打粉提取，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過(guò)大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種雙姜胃痛片的制備方法。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種雙姜胃痛片在制備抑制小鼠前列腺癌細(xì)胞RM-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)如下的方案實(shí)現(xiàn)的:`[0007]一種雙姜胃痛片的制備方法，由姜黃200g、紫色姜200g、地不容200g、石菖蒲200g、苦菜子200g作為原料藥制成，其特征在于，所述的制備方法由下列步驟組成:取上五味藥材，粉碎，加入5L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹(shù)脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.3g。
[0008]上述的雙姜胃痛片的制備方法中，所述微波萃取功率為700W。
[0009]上述的雙姜胃痛片的制備方法中，所述微波萃取每次萃取時(shí)間為8分鐘。
[0010]上述的雙姜胃痛片在制備抑制小鼠前列腺癌細(xì)胞RM-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0011]現(xiàn)有技術(shù)中，雙姜胃痛丸口服，一次1.5~3g，一日3次。雙姜胃痛丸服藥量大。采用本發(fā)明方法制備成的雙姜胃痛片每片重0.3g，每次僅需1-2片，一日服用3次。在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過(guò)下述試驗(yàn)證明。
[0012]試驗(yàn)一、不同方法制備的雙姜胃痛片中姜黃素含量的比較
[0013]1、儀器及試藥本發(fā)明雙姜胃痛片:按實(shí)施例1方法制備，使用1000g原料藥，經(jīng)提取制成500片，每片重0.3g。原雙姜胃痛丸，按照WS-11105 (ZD-1105)-2002標(biāo)準(zhǔn)方法制備，作為對(duì)照。可見(jiàn)-紫外光微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)MD公司型號(hào):SPECTRAMAX190); ；AE240電子分析天平；姜黃素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。[0014]2、方法
[0015]取本品，研細(xì)，取樣(原雙姜胃痛丸取3g樣品，本發(fā)明的雙姜胃痛片取0.9g)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入無(wú)水乙醇20ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率33kHz) 30分鐘，放冷，再稱定重量，用無(wú)水乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。另取姜黃素對(duì)照品適量，精密稱定，加無(wú)水乙醇制成每Iml含0.12mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，精密吸取供試品溶液2 μ 1、對(duì)照品溶液I μ I與2 μ 1，分別交叉點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-甲酸-冰醋酸(30: 3: I)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，照薄層色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VI B薄層掃描法)進(jìn)行掃描，波長(zhǎng):λ s=425nm, λ R=560nm，測(cè)量供試品吸收度積分值與對(duì)照品吸收度積分值，計(jì)算，即得。
[0016]3、結(jié)果
[0017]結(jié)果表明，本發(fā)明雙姜胃痛片中姜黃素的含量為3_6mg/片；而原雙姜胃痛丸中姜黃素的含量為0.35mg/g，每片姜黃素含量相當(dāng)于原丸劑每g含量的9-18倍，在服用量減少的情況下，姜黃素含量有很大提高。
[0018]上述研究表明，采用本發(fā)明制備方法制備的雙姜胃痛片，有效成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于WS-11105 (ZD-1105) -2002標(biāo)準(zhǔn)記載的方法制備的雙姜胃痛丸。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說(shuō)明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0020]實(shí)施例1
[0021]取姜黃200g、紫色姜200g、地不容200g、石菖蒲200g、苦菜子200g，將五味藥材，粉碎，加入5L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹(shù)脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將微波提取物混合加入淀粉,70%乙醇制顆粒, 干燥,壓片，制成500片，每片重0.3g。
[0022]經(jīng)檢測(cè)，成品中姜黃素的含量為5.92mg/片。
[0023]實(shí)施例2
[0024]取姜黃200g、紫色姜200g、地不容200g、石菖蒲200g、苦菜子200g，將五味藥材，粉碎，加入5L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次5分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹(shù)脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒,干燥,壓片，制成500片，每片重0.3g。
[0025]經(jīng)檢測(cè)，成品中姜黃素的含量為3.66mg/片。
[0026]實(shí)施例3
[0027]取姜黃200g、紫色姜200g、地不容200g、石菖蒲200g、苦菜子200g，將五味藥材，粉碎，加入5L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹(shù)脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重
0.3g0
[0028]經(jīng)檢測(cè)，成品中姜黃素的含量為4.58mg/片。
[0029]實(shí)施例4:雙姜胃痛片抑制小鼠前列腺癌細(xì)胞RM-1細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究資料
[0030]1.實(shí)驗(yàn)材料
[0031]1.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株
[0032]小鼠前列腺癌細(xì)胞RM-1細(xì)胞，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0033]1.2實(shí)驗(yàn)藥物
[0034]研究藥物:本發(fā)明雙姜胃痛片:按實(shí)施例1方法制備。
[0035]藥液儲(chǔ)液:稱取IOOmg雙姜胃痛片，溶于5ml無(wú)水乙醇中，0.2 μ m濾器過(guò)濾，500 μ Idoff管分裝，-20°C存儲(chǔ)，同時(shí)0.2 μ m濾器過(guò)濾無(wú)水乙醇以備對(duì)照組之用。
[0036]1.3實(shí)驗(yàn)試劑
[0037]DMEM(GIBC0 公司 Cat.N0.12100_061Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ;NaHC03(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat.N0.11810_033Lot.N0.1088387) ；Trypsin (AMRESCO 公司);EDTA (AMRESCO 公司);Penicillin G Sodium Salt(AMRESCO公司I) !Streptomycin Sulfate (AMRESCO);無(wú)水乙醇(溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限公司)；MTT (Biosharp 批號(hào):0793) =PBS (實(shí)驗(yàn)室自配)；
[0038]1.4實(shí)驗(yàn)器材
[0039]萊卡倒置顯微鏡(德國(guó)Leica型號(hào):DMIL);可見(jiàn)-紫外光微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)MD公司型號(hào):SPECTRAMAX190);C02培養(yǎng)箱(F0RMA型號(hào):3111);超凈臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型號(hào)=SW-CJ-ZFD);純水儀(美國(guó)Spring公司型號(hào):S/N020579);精密移液器(法國(guó)吉爾森公司型號(hào):P2);電子天平(德國(guó)賽多利斯有限公司型號(hào):BT323S);全自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號(hào):MLS-3020);臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號(hào):DHG9123A);冰箱(西門(mén)子公司型號(hào):KG18V21TI);液氮罐(CBS型號(hào):2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠型號(hào):ΚΑ-1000);0.2μπι 濾器(MILLIP0RE 型號(hào):SLGP033RB);lcm 培養(yǎng)皿(NEST 公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0040]2.實(shí)驗(yàn)方法
[0041 ] I) RM-1細(xì)胞用DMEM+10%FBS于37 °C、5%C02進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(IOcm培養(yǎng)皿)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0.25%胰蛋白酶-0.049ffiDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，1000rpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3X IO4個(gè)/ml。
[0042]2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180 μ 1，培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37°C，5%C02)常規(guī)培養(yǎng)。
[0043]3)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般長(zhǎng)至70%_70%，加入雙姜胃痛片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0044]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0045]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔如入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。
[0046]6)同時(shí)設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。
[0047]7)結(jié)果以藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率表示:細(xì)胞增值抑制率(%)=(對(duì)照孔OD值-給藥孔OD值)、對(duì)照孔OD值X 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0048]3.統(tǒng)計(jì)處理
[0049]采用Microsoft Excel2007軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以mean+ S.D.表不。
[0050]4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0051]MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時(shí)，對(duì)RM-1細(xì)胞增殖抑制有差異(p〈0.05)，劑量在10mg/ml時(shí)該差異具有顯著性(P〈0.01)，當(dāng)劑量達(dá)到15-20mg/ml時(shí)有極顯著性差異(P〈0.001)。
[0052]表1雙姜胃痛片對(duì)RM-1細(xì)胞增殖抑制影響研究(X土 SD)
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一種雙姜胃痛片的制備方法，由姜黃200g、紫色姜200g、地不容200g、石菖蒲200g、苦菜子200g作為原料藥制成，其特征在于，所述的制備方法由下列步驟組成:取上五味藥材，粉碎，加入5L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹(shù)脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.3g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙姜胃痛片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取功率為700W。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙姜胃痛片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取每次萃取時(shí)間為8分鐘。
4.權(quán)利要求1所述的雙姜胃痛片在制備抑制小鼠前列腺癌細(xì)胞RM-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。`
【文檔編號(hào)】A61P1/14GK103768560SQ201310658935
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】孫波 申請(qǐng)人:濟(jì)南新起點(diǎn)醫(yī)藥科技有限公司