一種分泌表達屋塵螨過敏原Derp2的重組乳酸乳球菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過對屋塵螨（Dermatophagoides?pteronyssinus）的主要過敏原Derp2的基因進行密碼子優(yōu)化得到優(yōu)化后的基因mderp2，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建分泌表達過敏原Derp2的重組表達質(zhì)粒pNZ8148-SD和重組乳酸乳球菌L.lactisSD（保藏號為CGMCC?No.8223）。Western?blot結(jié)果表明本發(fā)明的重組乳酸乳球菌L.lactis?SD可實現(xiàn)過敏原Derp2的分泌表達；同時，動物實驗結(jié)果顯示口服重組乳酸乳球菌L.lactis?SD可增加小鼠脾臟內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞的水平，降低小鼠體內(nèi)由塵螨過敏原Derp2引發(fā)的過敏反應(yīng)，具有較好的預(yù)防作用。
【專利說明】一種分泌表達屋塵螨過敏原DerP2的重組乳酸乳球菌及其應(yīng)用
【背景技術(shù)】
[0001]過敏性疾病是臨床上的常見病、多發(fā)病，是當(dāng)前世界性的重大衛(wèi)生學(xué)問題。其中，在引發(fā)過敏性疾病的眾多吸入性過敏原中，塵螨是導(dǎo)致呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病的重要因素之一。塵螨是一類結(jié)構(gòu)和成分復(fù)雜的生物，目前人們已從塵螨的數(shù)百種蛋白中初步鑒定出幾十種過敏原；過敏原Derp2是其中最為主要的過敏原之一，約80%_90%的塵螨過敏患者對Derp2產(chǎn)生過敏反應(yīng)。特異性免疫治療(SIT)被認為是最有效的治療過敏的方法，但成功的免疫治療取決于高質(zhì)量的變應(yīng)原。目前，臨床上用于診斷和治療的塵螨粗提液含有大量非特異性雜質(zhì)，嚴重阻礙了塵螨過敏原試劑的臨床應(yīng)用。為獲得高質(zhì)量的變應(yīng)原，從天然產(chǎn)物中分離純化過敏原(專利申請?zhí)?200410022961.9)，操作繁復(fù)且純度不高，重復(fù)性較差；利用分子生物學(xué)技術(shù)，在大腸桿菌(專利申請?zhí)?201210139240.0)、酵母等表達系統(tǒng)中表達過敏原Derp2被認為是一種可行的策略，但其安全性及后續(xù)過敏原的純化限制了這些表達系統(tǒng)的實際應(yīng)用。
[0002]近幾年，隨著對乳酸菌性質(zhì)的不斷研究，其益生特性逐漸被人們所認識并接受，特別是在治療一些慢性疾病和自身免疫性疾病，如過敏，腸炎等，具有普通藥物所不具備的優(yōu)勢。以乳酸菌作為表達系統(tǒng)，使抗原或其他功能性蛋白在粘膜表面進行表達釋放，可以有效的避免傳統(tǒng)表達系統(tǒng)(大腸桿菌)所帶來的安全隱患及后續(xù)抗原的純化問題，同時避免了在口服過程中蛋白的降解和口服耐受，更能促進抗原或功能性蛋白被免疫系統(tǒng)所吸收等。
[0003]外源蛋白在乳酸菌 中的表達方式有三種，其中在信號肽作用下將目的蛋白分泌到培養(yǎng)基中是最為主要的一種方式。多項實驗結(jié)果表明乳酸菌以分泌表達的形式在腸道粘膜表面表達功能性蛋白分子(如IL-10，IL-12)可以起到非常明顯的治療效果。此外，抗原蛋白(如花粉、人乳頭狀瘤病毒等)在乳酸菌內(nèi)的分泌表達可以起到明顯的預(yù)防疾病發(fā)生的作用。本實驗為使塵螨過敏原Derp2在乳酸乳球菌內(nèi)高效表達并發(fā)揮較好的預(yù)防效果，我們對Derp2的天然基因進行了密碼子優(yōu)化，并構(gòu)建了分泌表達過敏原Derp2重組乳酸乳球菌L.1actis SD ;同時通過動物實驗對其預(yù)防塵螨過敏疾病的效果進行了研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種基因優(yōu)化的屋塵螨過敏原Derp2，提供一種分泌表達基因優(yōu)化后的塵螨過敏原Derp2的重組乳酸乳球菌L.1actis SD (保藏號為CGMCCN0.8223)，提供將所述過敏原用于預(yù)防屋塵螨過敏疾病的用途，提供將所述重組乳酸乳球菌用于預(yù)防塵螨過敏疾病的用途。
[0005]一方面，本發(fā)明提供了一種基因優(yōu)化的屋塵螨過敏原Derp2，該過敏原基因mderp2 的序列為 SEQ ID N0.1。
[0006]所述的基因優(yōu)化的屋塵螨過敏原Derp2基因是通過對來源于屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的主要過敏原 Derp2 的天然基因序列 SEQ ID N0.2 進行基因優(yōu)化后獲得的。[0007]另一方面，本發(fā)明提供了一種分泌表達基因優(yōu)化的屋塵螨過敏原Derp2的重組乳酸乳球菌L.1actis SD(保藏號為CGMCC N0.8223)，所述菌株是通過將優(yōu)化后的基因mderp2克隆到乳酸乳球菌的表達質(zhì)粒PNZ8148上，構(gòu)建分泌表達型質(zhì)粒pNZ8148-SD，再將獲得的分泌表達型質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入宿主菌株L.1actis NZ9000而獲得的。
[0008]另一方面，本發(fā)明提供了將所述過敏原用于預(yù)防屋塵螨過敏疾病的用途。
[0009]再一方面，本發(fā)明提供了將上述菌株用于預(yù)防塵螨過敏疾病的用途。
[0010]本發(fā)明涉及的一種分泌表達基因優(yōu)化的屋塵螨過敏原Derp2的重組乳酸乳球菌L.1actis SD，于2013年9月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCCN0.8223。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1表示屋塵螨過敏原Derp2基因突變位點對照圖。
[0012]圖2表示重組乳酸乳球菌中Derp2蛋白的Western blot檢測。
[0013]如圖:最左側(cè)為蛋白分子Marker ;I號泳道:純化的Derp2,用作陽性對照；2號泳道:重組菌株L.1actis SD培養(yǎng)液上清；3號泳道和4號泳道:分別是對照菌株L.1actis8148 (不含Derp2的基因序列)培養(yǎng)基上清和細胞破碎液
[0014]圖3表示小鼠免疫的過程。
[0015]首先進行小鼠塵螨過敏模型的構(gòu)建，具體的構(gòu)建過程分為三個階段:首先在0-4天及7-11天進行灌胃預(yù)防處理(200μ I菌體或生理鹽水);在第17、24、31天進行腹腔注射Derp2/Alum (Pierce,美國)(200 μ I)的混合物,使小鼠產(chǎn)生過敏反應(yīng)；最后一個階段為霧化階段，通過霧化激發(fā)器將Derp2蛋白進行霧化，使小鼠通過自然呼吸的方式吸入體內(nèi)。
[0016]圖4表示口服重組乳酸乳球菌對小鼠體內(nèi)過敏原特異性抗體的影響。
[0017]Positive:陽性對照組小鼠！Negative:陰性對照組小鼠；8148:灌胃對照菌株L.1actis8148 (不含Derp2基因)的小鼠；SD:灌胃重組菌株L.1actis SD的小鼠；ND:灌胃重組菌株L.1actis ND的小鼠
[0018]圖5-1表示肺部的組織形態(tài)觀察(HE染色)；
[0019]圖5-2表示肺部的組織形態(tài)觀察(甲苯胺藍染色)；
[0020]A:陽性對照組；B:陰性對照組;C:灌胃L.1actis8148 (空質(zhì)粒)的小鼠；D:灌胃重組菌株L.1actis SD的小鼠；
[0021]圖6表示不同組別的小鼠脾臟內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞的水平
[0022]A:陽性對照組小鼠；B:灌胃L.1actis ND菌株的小鼠；C:灌胃L.1actis SD菌株的小鼠；D:陰性對照組小鼠
[0023]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0024]目前，臨床使用的塵螨變應(yīng)原制劑多為通過對人工飼養(yǎng)的塵螨進行滅活處理后分離純化得到的混合物，其成分復(fù)雜，用于SIT治療存在著無法避免的副作用。本發(fā)明所用的乳酸菌疫苗因為乳酸菌的可食用性，不用經(jīng)過滅活及純化處理即可用于臨床使用。此外，乳酸菌作為一種常見的微生物，培養(yǎng)及后續(xù)操作過程簡單，成本較低，可以通過制成粉狀制劑、膠囊等形式的藥品，攜帶方便，無需特殊條件即可自行服用。相比傳統(tǒng)的皮下注射方式，乳酸菌疫苗的口服方式更易為病人所接受，同時通過口服方式更容易使機體產(chǎn)生免疫耐受，縮短治療時間。
實施例
[0025]下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做更詳細的說明。
[0026]1、根據(jù)乳酸乳球菌基因組數(shù)據(jù)，分析乳酸乳球菌的密碼子偏好性、GC含量等參數(shù)，將來源于屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的主要過敏原Derp2的天然基因序列該修飾性過敏原的基因序列為SEQIDN0.2 (genebank:AF276239.1)進行密碼子優(yōu)化，得到可以在乳酸乳球菌內(nèi)高效表達的基因mderp2，該基因的序列為SEQ ID N0.1 ；
[0027]2、將優(yōu)化后的基因mderp2克隆到乳酸乳球菌的表達質(zhì)粒pNZ8148 (中國科學(xué)院鐘瑾研究員惠贈)上，獲得分泌表達型質(zhì)粒PNZ8148-SD，并將表達質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入宿主菌株L.1actis NZ9000 (中國科學(xué)院鐘瑾研究員惠贈)中，得到重組菌株L.1actis SD，保藏號為SD CGMCC N0.8223。
[0028]3、用Western blot檢測重組乳酸乳球菌L.1actis SD中重組蛋白Derp2的表達，發(fā)現(xiàn)在重組乳酸乳球菌L.1actis SD的上清液中可成功檢測到Derp2的表達信號； [0029]4、動物實驗結(jié)果說明，相比口服生理鹽水和胞內(nèi)表達過敏原的重組乳酸乳球菌的對照小鼠，口服重組乳酸乳球菌L.1actis SD可通過增加脾臟內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞的水平，降低實驗小鼠體內(nèi)Derp2特異性的IgE的水平和肺部炎癥反應(yīng)，抑制過敏疾病的發(fā)生。技術(shù)細節(jié)
[0030]1、塵螨過敏原Derp2天然基因的優(yōu)化
[0031]參照塵螨過敏原Derp2天然基因序列SEQ ID N0.2 (GeneBank:AF276239.1)，基于乳酸乳球菌基因組的特點，根據(jù)GC含量、稀有密碼子使用情況等對其進行基因優(yōu)化，得到優(yōu)化后的基因序列mderp2 (SEQ ID N0.1 )，人工合成后克隆到質(zhì)粒pUC57 (生工生物工程(上海)有限公司)上，得到pUC57-mderp2質(zhì)粒。
[0032]塵螨過敏原Derp2基因優(yōu)化后的基因序列mderp2:SEQ ID N0.1。
[0033]塵螨過敏原Derp2的原始基因序列AF276239.1:SEQ ID N0.2。
[0034]塵螨過敏原Derp2的氨基酸序列:SEQ ID N0.3。
[0035]2、乳酸乳球菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建
[0036]以乳酸乳球菌NZ9000的基因組為模板，以SPusp45-F
[0037](cgaattcCATGGTGAAAAAAAAGATTATCTCAGC)和 SPusp45-R
[0038](ggKgtaccCAGCGTAAACACCTGACAAC)為引物，采用PCR的方法擴增信號肽基因SPusp45 (GeneBank:EU382094.1) (PCR 程序為:95 °C 30s, 57 °C 30s, 72 °C 30s, 30 個循環(huán)；PCR 反應(yīng)體系:5 μ I dNTPs (2mM)，5 μ I 10 XBuffer, I μ I TaqE,上下游引物各 I μ I,模板I μ 1)，以PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收目的片段，然后以內(nèi)切酶NcoI和KpnI在37°C條件下反應(yīng)3小時，再經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收得到目的片段-SPusp45 ;同時以人工合成的質(zhì)粒pUC57-mderp2 為模板，以 8N-F’
[0039](ggggtaccGATCAAGTTGATGTTAAAGATTGTGC)和 8N-R
[0040](gtctagaTTAATCACGAATTTTAGCATGAGTAG)為引物，以 PCR 的方法擴增目的基因mderp2,經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收目的片段，以內(nèi)切酶KpnI和XbaI在37°C條件下反應(yīng)3小時后，純化回收目的片段-mderp2 ;然后將_SPusp45、-mderp2片段與酶切處理的質(zhì)粒片段PNZ8148進行連接后得到表達質(zhì)粒pNZ8148-SD，電轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌NZ9000中，得到重組菌株L.1actis SD (保藏號為SD CGMCC N0.8223)。該菌株已于2013年9月18日交由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏。
[0041]3、重組菌株L.1actis SD上清中過敏原Derp2的檢測
[0042]重組乳酸乳球菌L.1actis SD活化后，按1:50接種于50ml GMl7培養(yǎng)基(1000ml培養(yǎng)基:胰蛋白胨5g,大豆蛋白胨5g,牛肉膏5g,酵母粉2.5g, β -磷酸甘油二鈉19g,維生素 C0.5g，lM MgSO4 1ml，葡萄糖 5g)中(含 10 μ g/ml 的氯霉素)，在 30°C培養(yǎng)至 OD6tltl=0.5，jjPA nisin (Sigma-Aldrich)至終濃度 10ng/ml,誘導(dǎo)培養(yǎng) 6 小時后；8000rpm 離心 5min,
收集上清液。
[0043]分泌蛋白樣品的處理:取1.7ml上清液加入2mlEP管中，然后加入300 μ I 100%三氯乙酸(100%TCA)混合均勻后，放在冰上2h，然后13000rpm離心IOmin ;加入Iml預(yù)冷的丙酮，將沉淀重懸并離心，重復(fù)兩次；然后室溫下晾干，加入100 μ I 50mMNa0H重懸,最后加入100 μ I 2x loading buffer(250mMTris-HCl, 10%(w/v) SDS, 50%(w/v)甘油，5%(w/v) β -疏基乙醇)，在沸水中煮IOmin ；
[0044]所有樣品取15 μ I上樣，經(jīng)5-12%SDS_PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore公司，美國)上，分別用Derp2特異性多克隆抗體(一抗)(京天成生物技術(shù)(北京)有限公司)及HRP標記的羊抗兔IgG抗體(二抗)(Thermo，美國)雜交后，加入eECL顯色液(北京康為世紀生物科技有限公司)避光顯色，檢測結(jié)果如圖2所示。
[0045]實驗結(jié)果及結(jié)論:1號泳道可以檢測蛋白信號(陽性對照)，分子量大小為17KDa左右；2號泳道可檢測到同I號泳道分子量大小相同的蛋白信號，同時在3，4號泳道檢測不到信號；結(jié)果說明過敏原Derp2蛋白可以在重組菌株L.1actis SD內(nèi)特異性表達。
[0046]4、動物實驗
[0047]參見圖3，進行小鼠塵螨過敏模型的構(gòu)建，具體的構(gòu)建過程分為三個階段:首先在0-4天及7-11天進行灌胃預(yù)防處理(200 μ I菌體或生理鹽水)；在第17、24、31天進行腹腔注射Derp2/Alum (Pierce，美國)(200 μ I)的混合物，使小鼠產(chǎn)生過敏反應(yīng)；最后一個階段為霧化階段，通過霧化激發(fā)器將Derp2蛋白進行霧化，使小鼠通過自然呼吸的方式吸入體內(nèi)。
[0048]小鼠灌胃乳酸乳球菌的制備:乳酸乳球菌活化后，按照1:50的比例接入GM17培養(yǎng)基中(加入10 μ g/ml氯霉素)進行培養(yǎng)，至OD=0.5左右，然后加入nisin至終濃度IOng/ml, 30°C培養(yǎng)6h后，8000rpm 5min離心收集菌體,用預(yù)冷的滅菌的生理鹽水洗漆2遍后,加入一定體積的生理鹽水，調(diào)整菌落數(shù)為lxl01(lCFU/ml，取200μ I進行小鼠灌胃。
[0049]實驗組的設(shè)計:
[0050]陽性模型組:灌胃生理鹽水，然后進行腹腔注射；
[0051]SD、ND、8148模型組:分別用重組菌株L.1actis SD,L.1actis ND和L.1actis8148(空質(zhì)粒)進行灌胃，并且進行腹腔注射處理；
[0052]陰性模型組:灌胃生理鹽水，腹腔注射生理鹽水。
[0053]5、過敏原Derp2特異性抗體的測定
[0054]在實驗結(jié)束處死小鼠時，取小鼠血液，然后室溫靜置2h，4000rpm離心lOmin，取上層血清，采用ELISA方法測定其中過敏原特異性抗體的濃度。
[0055]實驗結(jié)果:發(fā)現(xiàn)口服重組乳酸乳球菌L.1actis SD可明顯降低小鼠體內(nèi)Derp2特異性IgE的濃度(參見圖4A)，同時提高特異性IgG2a濃度(參見圖4B)；
[0056]實驗結(jié)果說明口服重組乳酸乳球菌L.1actis SD可通過調(diào)整細胞內(nèi)特異性抗體的濃度抑制過敏反應(yīng)。
[0057](I)包被:用包被緩沖液(1000ml 含 Na2CO3 1.59g ；NaHCO3 2.93g，ph 調(diào)至 9.6)將提取的Derp2蛋白稀釋到10μ g/ml，每孔加入100 μ I后4°C包被過夜。次日棄去孔內(nèi)液體，用PBST (1000ml 0.1M的PBS緩沖液中加入Iml Tween20)洗滌3次，每次3min。
[0058](2)封閉:酶標板加樣孔干燥后每孔加入100 μ I封閉液(Ig牛血清蛋白溶解到100ml的0.1M PBS緩沖液中)，37°C封閉2h，然后用同樣方法洗滌3次。
[0059](3)加樣:加100 μ I適度稀釋的小鼠血清于已包被的反應(yīng)孔中，分別設(shè)置空白對照和陰性對照(PBS對照組血清)，37°C保溫Ih后同樣方法洗滌。
[0060](4)加酶標二抗:每孔加入100 μ I新鮮稀釋的酶標二抗(IgE和IgG2a)(SouthernBiotech，美國)，37°C保溫lh，用PBST洗滌2次，最后用不含Tween-20的PBS洗漆一次。
[0061](5)加底物液顯色:向每孔中加入新鮮配置的TMB底物溶液(北京康為世紀生物科技有限公司)，每孔100 μ 1，室溫暗處靜置反應(yīng)15min。
[0062](6)終止反應(yīng)及檢測:向各反應(yīng)孔中加入2M H2SO4 50 μ 1，輕敲酶標板使其均勻混合以終止反應(yīng)，然后在15min內(nèi)將酶標板置于酶標儀(Thermo，美國)上，于450nm處讀取各孔的OD值。
[0063]6、肺部的組織切片
[0064]取新鮮的小鼠肺部，用生理鹽水沖洗掉多余的血液，然后放入10%的多聚甲醛中保存過夜，然后用大量的清水沖洗，將多聚甲醛沖洗干凈，然后用75%的乙醇保存，然后經(jīng)脫水、包埋及切片染色后，用光學(xué)顯微鏡觀察肺部的組織形態(tài)。
[0065]實驗結(jié)果:通過HE染色和甲苯胺藍染色，我們發(fā)現(xiàn)服用重組乳酸乳球菌L.1actisSD的實驗小鼠肺部內(nèi)的炎癥細胞和肥大細胞的數(shù)目要遠遠低于陽性對照組，參見圖5-1和5-2;
[0066]實驗結(jié)果說明口服重組乳酸乳球菌L.1actis SD可通過抑制炎癥細胞在炎癥部位的聚集抑制過敏反應(yīng)。
[0067]7、脾臟內(nèi)淋巴細胞種群的流式分析
[0068]取新鮮的小鼠脾臟，采用機械破碎(研磨)的方法獲得單細胞懸浮液，然后采用FITC標記的⑶4抗體和PE標記的Foxp3抗體進行染色(兩種抗體均來源于eBioscience公司)，具體的實驗操作方法為eBioscience推薦的最優(yōu)方法；細胞染色后用流式細胞儀(BDBioscience)進行細胞種群的分析,實驗結(jié)果如圖6所示。
[0069]實驗結(jié)果:通過對脾臟內(nèi)淋巴細胞的染色分析，發(fā)現(xiàn)口服重組乳酸乳球菌L.1actis SD可以明顯提高脾臟內(nèi)⑶4+FoXp3+細胞的水平；此外，相比胞內(nèi)表達過敏原的重組乳酸乳球菌L.1actis ND, L.1actis SD可以刺激機體產(chǎn)生更多的CD4+Foxp3+細胞。
[0070]實驗結(jié)果說明口服重組乳酸乳球菌L.1actis SD可以通過增加脾臟內(nèi)⑶4+Foxp3+細胞的數(shù)目，抑制過敏疾病的發(fā)生；此外，相比胞內(nèi)表達過敏原的重組菌株L.1actis ND，分泌表達過敏原的重組菌株L.1actis SD具有更好的保護作用。
[0071]結(jié)論:
[0072]動物實驗結(jié)果說明，口服本發(fā)明的重組乳酸乳球菌L.1actis SD可通過增加脾臟內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞的水平、降低小鼠血清中Derp2特異性IgE的水平及炎癥細胞在發(fā)炎部位的聚集的方式，降低實驗小鼠體內(nèi)的塵螨過敏反應(yīng)；同時相比胞內(nèi)表達過敏原的重組菌株，分泌表達過敏原的重組菌株 L.1actis SD具有更好的效果。
【權(quán)利要求】
1.一種基因優(yōu)化的屋塵螨過敏原Derp2，該過敏原基因mderp2的序列為SEQ ID N0.1。
2.如權(quán)利要求1所述的基因優(yōu)化的屋塵螨過敏原Derp2，其特征在于所述過敏原基因是通過對來源于屋塵螨(Dermatophago1des pteronyss1nus)的主要過敏原Derp2的天然基因序列SEQ ID N0.2進行基因優(yōu)化后獲得的。
3.一種分泌表達基因優(yōu)化的屋塵螨過敏原Derp2的重組乳酸乳球菌L.1act1sSD,于2013年9月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.8223。
4.如權(quán)利要求3所述的分泌表達基因優(yōu)化的屋塵螨過敏原Derp2的重組乳酸乳球菌L.1actis SD，其特征在于所述菌株是通過將優(yōu)化后的過敏原基因mderp2克隆到乳酸乳球菌的表達質(zhì)粒PNZ8148上，構(gòu)建分泌表達型質(zhì)粒pNZ8148-SD，再將獲得的分泌表達型質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入宿主菌株L.1actis NZ9000而獲得的。
5.將權(quán)利要求1或2中任意一項所述的過敏原用于預(yù)防屋塵螨過敏疾病的用途。
6.將權(quán)利要求3或4中任意一項所述的乳酸乳球菌用于預(yù)防屋塵螨過敏疾病的用途。
【文檔編號】A61K39/35GK103642815SQ201310646556
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】陳衛(wèi), 張秋香, 艾春青, 王剛, 田豐偉, 劉小鳴, 趙國忠, 趙建新, 張灝, 郭敏 申請人:江南大學(xué)