用于刺激哺乳動(dòng)物對(duì)病原體的先天免疫抵抗力的組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于刺激哺乳動(dòng)物對(duì)病原體的先天免疫抵抗力的組合物，其涉及微生物學(xué)、免疫學(xué)和抗微生物藥物治療學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明的組合物和方法涉及使用小分子組合物調(diào)節(jié)個(gè)體肺中的先天免疫，以用于治療或減輕微生物感染或侵入。具體而言，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及在患有微生物感染或有發(fā)生這種感染之風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中治療、抑制或減輕微生物感染的方法，其包括向所述個(gè)體施用有效量的TLR9和TLR2/6激動(dòng)劑的步驟。
【專利說明】用于刺激晡乳動(dòng)物對(duì)病原體的先天免疫抵抗力的組合物
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01080022634.7、發(fā)明名稱為“用于刺激哺乳動(dòng)物對(duì)病原體的先天免疫抵抗力的組合物”的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，該母案申請(qǐng)是2010年3月25日提交的PCT申請(qǐng)PCT / US2010 / 028658進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的申請(qǐng)。
[0002]發(fā)明背景
1.發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明一般地涉及微生物學(xué)、免疫學(xué)和抗微生物藥物治療學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明的組合物和方法涉及使用小分子組合物調(diào)節(jié)個(gè)體肺中的先天免疫，以用于治療或減輕微生物感染或侵入。
[0004]I1.發(fā)明背景
[0005]肺對(duì)感染的易感性來自于空氣交換的結(jié)構(gòu)要求。為了支持換氣，人持續(xù)地將IOOm2肺表面積暴露于外界環(huán)境。肺不僅暴露于空氣，還暴露于其中所懸浮的顆粒、小液滴和病原體中。與包裹在不通透皮膚中的皮膚表面或具有厚吸附粘液層的胃腸道不同，肺呈現(xiàn)出具有極小屏障防御的大環(huán)境界面。無妨礙氣體擴(kuò)散的需求將更大的屏障排除在外。
[0006]盡管其結(jié)構(gòu)脆弱，但肺一般能通過多種機(jī)械、體液和細(xì)胞機(jī)制成功地防御感染(Knowles 等，2002 ;Martin 和 Frevert, 2005 ;Rogan,等，2006 ;Travis,等，2001)；(Mizgerd, 2008 ;Bals 和 Hiemstra, 2004 ;Bartlett 等，2008 ；Hiemstra, 2007 ；Hippenstiel等，2006 ;Schutte和McCray，2002)。大多數(shù)被吸入的微生物病原體由于嵌入到氣道壁中而不能穿透至肺泡，它們由于粘液而滯留在氣道壁，然后通過粘液纖毛升降機(jī)系統(tǒng)(mucociliary escala`tor system)排出(Knowles 等，2002)。對(duì)于逃脫該命運(yùn)的那些病原體，氣道內(nèi)壁流體中抗微生物肽的組成型存在限制了它們的生長(zhǎng)(Rogan，等，2006;Travis，等，2001)。位于空氣腔最遠(yuǎn)端的肺泡巨噬細(xì)胞能夠攝取這些生物體，由此清理肺以防止可能的感染。
[0007]盡管經(jīng)常被認(rèn)為是被動(dòng)氣體交換的屏障，但氣道和肺泡上皮在遇到病原體刺激時(shí)通過發(fā)生重大的局部結(jié)構(gòu)和功能改變而為基礎(chǔ)肺部防御提供補(bǔ)充。應(yīng)答于病毒、真菌或變應(yīng)性炎癥，氣道分泌細(xì)胞迅速提高其高度并在其頂端細(xì)胞質(zhì)中充入分泌性顆粒，該過程稱為炎性化生(inflammatory metaplasia) (Evans 等，2004 ;Williams 等，2006)。在病原體存在下，肺泡上皮激活其質(zhì)膜系統(tǒng)和分泌機(jī)器，由此使白細(xì)胞參與肺部保護(hù)(Evans等，2005)?？赡茏钪匾氖牵c呼吸道上皮模式識(shí)別受體的微生物相互作用使得許多微生物產(chǎn)物表達(dá)在氣道內(nèi)壁流體中，包括防御素、cathelicidins、溶菌酶和活性氧簇(Rogan等，2006 ；Forteza 等，2005 ；Akinbi 等,2000 ；Bals 和 Hiemstra, 2004 ；Bals 和 Hiemstra,2006)。應(yīng)注意的是，肺炎(細(xì)菌性的或病毒性的)是全世界范圍內(nèi)的感染致死的首要原因。
[0008]存在對(duì)抑制和/或治療微生物感染的其他方法和組合物的需要。
[0009]發(fā)明概述
[0010]本發(fā)明提供刺激先天抵抗力(受激先天抵抗力(Stimulated Innate Resistance,StIR))的組合物和使用此類組合物刺激StIR的方法。在某些實(shí)施方案中，StIR是肺的StIR0本發(fā)明的一方面提供更高的治療/毒性比值或指數(shù)。本發(fā)明的一些實(shí)施方案包括用于增強(qiáng)哺乳動(dòng)物(例如人)受試者對(duì)感染的生物防御(例如受試者對(duì)感染的免疫力)的組合物、制劑和方法。在某些方面，本發(fā)明的組合物以有效量沉積在個(gè)體的肺中。本發(fā)明的一些方面提供針對(duì)微生物感染快速且暫時(shí)性的生物防御增強(qiáng)或放大。受試者免疫力的增強(qiáng)減輕了微生物感染。減輕可以是通過對(duì)感染或微生物生長(zhǎng)或存活的抑制、治療或預(yù)防來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的一些方面增強(qiáng)了受試者肺和呼吸道的防御。
[0011]在某些方面，考慮在患有微生物感染或具有發(fā)生該感染之風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中治療、抑制或減輕微生物感染的方法，所述方法包括施用有效量的StIR組合物，所述組合物包含一種或多種先天性受體(innate receptor)的一種或多種配體。已經(jīng)鑒定了許多先天性受體，其包括但不限于Toll樣受體(TLR)、C型凝集素受體(CLR)和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(Nod樣受體或NLR)。TLR是在先天免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的一類蛋白質(zhì)。它們是單次跨膜的非催化性受體，其識(shí)別來自微生物的結(jié)構(gòu)上保守的分子。一旦這些微生物存在于皮膚或腸道、肺和泌尿生殖道粘膜上或存在于其中，它們即被TLR識(shí)別，激活免疫細(xì)胞應(yīng)答。有趣的是，當(dāng)單獨(dú)施用時(shí)，許多這些TLR激動(dòng)劑不誘導(dǎo)顯著的StIR。通常，使用本文所述方法治療的個(gè)體或受試者已經(jīng)接觸病原性微生物或具有這種接觸的風(fēng)險(xiǎn)。
[0012]某些實(shí)施方案涉及能夠向呼吸道施用的組合物，以及使用這些組合物的方法，所述組合物包含1、2、3、4種或更多種TLR激動(dòng)劑。所述TLR激動(dòng)劑選自TLR2 / UTLR2 / 6、TLR3、TLR4、TLR5、TLR9或TLR7激動(dòng)劑。在某些方面，所述TLR激動(dòng)劑選自TLR9和TLR2 /6激動(dòng)劑。在另一方面，所述TLR激動(dòng)劑選自TLR5激動(dòng)劑。在又一方面，TLR5激動(dòng)劑可與TLR2 / 6、TLR4、TLR9或TLR7激動(dòng)劑組合使用。在某些方面，TLR9激動(dòng)劑可與TLR2 / 6、TLR4、TLR5或TLR7組合使用。在另一方面，TLR2 / 6激動(dòng)劑可與TLR4、TLR5、TLR9或TLR7激動(dòng)劑組合使用。在某些方面，TLR4激動(dòng)劑可與TLR2 / 6、TLR5、TLR9或TLR7激動(dòng)劑組合使用。在另一方面，TLR7激動(dòng)劑可與TLR2 / 6、TLR4、TLR5或TLR9激動(dòng)劑組合使用。在又一方面，任何這些兩兩組合可包括選自TLR2 / 6、TLR4、TLR5、TLR9或TLR7激動(dòng)劑的第三種或第四種或第五種TLR激動(dòng)劑。
[0013]某些實(shí)施方案涉及治療、抑制或減輕微生物感染的方法，其包括向患有微生物感染或者有發(fā)生或獲得微生物感染之風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體施用有效量的TLR9激動(dòng)劑和TLR2 / 6激動(dòng)劑。在某些方面，所述TLR2 / 6激動(dòng)劑是PAM2CSK4。在另一方面，所述TLR9激動(dòng)劑是C型寡聚脫氧核苷酸(oligodeoxynucleotide, 0DN)。C型ODN可包括但不限于0DN2395或0DNM362或0DN10101或另一 C型ODN或其類似物。在某些方面，受試者已經(jīng)接觸病原性微生物或有接觸病原性微生物的風(fēng)險(xiǎn)。所述微生物可以是病毒、細(xì)菌或真菌。
[0014]在另一些方面，以噴霧制劑施用所述TLR9激動(dòng)劑和TLR2 / 6激動(dòng)劑。以約0.1、l、5、10、50ii g或mg / kg至約5、10、50、100ii g或mg / kg個(gè)體體重(包括其間的所有數(shù)值和范圍)的量施用所述TLR9激動(dòng)劑和/或TLR2 / 6激動(dòng)劑。
[0015]某些實(shí)施方案涉及可藥用組合物，其包含TLR9激動(dòng)劑和TLR2 / 6激動(dòng)劑、抗炎劑和一種或多種藥物賦型劑，其中所述組合物是無菌的并基本上不含病原性微生物。在某些方面，所述TLR2 / 6激動(dòng)劑是PAM2CSK4。在另一方面，所述TLR9激動(dòng)劑是C型寡聚脫氧核苷酸(ODN)。C型ODN可包括但不限于0DN2395或0DNM362或0DN10101。
[0016]在某些方面，所述StIR組合物包含鞭毛蛋白多肽或其區(qū)段或衍生物，所述鞭毛蛋白多肽包含稱為 TLR5 激動(dòng)劑的肽 QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA(SEQ ID NO:2)的 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個(gè)連續(xù)氨基酸。本發(fā)明的多肽也可包含與SEQ ID NO:2具有至少70、80或90% (包括其間所有值和范圍)同一性的氨基酸序列。在另一些方面，鞭毛蛋白是合成的和/或純化的或分離的鞭毛蛋白多肽或肽。術(shù)語(yǔ)“純化的”或“分離的”表示該組分是之前從其他蛋白質(zhì)或合成反應(yīng)物或副產(chǎn)物中分離或純化的，并且所述組分在配制到組合物中之前的純度為至少約95%。在某些實(shí)施方案中，所述純化或分離的組分的純度約為或至少約為80、95、96、97、98、99、99.1,99.2,99.3,99.4,99.5%或更高，或其中可導(dǎo)出的任何范圍。然后可將這種純化的組分與其他組分混和，以形成本文所述的組合物。
[0017]重組鞭毛蛋白或其片段或區(qū)段包含SEQ ID N0:2或其他鞭毛蛋白多肽的5、10、15、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350或400個(gè)連續(xù)氨基酸，包括其間所有值和范圍。這些片段或區(qū)段與SEQ ID N0:2或其他鞭毛蛋白多肽具有至少、至多或約70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100%的同一性。在某些方面，鞭毛蛋白多肽或區(qū)段與SEQ ID NO:2的序列具有至少75%的同一性。在另一方面，鞭毛蛋白多肽或區(qū)段與SEQ ID NO:2的序列具有至少80%的同一性。在另一方面，鞭毛蛋白多肽或區(qū)段與SEQ ID NO:2的序列具有至少85%的同一性。在另一方面，鞭毛蛋白多肽或區(qū)段與SEQ ID NO:2的序列具有至少90%的同一性。在另一方面，鞭毛蛋白多肽或區(qū)段與SEQ ID NO:2的序列具有至少95%的同一性。鞭毛蛋白或其區(qū)段的衍生物或變體包括對(duì)SEQ ID NO:2的插入、缺失和點(diǎn)突變。一種特定的插入突變是融合蛋白，其在羧基端或氨基端包含對(duì)鞭毛蛋白而言是外源的氨基酸序列。許多鞭毛蛋白為本領(lǐng)域所知，包括但不限于以下登錄號(hào)的鞭毛蛋白 BAB58984(gi 114278896) ；YP_001330159 (gi 1150402865)；YP_001323483 (giI 150399716) ；CAA28975 (gi|1333716) ；CAA02137 (gi|1567895)；CAA67105 (giI 1580779) ；AAR10473 (gi|38049688) ；CAR58992 (gi|197093531)；YP_001217666(gi1147675484) ；CAL12564(gi1122089712) ；BAD14977(gi|46093563)；或CAD05707 (gi 116503200)，均以援引方式將其在本申請(qǐng) 優(yōu)先權(quán)日:期時(shí)的內(nèi)容整體并入本文。
[0018]本發(fā)明的一些實(shí)`施方案可通過呼吸道施用。本發(fā)明的方法包括通過吸入或其他給藥方法向上呼吸道和/或下呼吸道施用組合物。在某些方面，通過吸入進(jìn)行施用。在某些方面，所述StIR組合物在噴霧劑或氣霧劑中施用。在另一方面，所述組合物是氣霧化的或噴霧化的，或是可以被吸入或滴入受試者中的形式。所述組合物可通過吸入或吸氣施用?？梢约s 0.01,0.05,0.1,0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70μ g 或 mg /kg 至約 55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200μ g 或 mg / kg 個(gè)體體重的量施用所述StIR組合物，包括單獨(dú)的或凝集的TLR激動(dòng)劑。在另一些方面，可向受試者施用約0.01,0.05,0.1,0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200 μ g或mg的StIR或每種TLR激動(dòng)劑或全部TLR激動(dòng)劑。所述受試者可以是有接觸吸入的病毒、細(xì)菌或真菌的風(fēng)險(xiǎn)，或者已經(jīng)接觸吸入的病毒、細(xì)菌或真菌。又一實(shí)施方案包括這樣的方法，其中在接觸或疑似接觸生物體或者接觸生物體的風(fēng)險(xiǎn)提高之前；之后；過程中；之前和之后；之前和過程中；過程中和之后；之前、之后和過程中施用所述組合物。所述受試者可接觸生物武器或條件性病原體。在一些特定方面中，受試者是免疫受損的，如癌癥患者或AIDS患者。
[0019]在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及可藥用組合物，其包含一種或多種TLR激動(dòng)劑；抗炎劑；抗微生物劑；和/或一種或多種藥物賦型劑。通常，此類組合物是無菌的，并且基本上不含病原性微生物。
[0020]在某些方面，所治療的或針對(duì)其進(jìn)行保護(hù)的病原性或潛在病原性微生物是病毒、細(xì)菌和/或真菌。在某些方面，微生物是病毒。病毒可來自腺病毒科(Adenoviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、絲狀病毒科(Filoviridae)、黃病毒科(Flaviviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、痕疫病毒科(Herpesviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、副粘病毒科(Paramyxovirinae)、肺病毒亞科(Pneumovirinae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、痕病毒科(Poxyiridae)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)或披膜病毒科(Togaviridae)的病毒；和/或副流感病毒(Parainfluenza)、流感病毒(Influenza)、H5N1、馬爾堡病毒(Marburg)、埃博拉病毒(Ebola)、嚴(yán)重急性呼吸器官綜合征冠狀病毒、黃熱病病毒、人呼吸道合胞體病毒、漢坦病毒(Hantavirus)或痘苗病毒。
[0021]在又一方面，所治療的或針對(duì)其進(jìn)行保護(hù)的病原性或潛在病原微生物是細(xì)菌。細(xì)菌可以是胞內(nèi)細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性菌或革蘭氏陰性菌。在另一方面，所述細(xì)菌包括但不限于葡萄球菌(Staphylococcus)、芽抱桿菌(Bacillus)、弗朗西絲氏菌(Francisella)或耶爾森氏菌(Yersinia)。在又一方面，所述細(xì)菌是炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisella tularensis)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aerugenosa)或金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)。在某些實(shí)施方案中，細(xì)菌是炭疽芽孢桿菌和/或金黃色葡萄球菌。在又一方面，所述細(xì)菌是藥物抗性菌，如多藥物抗性金黃色葡萄球菌(multiple drug resistant Staphylococcusaureas, MRSA) 0代表性的醫(yī)學(xué)相關(guān)性革蘭氏陰性菌包括流感嗜血桿菌(Hemophilusinfluenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺性軍團(tuán)病桿菌(Legionellapneumophila)、綠膿假單胞菌、大腸桿菌(Escherichia col i)、奇異變形菌(Proteusmirabilis)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescens)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)和傷寒沙門菌(Salmonella t`yphi)。代表性革蘭氏陽(yáng)性菌包括但不限于芽孢桿菌、李斯特菌(Listeria)、葡萄球菌、鏈球菌(Streptococcus)、腸球菌(Enterococcus)、放線菌(Actinobacteria)和梭菌(Clostridium)、缺少細(xì)胞壁并且不能革蘭氏染色的支原體(Mycoplasma)，包括來自這些形式的那些細(xì)菌。
[0022]在又一方面，所治療的或針對(duì)其進(jìn)行保護(hù)的病原性或潛在病原性微生物是真菌，如曲霉(Aspergillus)、假絲酵母(Candida)、隱球菌(Crytpococus)、組織胞衆(zhòng)菌(Histoplasma)、球抱子菌(Coccidioides)、芽生菌(Blastomyces)、肺囊蟲(Pneumocystis)或接合菌(Zygomyces)類的成員。在又一其他實(shí)施方案中，真菌包括但不限于煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、白色假絲酵母(Candida albicans)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、夾膜組織胞衆(zhòng)菌(Histoplasma capsulatum)、粗球抱子菌(Coccidioides immitis)或卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)。接合菌類包括娃糞霉目(Basidiobolales)(娃類霉科(Basidiobolaceae))、雙珠霉目(Dimargaritales)(雙珠霉科(Dimargaritaceae))、內(nèi)囊霉目(Endogonales)(內(nèi)囊霉科(Endogonacea))、蟲霉目(Entomophthorales)(新月霉科(Ancylistaceae)、藤霉科(Completoriaceae)、蟲霉科(Entomophthoraceae)、頂裂霉科(Meristacraceae)、新接霉科(Neozygitaceae))、梳霉目(Kickxellales)(梳霉科(Kickxellaceae))、被抱霉目(Mortierellales)(被抱霉科(Mortierellaceae))、毛霉菌目(Mucorales)和捕蟲菌目(Zoopagales)。曲霉類包括但不限于淺藍(lán)灰曲霉(Aspergillus caesiellus)、亮白曲霉(A.candidus)、肉色曲霉(A.carneus)、棒曲霉(A.clavatus)、彎頭曲霉(A.def Iectus)、黃曲霉(A.f Iavus)、煙曲霉(A.fumigatus)、灰綠曲霉(A.glaucus)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)、赫曲霉(A.0chraceus)、米曲霉(A.0ryzae)、寄生曲霉(A.parasiticus)、帚狀(A.penicilloides)、局限曲霉(A.restrictus)、醬油曲霉(A.sojae)、薩氏曲霉(A.sydowi)、Α.tamar1、土曲霉(A.terreus)、焦曲霉(A.ustus)、雜色曲霉(A.versicolor)等。假絲酵母家族包括但不限于白色假絲酵母、杜氏假絲酵母(C.dubliniensis)、光滑假絲酵母(C.glabrata)、高里假絲酵母(C.guiIIiermondii)、乳酒假絲酵母(C.kefyr)、克柔假絲酵母(C.krusei)、葡萄牙假絲酵母(C.lusitaniae)、C.miller1、C.0leophila、近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)、產(chǎn)朊假絲酵母(C.utilis)等。
[0023]在某些方面，病原菌是胞內(nèi)細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性菌或革蘭氏陰性菌。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)菌是鏈球菌、葡萄球菌、芽孢桿菌、弗朗西絲氏菌或耶爾森菌。在又一些方面中，所述細(xì)菌是炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森氏菌、土拉熱弗朗西絲氏菌、肺炎鏈球菌(Streptococcus pnemoniae)、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌和/或洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia)。
[0024]用于權(quán)利要求書和/或說明書時(shí)，術(shù)語(yǔ)“減輕”、“抑制”、“降低”或“防止”或這些術(shù)語(yǔ)的任何變型包括任何可測(cè)量的降低或完全抑制，以得到想要的結(jié)果，例如接觸后的微生物負(fù)荷或生長(zhǎng)減少。
[0025]在權(quán)利要求書和/或說明書中與術(shù)語(yǔ)“包含”結(jié)合使用時(shí)，無數(shù)量詞修飾的名詞可以指一個(gè)/種，但也 與“一個(gè)/種或多個(gè)/種”、“至少一個(gè)/種”和“一個(gè)/種或多于一個(gè)/種”的意思一致。
[0026]本文討論的任何實(shí)施方案可用本發(fā)明的任何方法或組合物來實(shí)施，反之亦然。此外，本發(fā)明的組合物和藥盒可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。
[0027]在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“約”用于表示數(shù)值，包括用于測(cè)定該值的裝置或方法的誤差的標(biāo)準(zhǔn)差。
[0028]權(quán)利要求中的術(shù)語(yǔ)“或”的使用用于表示“和/或”，除非明確地表明僅指?jìng)溥x方案或者備選方案是互斥的，但本公開內(nèi)容支持僅指?jìng)溥x方案和“和/或”的定義。在包括“和/或”、“或”或者“和”的某些列舉中，一個(gè)或多個(gè)所列成員可以明確地從所述列舉中排除在外。
[0029]如本說明書和權(quán)利要求中所用，詞語(yǔ)“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是包括式或開放式的，并且不排除其他未提及的要素或方法步驟。
[0030]本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征和優(yōu)勢(shì)會(huì)從以下詳細(xì)描述中變得更為明顯。然而應(yīng)理解，詳細(xì)描述和具體實(shí)施例盡管表明了本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但它們僅用于說明目的，因?yàn)榛谠撛敿?xì)說明，本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的多種改變和修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是很明顯的。
[0031]附圖描述
[0032]以下附圖形成本說明書的一部分，并且為進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些方面而包括在內(nèi)。通過參考這些附圖中的一個(gè)或多個(gè)并結(jié)合本文呈現(xiàn)的對(duì)具體實(shí)施方案的詳細(xì)說明，可以更好地理解本發(fā)明。
[0033]圖1.天然內(nèi)毒素(TLR4激動(dòng)劑)誘導(dǎo)一定的StIR。在用NTHI溶胞產(chǎn)物(“NTHisup”)、NTHi溶胞產(chǎn)物中的估計(jì)LPS濃度(“內(nèi)毒素lx”)、認(rèn)為溶胞產(chǎn)物中LPS的10倍(“內(nèi)毒素10x”)處理或不處理24小時(shí)后，用肺炎鏈球菌(5X101(ICFU / ml)攻擊野生型Swiss-Webster 小鼠(10 只 / 組)。
[0034]圖2.合成的六酰基化脂質(zhì)A(TLR4激動(dòng)劑)不誘導(dǎo)StIR。在用綠膿假單胞菌攻擊前24小時(shí),用合成的脂質(zhì)A懸液或PBS處理野生型Swiss-Webster小鼠(8只/組)。
[0035]圖3.顯示了在用綠膿假單胞菌進(jìn)行感染性攻擊前24小時(shí)，用高劑量或低劑量的咪喹莫特(TLR7激動(dòng)劑)或PBS處理Swiss-Webster小鼠(8只/組)的代表性實(shí)驗(yàn)。
[0036]圖4.僅有TLR9刺激時(shí)誘導(dǎo)極小的保護(hù)。在用吸入的綠膿假單胞菌感染前24小時(shí)，用PBS或0DN2395處理野生型Swiss-Webster小鼠(8只/組)。
[0037]圖5.利用TLR2 / 6激動(dòng)劑進(jìn)行的高劑量處理誘導(dǎo)了 StIR。在用綠膿假單胞菌感染前24小時(shí)，用高劑量或低劑量的Pam2CSK4或PBS處理野生型Swiss-Webster小鼠。
[0038]圖6.TLR激動(dòng)劑的組合比任何單獨(dú)激動(dòng)劑誘導(dǎo)更強(qiáng)的StIR。用0DN2395 (20 u g /ml，8只小鼠)、Pam2CSK4 (20 u g / ml, 8只小鼠)、兩種激動(dòng)劑(10只小鼠)或PBS (10只小鼠)處理野生型Swiss-Webster小鼠。
[0039]圖7.合成的鞭毛蛋白片段(TLR5激動(dòng)劑)誘導(dǎo)StIR。在用綠膿假單胞菌感染前24小時(shí)，將鞭毛蛋白的22個(gè)氨基酸高保守性區(qū)段或僅有PBS氣霧化到野生型Swiss-Webster中。
`[0040]圖8.甲型流感病毒/ HK肺合并物11-29-05氣霧劑感染對(duì)體重的影響:一次30分鐘氣霧劑處理；流感病毒劑量:~100倍TCID5tl /小鼠。體重開始時(shí)隨感染的發(fā)展而下降，反映了疾病的嚴(yán)重程度，然后在恢復(fù)過程中上升。
[0041]圖9.甲型流感病毒/ HK肺合并物11-29-05氣霧劑感染對(duì)存活的影響:一次30分鐘氣霧劑處理；流感病毒劑量:~100倍TCID5tl /小鼠。
[0042]圖10.展示了 ODN / PAM2 / PolyIC的一次30分鐘氣霧劑預(yù)處理對(duì)感染甲型流感病毒/ HK氣霧劑的小鼠存活的影響；病毒劑量~130倍TCID5tl /小鼠。
[0043]圖11.甲型流感病毒/ HK肺合并物11-29-05氣霧劑感染對(duì)體重的影響:一次30分鐘氣霧劑處理；流感病毒劑量:~100倍TCID5tl /小鼠。體重開始時(shí)隨感染的發(fā)展而下降，反映了疾病的嚴(yán)重程度，然后在恢復(fù)過程中上升。
[0044]圖12A和12B.細(xì)菌溶胞產(chǎn)物誘導(dǎo)的肺炎抵抗力需要的是MyD88 (而不是TRIF)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。圖12A.在之前24小時(shí)用不可分型流感嗜血桿菌(NTHi)的霧化溶胞產(chǎn)物預(yù)處理或不進(jìn)行預(yù)處理的情況下，用綠膿假單胞菌吸入攻擊MydSS—r和野生型小鼠。左，存活(N =10只小鼠/組，< 0.0001)。右，感染后立即出現(xiàn)的肺細(xì)菌負(fù)荷(右，N = 3只小鼠/組，
〃p< 0.004，tp=0.39相對(duì)于野生型對(duì)照)。圖12B.用細(xì)菌溶胞產(chǎn)物預(yù)處理或不預(yù)處理
的情況下，Trif+小鼠的綠膿假單胞菌攻擊。左，存活(N= 10只小鼠/組，*p< 0.0001)。右，感染后立即出現(xiàn)的肺細(xì)菌負(fù)荷(右，N = 3只小鼠/組，* p < 0.0001)。
[0045]圖13.所誘導(dǎo)的病原體殺傷在白細(xì)胞介素-1受體缺陷型小鼠中不受損。在用綠膿假單胞菌攻擊前24小時(shí)，用氣霧化的PBS或不可分型流感嗜血桿菌(NTHi)處理I; lr_ / _和野生型小鼠。所顯示的是感染后立即出現(xiàn)的肺勻漿的細(xì)菌負(fù)荷。(N=3只小鼠/組Zp =0.0Ol相對(duì)于野生型+PBS,** P = 0.01相對(duì)于I Ilr^,、fp=0.66:相對(duì)于野生型+PBS,
|p=0.89相對(duì)于野生型+NTHi)。
[0046]圖14.用單一合成TLR配體處理后支氣管肺泡灌洗液中的白細(xì)胞計(jì)數(shù)。用PBS或以下TLR配體之一處理24小時(shí)后，對(duì)小鼠進(jìn)行BAL:Pam3CSK4 (TLR2 / I激動(dòng)劑，Iyg/ml >3 μ g / ml、10 Ug / ml)、Pam2CSK4 (TLR2 / 6 激動(dòng)劑，I μ g / ml>3 μ g / ml、10 Ug /ml)、Poly (I:C) (TLR3 激動(dòng)劑，I μ g / ml、IOyg / ml、IOOyg / ml)、合成的脂質(zhì) A (MPLA,TLR4 激動(dòng)劑，Iyg / mlUOy g / mlUOOy g / ml)、Flg22 (合成的 22-mer 鞭毛蛋白，TLR5激動(dòng)劑，IOyg / ml、100yg / ml、1000yg / ml)、咪喹莫特(TLR7 和 TLR8，100 μ g / ml、300 μ g / ml、1000yg / ml)或 0DN2395 (TLR9 激動(dòng)劑，2 μ g / ml、20 μ g / ml)。所顯示的是BAL液內(nèi)的嗜中性粒細(xì)胞(黑色條)和巨噬細(xì)胞(灰色條)。
[0047]圖15A-15G.利用單一合成TLR配體進(jìn)行氣霧化處理不誘導(dǎo)高水平的肺炎抵抗力。用PBS或以下合成TLR配體處理(8ml噴霧，在20分鐘中施用)之后24小時(shí)，利用綠膿假單胞菌攻擊野生型小鼠:圖15A.TLR2 / I激動(dòng)劑Pam3CSK4100y g / ml，圖15B.TLR2 / 6激動(dòng)劑 Pam2CSK410 μ g / ml，圖 15C.TLR3 激動(dòng)劑 poly (I:C) 100 μ g / ml，圖 15D.TLR4 激動(dòng)劑 MPLA100 μ g / ml，圖 15E.TLR5 激動(dòng)劑 Flg22100 μ g / ml，圖 15F.TLR7 和 TLR8 激動(dòng)劑咪喹莫特Img / ml，或圖15G.TLR9激動(dòng)劑0DN239520yg / ml。存活曲線是處理和未處理小鼠的至少三組不同實(shí)驗(yàn)的代表性實(shí)例(N = 8只小鼠/組，= 0.5，= 1.0，fp=0.47, |p=0.2)。
[0048]圖16A-16C.TLR2 / 6和TLR9激動(dòng)劑協(xié)作誘導(dǎo)針對(duì)細(xì)菌性肺炎的抵抗力。圖16A.左，用PBS、Pam2CSK410y g / ml、0DN239520 μ g / ml、組合、或雙倍劑量的組合處理 后24小時(shí)，用綠膿假單胞菌攻擊的小鼠的存活(N = 6只小鼠/組，|p=0.008相比于
PBS)。右，綠膿假單胞菌感染后立即產(chǎn)生的肺勻漿的細(xì)菌負(fù)荷(N = 3只小鼠/組，#p =0.045 相比于 PBS, ##p = 0.030 相比于 PBS)。圖 16B.左，用 PBS、Pam2CSK410 μ g / ml、0DN239520 μ g / ml、組合或雙倍劑量組合處理后24小時(shí)，用肺炎鏈球菌攻擊的小鼠的存活
(N= 10只小鼠/組，tp<0.0001相比于PBS處理)。右，肺炎鏈球菌感染2 X 101°后立即
產(chǎn)生的肺勻漿的細(xì)菌負(fù)荷(N = 3只小鼠/組，fp<0.001, |p<0.0001)。圖16C.pbs、
Pam2CSK410 μ g / ml、0DN239520 μ g / ml 或者 Pam2CSK4 與 0DN2395 的組合處理后 4 或 24小時(shí)，來自小鼠的BAL細(xì)胞計(jì)數(shù)(N = 3只小鼠/組，* P = 0.016相比于PBS，* * P < 0.0001相比于PBS，fp=0.041相比于僅有Pam2)。
[0049]圖17A-17F.并非所有的TLR激動(dòng)劑組合都提供針對(duì)肺炎的顯著保護(hù)。利用PBS或以下TLR激動(dòng)劑組合處理后24小時(shí)，用綠膿假單胞菌攻擊野生型小鼠:圖17A.Pam2CSK4和 poly (I:C)，圖 17B.Pam2CSK4 和 Flg22,圖 17C.Pam2CSK4 和咪喹莫特，圖 17D.0DN2395 和poly (1:C)，圖 17E.0DN239 和 Flg22，圖 17F.0DN2395 和 Pam3CSK4。存活曲線是至少三個(gè)不
同實(shí)驗(yàn)的代表性實(shí)例(N = 8只小鼠/組，= 0.20，= 0.08，fp=1.0, |p=0.5 ) 0
[0050]圖18A-18B.TLR2足以促進(jìn)保護(hù)性Pam2CSK4和0DN2395協(xié)同作用，但并不是誘導(dǎo)抵抗力所必需的。圖18A.左，用或不用0DN2395和Pam2CSK4處理后24小時(shí)，用綠膿假單胞菌攻擊的Hrf+和野生型小鼠的存活(N = 8只小鼠/組Zp < 0.0002)。右，用綠膿假單胞菌感染后立即出現(xiàn)的肺勻漿的細(xì)菌負(fù)荷(N = 4只小鼠/組，Mp < 0.0001相比于
野生型+PBS，tP=0.59相比于Hrfi+PBS)。圖18B.左，用或不用不可分型流感嗜血桿菌
(NTHi)的霧化溶胞產(chǎn)物處理后24小時(shí)，用綠膿假單胞菌攻擊TLR2+和野生型小鼠的存活(N = 10只小鼠/組，< 0.0002)。右，用綠膿假單胞菌感染后立即出現(xiàn)的肺勻漿的細(xì)菌
負(fù)荷(N = 3只小鼠/組，Ip=0.03相比于野生型+PBS，#p = 0.002相比于Tlr2++PBS)。
[0051]圖19A-19B.C型(而不是A類和B類)與TLR9結(jié)合的CpG ODN與Pam2CSK4協(xié)同作用，以誘導(dǎo)對(duì)細(xì)菌性肺炎的抵抗力。圖19A.綠膿假單胞菌攻擊之前24小時(shí)，用Pam2CSK4和0DN2395或者Pam2CSK4和亂序?qū)φ誒DN處理的野生型小鼠的存活(N = 10只小鼠/組，* p < 0.0001)。FIG.19B.用 PBS 或 Pam2CSK4 組合 A 類 CpG 0DN(0DN1585 或 0DN2216)、B類CpG 0DN(0DN2006-G5)或C類CpGODN(M362或0DN2395)處理后24小時(shí)，用綠膿假單胞菌攻擊的野生型小鼠的存活(N = 10只小鼠/組，* p = 0.01相比于PBS，= 0.0001相比于 PBS ； fp=0.3 相比于 Pam2+0DN2395)。
[0052]圖20A-20D.TLR2 / 6和TLR9激動(dòng)劑在體外協(xié)同誘導(dǎo)小鼠和人呼吸道上皮細(xì)胞的細(xì)菌殺傷。圖20A.用炭疽芽孢桿菌(1000個(gè)芽孢)感染前，用Pam2CSK4(10ii g / ml)和/或0DN2395 (20 ii g / ml)處理MLE-15細(xì)胞4小時(shí)。所顯示的是感染后4小時(shí)的細(xì)菌CFU(*P = 0.05相比于PBS，**p = 0.016相比于PBS，#p > 0.05相比于任一單一激動(dòng)劑)。圖20B.用0DN2395和Pam2CSK4處理MLE培養(yǎng)基(無細(xì)胞)，4小時(shí)后用炭疽芽孢桿菌(1000
個(gè)芽孢)感染并培養(yǎng)(tp=1.0)。圖20C.用綠膿假單胞菌(2700CFU)感染之前，用0DN2395
和Pam2CSK4處理A549細(xì)胞`4小時(shí)。所顯示的是感染后4小時(shí)的細(xì)菌CFU(* p = 0.01相比于 PBS，**p = 0.003 相比于 PBS，* * * p = 0.001 相比于 PBS，#p = > 0.05 相比于任一單一激動(dòng)劑)。圖20D.用0DN2395和Pam2CSK4處理MLE培養(yǎng)基(無細(xì)胞)，4小時(shí)后用綠
膿假單胞菌(4000CFU)感染并培養(yǎng)(:j:p=0.58)。
[0053]圖21.用多種合成的TLR激動(dòng)劑免疫并用5倍LD50炭疽芽孢桿菌Ames芽孢(MD-10-013)鼻內(nèi)攻擊的Swiss-Webster小鼠的存活。如所示，在用炭疽攻擊前24小時(shí)，用氣霧化的TLR激動(dòng)劑預(yù)處理小鼠。ALIIS = NTHi細(xì)菌溶胞產(chǎn)物，2395 = 0DN2395,10101 =0DN10101，M362 = 0DN-M362.1X = 40 u g / ml 的 ODN 和 20 y g / ml 的 Pam2。
[0054]圖22.利用ODN / Pam2或NTHi溶胞產(chǎn)物進(jìn)行氣霧劑預(yù)處理對(duì)甲型流感病毒/ HK感染的小鼠存活的影響。一次30分鐘氣霧劑處理；流感病毒劑量:~100倍TCID5tl /小鼠。
[0055]發(fā)明詳述
[0056]免疫系統(tǒng)是保護(hù)生物免受外界生物影響的特化細(xì)胞和器官的系統(tǒng)。當(dāng)免疫系統(tǒng)功能正常時(shí)，其保護(hù)機(jī)體免受微生物感染，并破壞癌細(xì)胞和異物。如果免疫系統(tǒng)弱化，其保護(hù)機(jī)體的能力也弱化，使得病原體能夠在機(jī)體內(nèi)生長(zhǎng)。
[0057]免疫系統(tǒng)經(jīng)常分成:(a)先天免疫，其包含提供直接“第一線”防御的組分，以持續(xù)阻擋病原體，和(b)適應(yīng)性(獲得性)免疫，其包含抗體的產(chǎn)生和特異地設(shè)計(jì)用于靶向特定病原體的T細(xì)胞的產(chǎn)生或刺激。利用適應(yīng)性免疫性,身體可在一定時(shí)間后產(chǎn)生針對(duì)特定病原體的特異性免疫。該應(yīng)答需要數(shù)天才能發(fā)生，并對(duì)防止首次侵襲無效，但通常會(huì)防止任何后續(xù)的感染，也幫助清除持續(xù)更久的感染。
[0058]應(yīng)答于某些炎性刺激，小鼠和人呼吸道上皮的分泌細(xì)胞迅速發(fā)生顯著的結(jié)構(gòu)變化，稱為炎性化生。大多數(shù)結(jié)構(gòu)變化是由于形成凝膠的分泌性粘蛋白的產(chǎn)生增加，同時(shí)在粘蛋白分泌、微生物殺傷或炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起功能的其他大分子也上調(diào)。認(rèn)為該應(yīng)答的生理功能是加強(qiáng)針對(duì)微生物病原體的局部防御，但該假說接受了的正式測(cè)試有限。自相矛盾的是，形成凝膠的粘蛋白的過度產(chǎn)生和分泌是呼吸道常見炎性疾病(如哮喘、囊性纖維化和肺慢性阻塞性疾病(COPD))中氣流堵塞的主要原因。刺激不產(chǎn)生粘蛋白的先天免疫將通過預(yù)防和/或治療受試者而提供一種減輕呼吸道感染的其他方法。
[0059]本發(fā)明的一些實(shí)施方案包括用包含1、2、3、4種或更多種TLR激動(dòng)劑(包括其區(qū)段或衍生物或類似物)的組合物刺激受試者的氣道。施用本發(fā)明組合物的受試者被賦予針對(duì)潛在感染生物的治療性、預(yù)防性或者治療性和預(yù)防性應(yīng)答。在一些具體方面中，將組合物霧化并通過呼吸道施用。所述組合物用于例如通過激活或增強(qiáng)肺的先天免疫來誘導(dǎo)或以其他方式引發(fā)保護(hù)作用。
[0060]本發(fā)明的某些方面包括小分子和/或TLR激動(dòng)劑，其來自不同的微生物，或是人工合成的。通常，所述小分子和/或TLR激動(dòng)劑不引起分泌性粘蛋白的產(chǎn)生增加。本發(fā)明的實(shí)施方案可用作針對(duì)例如生物武器、新的有毒微生物或條件性微生物的預(yù)防性和先行性(preemptive)治療劑。
[0061]1.StIR 組合物
[0062]A.異源化合物 和部分
[0063]許多非宿主或異源分子可以刺激、增強(qiáng)或促進(jìn)免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。這些部分包括多種先天性受體激動(dòng)劑和/或微生物組分。
[0064]1.先天性受體配體
[0065]模式識(shí)別受體(或稱為PRR, pattern recognition receptor)(先天性受體)是先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞表達(dá)的用來識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(或稱為PAMP，pathogen-associated molecular pattern)(其與微生物病原體或細(xì)胞脅迫相關(guān))的蛋白質(zhì)。PAMP包括但不限于細(xì)菌碳水化合物(例如，脂多糖或LPS、甘露糖)、核酸(例如，細(xì)菌或病毒DNA或RNA)、肽聚糖和脂磷壁酸(來自革蘭氏陽(yáng)性菌)、N-甲酰甲硫氨酸、脂蛋白、真菌葡聚糖等。
[0066]PRR通常根據(jù)其配體特異性、功能、定位和/或進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分類?；诠δ?，PRR可分為胞吞PRR或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)PRR。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)PRR包括膜結(jié)合Tol I樣受體和胞質(zhì)NOD樣受體的大家族。胞吞PRR促進(jìn)吞噬細(xì)胞對(duì)微生物的附著、吞食和破壞，但不傳遞胞內(nèi)信號(hào)。這些PRR識(shí)別碳水化合物，并包括巨噬細(xì)胞的甘露糖受體、存在于所有吞噬細(xì)胞上的葡聚糖受體，以及存在于所有巨噬細(xì)胞的識(shí)別帶電配體并介導(dǎo)凋亡細(xì)胞的清除的清道夫受體(scavengerreceptor)。
[0067]已經(jīng)鑒定了許多先天性受體，包括但不限于Toll樣受體(TLR)、C型凝集素受體(CLR)和與核苷酸結(jié)合的寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(Nod樣受體或NLR)。TLR是在先天免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的一類蛋白質(zhì)。它們是單次跨膜的非催化性受體，其識(shí)別來自微生物的結(jié)構(gòu)上保守的分子。一旦這些微生物存在于皮膚或腸道粘膜其上或其中，它們即被激活免疫細(xì)胞應(yīng)答的TLR所識(shí)別。有趣的是，當(dāng)單獨(dú)施用時(shí)，許多這些TLR激動(dòng)劑不誘導(dǎo)顯著的StIR。通常，使用本文所述方法治療的個(gè)體或受試者已經(jīng)接觸病原性微生物，或有這種接觸的風(fēng)險(xiǎn)。
[0068]a.Toll樣受體(TLR)激動(dòng)劑
[0069]Toll樣受體(TLR)是最充分表征的PRR(Ishii等，2008)。它們是高度保守的跨膜蛋白，由外功能區(qū)(ectodomain)(具有用于模式識(shí)別的多個(gè)富亮氨酸重復(fù))、跨膜a -螺旋和用于胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的Toll /白介素-1受體(TIR)結(jié)構(gòu)域組成。已經(jīng)鑒定了至少13種哺乳動(dòng)物TLR，每一種均特異性定位在質(zhì)膜或內(nèi)體膜上，并且每一種檢測(cè)PAMP中的獨(dú)特對(duì)應(yīng)物(Akira等，2006 ;Shi等，2006)。PAMP識(shí)別后，通過細(xì)胞溶膠TIR銜接蛋白組合的TLR特異性募集發(fā)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。與四種其他銜接蛋白中的一個(gè)或多個(gè)一起，TIR銜接蛋白MyD88是始自大多數(shù)TLR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的。從TLR3和TLR4觀察到的不依賴MyD88的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件需要TIR銜接蛋白TRIF (也稱為TICAM-1)，其有或沒有TRAM的參與(Yamamoto等，2003)。TLR特異性TIR銜接蛋白信號(hào)級(jí)聯(lián)激活受體特異性轉(zhuǎn)錄因子如NF-K B，激活蛋白-1和干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)，導(dǎo)致炎性基因和抗微生物基因的表達(dá)(Akira等，2006 ;0’Neill，L.A.，和 Bowie, 2007 ；Takeda, K.，和 Akira, 2004)。
[0070]TLR激動(dòng)劑是發(fā)揮激活TLR (例如從而誘導(dǎo)通過TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件)的功能的任何化合物或物質(zhì)。合適的TLR激動(dòng)劑包括TLRl激動(dòng)劑、TLR2激動(dòng)劑、TLR3激動(dòng)劑、TLR4激動(dòng)劑、TLR5激動(dòng)劑、TLR6激動(dòng)劑、TLR7激動(dòng)劑、TLR8激動(dòng)劑和TLR9激動(dòng)劑。
[0071]目前廣泛公認(rèn)的是，保護(hù)性免疫的產(chǎn)生不僅依賴于抗原接觸，還依賴于遇到抗原時(shí)的環(huán)境。存在許多實(shí)例，其中在炎性環(huán)境中向宿主中引入新抗原產(chǎn)生免疫耐受而不是長(zhǎng)期免疫，而在炎性試劑(佐劑`)存在下接觸抗原則誘導(dǎo)免疫(Mondino等，1996 ；PuIendran等，1998 Jenkins等，1994 ;和Keamey等)。由于這可意味著耐受與免疫之間的差異，所以已經(jīng)付出大量努力用于發(fā)現(xiàn)感染原內(nèi)存在的“佐劑”，其刺激參與產(chǎn)生抗原呈遞的適當(dāng)免疫原性環(huán)境的分子途徑。目前已知的是，大量佐劑活性是由于微生物和病毒產(chǎn)物與免疫細(xì)胞上表達(dá)的Toll樣受體(TLR)的不同成員之間的相互作用(Beutler等，2004 ;Kaisho，2002 ;Akira等，2003 ;以及Takeda和Akira，2004)。TLR得名于其與果蠅中的分子(稱為Toll，其在果蠅發(fā)育中發(fā)揮功能并參與抗微生物免疫)的同源性(Lernaitre等，1996 ;和Hashimoto 等，1988)。
[0072]早期工作顯示，Toll的哺乳動(dòng)物同源物和Toll途徑分子對(duì)先天免疫系統(tǒng)細(xì)胞應(yīng)答微生物攻擊和微生物副產(chǎn)物的能力而言至關(guān)重要(Medzhitov等，1997 ;Medzhitov等，1998 ；Medzhitov等，2000 ；和Janeway等，2002)。自從將LPS鑒定為TLR4激動(dòng)劑以來(Poltorak等，1998)，已經(jīng)描述了許多其他TLR激動(dòng)劑，如三?；囝愋虷PV多肽(TLRI)、肽聚糖、脂磷壁酸和Pam3Cys (TLR2)、dsRNA (TLM)、鞭毛蛋白(TLR5)、二酰基多類型HPV多肽，如Malp-2 (TLR6)，咪唑喹啉和單鏈RNA(TLR7、8)、細(xì)菌DNA、非甲基化的CpG DNA序列，甚至是人基因組 DNA 抗體復(fù)合體(TLR9) (Takeuchi 等，2001 ；Edwards 等，2002 ；Hayashi 等，2003；Nagase 等，2003)。
[0073]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”指可與受體(例如，TLR)組合產(chǎn)生細(xì)胞活性的化合物。激動(dòng)劑可以是直接結(jié)合受體的配體?；蛘?，激動(dòng)劑可以通過以下與受體間接組合，例如，(a)與直接結(jié)合受體的另一分子形成復(fù)合體，或(b)以其他方式導(dǎo)致其他化合物的修飾，使得所述其他化合物直接結(jié)合受體。激動(dòng)劑可以稱為特定TLR的激動(dòng)劑(例如，TLR7激動(dòng)劑)或特定TLR組合的激動(dòng)劑(例如，TLR7 / 8激動(dòng)劑一一 TLR7和TLR8兩者的激動(dòng)劑)。
[0074]在本文可互換使用的術(shù)語(yǔ)“CpG_0DN”、“CpG核酸”、“CpG多核苷酸”和“CpG寡核苷酸”指這樣的多核苷酸，其包含至少一個(gè)5’ -CG-3’部分，并且在許多實(shí)施方案中包含未甲基化的5’ -CG-3’部分。一般而言，CpG核酸是具有至少6個(gè)核苷酸堿基的單鏈或雙鏈DNA或RNA多核苷酸,其可包含修飾的核苷酸或修飾的核苷序列，或由其組成。在一些實(shí)施方案中，CpG核酸的5’ -CG-3’部分是回文核苷酸序列的一部分。在一些實(shí)施方案中，CpG核酸的5’ -CG-3’部分是非回文核苷酸序列的一部分。
[0075]合適的TLR激動(dòng)劑包括分離的天然TLR激動(dòng)劑，以及合成的TLR激動(dòng)劑。從天然的TLR激動(dòng)劑來源分離的TLR激動(dòng)劑一般是純化的，例如純化的TLR激動(dòng)劑的純度為至少約80 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約98 %、至少約99 %或高于99 %。合成的TLR激動(dòng)劑通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備，一般純度為至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%、或高于99%。
[0076]合適的TLR激動(dòng)劑包括不附著到任何其他化合物上的TLR激動(dòng)劑。合適的TLR激動(dòng)劑包括共價(jià)或非共價(jià)附著到另一化合物上的TLR激動(dòng)劑。在一些實(shí)施方案中，TLR激動(dòng)劑直接附著到另一化合物上。在另一些實(shí)施方案中，TLR激動(dòng)劑通過接頭附著到另一化合物上。TLR激動(dòng)劑所附著的化合物包括載體、支架、不溶的支持物、微粒、微球等。載體包括治療性多肽；提供更高溶解度的多肽；提高TLR激動(dòng)劑在生理性介質(zhì)(例如血清或其他體液)中的半衰期的多肽等。在一些實(shí)施方案中，TLR激動(dòng)劑將直接或通過接頭綴合到另一TLR激動(dòng)劑上。
[0077]在一些實(shí)施方案`中，TLR激動(dòng)劑是TLR激動(dòng)劑的前藥形式。前藥由與活性治療劑共價(jià)連接的前藥部分組成。前藥能夠在體內(nèi)通過其結(jié)構(gòu)的某些化學(xué)或酶促修飾轉(zhuǎn)化成藥物(活性治療劑)。前藥部分的實(shí)例為本領(lǐng)域所熟知，并可見于以下參考文獻(xiàn)中=BiologicalApproaches to the Controlled Delivery of Drugs, R.L.J uliano, New York Academyof Sciences, (1988) ；Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism:Chemistry,Biochemistry,and Enzymology,Bernard Testa,Vch Verlagsgesellschaft Mbh, (2003)；和 Prodrugs:Topical and Ocular Drug Delivery, Kenneth Sloan, Marcel Dekker ；(1992)。前藥部分的實(shí)例是肽，例如將TLR配體引導(dǎo)到作用位點(diǎn)上的肽，和在其氨基端具有兩個(gè)或更多個(gè)游離且未偶聯(lián)的羧酸的肽。其他示例性可切割前藥部分包括酯基、醚基、酰基、烷基、憐酸基、橫酸基、N氧化物和叔丁氧基擬基。
[0078]在一些實(shí)施方案中，TLR激動(dòng)劑是單體TLR激動(dòng)劑。在另一些實(shí)施方案中，TLR激動(dòng)劑是多聚化的，例如TLR激動(dòng)劑是多聚體的。在一些實(shí)施方案中，多聚化的TLR激動(dòng)劑是同功能的，例如由一種類型的TLR激動(dòng)劑組成。在另一些實(shí)施方案中，多聚化的TLR激動(dòng)劑是異功能TLR激動(dòng)劑。
[0079]在一些實(shí)施方案中，TLR配體是嵌合的TLR配體(本文也稱為“異功能”TLR配體)。在一些實(shí)施方案中，嵌合的TLR激動(dòng)劑包含TLR9激動(dòng)劑部分和TLR2激動(dòng)劑部分。以下是異功能TLR激動(dòng)劑的非限制性實(shí)例。[0080]在一些實(shí)施方案中，嵌合的TLR配體具有以下通式:(X) n- (Y) m，其中X是TLRl激動(dòng)劑、TLR2激動(dòng)劑、TLR3激動(dòng)劑、TLR4激動(dòng)劑、TLR5激動(dòng)劑、TLR6激動(dòng)劑、TLR7激動(dòng)劑、TLR8激動(dòng)劑和TLR9激動(dòng)劑，而Y是TLR2激動(dòng)劑、TLR3激動(dòng)劑、TLR4激動(dòng)劑、TLR5激動(dòng)劑、TLR6激動(dòng)劑、TLR7激動(dòng)劑、TLR8激動(dòng)劑和TLR9激動(dòng)劑，n和m獨(dú)立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大(包括其間的所有值和范圍)的整數(shù)。在某些實(shí)施方案中，X或Y是TLR9，并且X或Y 是 TLR2 / 6。
[0081]TLR2激動(dòng)劑.TLR2激動(dòng)劑包括分離的天然TLR2激動(dòng)劑；和合成的TLR2激動(dòng)劑。從天然TLR2激動(dòng)劑來源分離的TLR2激動(dòng)劑一般是純化的，例如純化的TLR2激動(dòng)劑的純度為至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或高于99%。合成TLR2激動(dòng)劑通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備，純度一般為至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或高于99%。
[0082]TLR2激動(dòng)劑包括不附著到任何其他化合物上的TLR2激動(dòng)劑。TLR2激動(dòng)劑包括共價(jià)或非共價(jià)附著到另一化合物上的TLR2激動(dòng)劑。在一些實(shí)施方案中，TLR2激動(dòng)劑直接附著到另一化合物上。在另一些實(shí)施方案中，TLR2激動(dòng)劑通過接頭附著到另一化合物上。
[0083]TLR2激動(dòng)劑包括合成的三?；暮投；闹摹LR2配體的非限制性實(shí)例是FSL-1 (來自唾液支原體I的合成脂蛋白)、Pam3Cys (三棕櫚酰基-S-甘油基半胱氨酸)或S-[2，3-二(棕櫚?；趸?_(2RS)_丙基]-N-棕櫚酰-(R)-半胱氨酸，其中“Pam3”是“三棕櫚?；?S-甘油基”)(Aliprantis等，1999)。Pam3Cys的衍生物也是合適的TLR2激動(dòng)劑，其中衍生物包括但不限于S-[2，3-二(棕櫚?；趸?-(2-R，S)-丙基]_N_ 棕櫚酰-(R)-Cys-(S)-Ser-(Lys)4-羥基三鹽酸化物；Pam3Cys-Ser-Ser-Asn-Ala ；PaM3Cys-Ser- (Lys) 4 ；Pam3Cys-Ala-GIy ；Pam3Cys-Ser-Gly ;Pam3Cys_Ser ;PaM3Cys_0Me ；Pam3Cys-OH ；PamCAG,掠桐酸 _Cys ((RS) -2, 3- 二(掠桐酸基氧基)_ 丙基)-Ala-Gly-OH 等。合適的TLR2激動(dòng)劑的另一非限制性實(shí)例是Pam2CSK415 PaM2CSK4 (二棕櫚酰基-S-甘油基半胱氨酸-絲氨酸_(賴氨酸)4或`Pam2Cys-Ser-(Lys)4)是合成的二?；?。已經(jīng)在參考文獻(xiàn)中描述了合成的TLR激動(dòng)劑。參閱例如，Kellner等(1992) ;Seifer等(1990) ；Lee等(2003)。
[0084]TLR3激動(dòng)劑.TLR3激動(dòng)劑包括分離的天然的TLR3激動(dòng)劑；和合成的TLR3激動(dòng)劑。從天然TLR3激動(dòng)劑來源分離的TLR3激動(dòng)劑一般是純化的，例如純化的TLR3激動(dòng)劑的純度為至少約80 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約98 %、至少約99 %、或高于99 %。合成的TLR3激動(dòng)劑通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備，純度一般為至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或高于99%。
[0085]TLR3激動(dòng)劑包括不附著到任何其他化合物上的TLR3激動(dòng)劑。TLR3激動(dòng)劑包括共價(jià)或非共價(jià)附著到另一化合物上的TLR3激動(dòng)劑。在一些實(shí)施方案中，TLR3激動(dòng)劑直接附著到另一化合物上。在另一些實(shí)施方案中，TLR3激動(dòng)劑通過接頭附著到另一化合物上。
[0086]TLR3激動(dòng)劑包括天然的雙鏈RNA(dsRNA);合成的dsRNA ;和合成的dsRNA類似物等(Alexopoulou等,2001)。合成的ds RNA類似物的示例性非限制實(shí)例是poly (1:C)。
[0087]TLR4激動(dòng)劑.合適的TLR4激動(dòng)劑包括分離的天然TLR4激動(dòng)劑；和合成的TLR4激動(dòng)劑。從天然的TLR4激動(dòng)劑來源分離的TLR4激動(dòng)劑一般是純化的，例如純化的TLR4激動(dòng)劑的純度為至少約80 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約98 %、至少約99 %或高于99 %。合成的TLR4激動(dòng)劑通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備，純度一般為至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或高于99%。
[0088]TLR4激動(dòng)劑包括不附著到任何其他化合物上的TLR4激動(dòng)劑。合適的TLR4激動(dòng)劑包括共價(jià)或非共價(jià)附著到另一化合物上的TLR4激動(dòng)劑。在一些實(shí)施方案中，TLR4激動(dòng)劑直接附著到另一化合物上。在另一些實(shí)施方案中，TLR4激動(dòng)劑通過接頭附著到另一化合物上。TLR4激動(dòng)劑所附著的合適的化合物包括載體、支架等。
[0089]TLR4激動(dòng)劑包括天然的脂多糖(LPS)，例如來自多種革蘭氏陰性菌的LPS;天然LPS的衍生物；合成的LPS ;細(xì)菌熱休克蛋白60(Hsp60);甘露糖醛酸聚合物；黃脂素(fIavolipin);糖醒酸磷壁酸；肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)的肺炎球菌溶血素(pneumolysin);細(xì)菌菌毛(fimbriae),呼吸道合胞體病毒外殼蛋白等。TLR4激動(dòng)劑也包括合成的單磷酸脂質(zhì)A(MPLA, Invivogen)和磷酸化六酰基二糖(PHAD, Avanti PolarLipids)，以及其他合成的TLR4激動(dòng)劑。
[0090]TLR5激動(dòng)劑.合適的TLR5激動(dòng)劑包括分離的天然TLR5激動(dòng)劑；和合成的TLR5激動(dòng)劑。從天然的TLR5激動(dòng)劑來源分離的TLR5激動(dòng)劑一般是純化的，例如純化的TLR4激動(dòng)劑的純度為至少約80 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約98 %、至少約99 %或高于99 %。合成的TLR5激動(dòng)劑通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備，純度一般為至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或高于99%。
[0091]TLR5激動(dòng)劑包括不附著到任何其他化合物上的TLR5激動(dòng)劑。合適的TLR5激動(dòng)劑包括共價(jià)或非共價(jià)附著到另一化合物上的TLR5激動(dòng)劑。在一些實(shí)施方案中，TLR5激動(dòng)劑直接附著到另一化合物上。在另一些實(shí)施方案中，TLR5激動(dòng)劑通過接頭附著到另一化合物上。TLR5激動(dòng)劑附著的合適的化合物包括載體、支架等。
`[0092]TLR5激動(dòng)劑包括鞭毛蛋白的高度保守的22氨基酸區(qū)段以及全長(zhǎng)鞭毛蛋白及其其他區(qū)段。
[0093]TLR7激動(dòng)劑.合適的TLR7激動(dòng)劑包括分離的天然TLR7激動(dòng)劑；和合成的TLR7激動(dòng)劑。從天然的TLR7激動(dòng)劑來源分離的TLR7激動(dòng)劑一般是純化的，例如純化的TLR7激動(dòng)劑的純度為至少約80 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約98 %、至少約99 %或高于99 %。合成的TLR7激動(dòng)劑通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備，純度一般為至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或高于99%。
[0094]TLR7激動(dòng)劑包括不附著到任何其他化合物上的TLR7激動(dòng)劑。合適的TLR7激動(dòng)劑包括共價(jià)或非共價(jià)附著到另一化合物上的TLR7激動(dòng)劑。在一些實(shí)施方案中，TLR7激動(dòng)劑直接附著到另一化合物上。在另一些實(shí)施方案中，TLR7激動(dòng)劑通過接頭附著到另一化合物上。
[0095]TLR7配體包括咪唑喹啉化合物；鳥苷類似物；嘧啶化合物，如溴匹立明和溴匹立明類似物等。起TLR7配體功能的咪唑喹啉化合物包括但不限于咪喹莫特(也稱為Aldara、R-837、S-26308)和R-848 (也稱為瑞喹莫德，S-28463 ;具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu):4_氨基-2-乙氧基甲基-α, α - 二甲基-1H-咪唑[4，5_c]喹啉_1_乙醇)。合適的咪唑喹啉劑包括咪唑喹啉胺、咪唑并吡啶胺、6，7-稠合的環(huán)烷基咪唑并吡啶胺和1，2橋接的咪唑喹啉胺。已經(jīng)在美國(guó)專利 4，689，338,4, 929，624,5, 238，944,5, 266，575,5, 268，376,5, 346，905,5, 352，784、5，389，640,5, 395，937,5, 494，916,5, 482，936,5, 525，612,6, 039，969 和 6，110，929 中描述了這些化合物。適用于本發(fā)明方法中的咪唑喹啉劑的具體種類包括R_848(S-28463)；4-氨基-2乙氧基甲基-a, a-二甲基-1H-咪唑[4，5_c]喹啉_s_1-乙醇；和1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺(R-837或咪喹莫特)。還適合使用的是化合物4-氨基-2-(乙氧基甲基)-a，a-二甲基-6，7，8，9-四氫_1H_咪唑[4，5_c]喹啉_1_乙醇水合物(參閱例如，BM-003, Gorden 等(2005)。
[0096]合適的化合物包括2-氨基吡啶與五員含氮雜環(huán)稠合的那些化合物。此類化合物包括如咪唑喹啉胺，包括但不限于取代的咪唑喹啉胺，例如酰胺取代的咪唑喹啉胺、磺酰胺取代的咪唑喹啉胺、尿素取代的咪唑喹啉胺、芳基醚取代的咪唑喹啉胺、雜環(huán)醚取代的咪唑喹啉胺、氨基醚取代的咪唑喹啉胺、磺酰胺醚取代的咪唑喹啉胺、尿素取代的咪唑喹啉醚、硫醚取代的咪唑喹啉胺，和6-、7-、8_或9-芳基或雜芳基取代的咪唑喹啉胺；四氫咪唑喹啉胺，包括但不限于酰胺取代的四氫咪唑喹啉胺、磺酰胺取代的四氫咪唑喹啉胺、尿素取代的四氫咪唑喹啉胺、芳基醚取代的四氫咪唑喹啉胺、雜環(huán)醚取代的四氫咪唑喹啉胺、氨基醚取代的四氫咪唑喹啉胺、磺酰胺醚取代的四氫咪唑喹啉胺、尿素取代的四氫咪唑喹啉醚和硫醚取代的四氫咪唑喹啉胺；咪唑并吡啶胺包括但不限于酰胺取代的咪唑并吡啶胺、磺酰胺取代的咪唑并吡啶胺、尿素取代的咪唑并吡啶胺、芳基醚取代的咪唑并吡啶胺、雜環(huán)醚取代的咪唑并吡啶胺、氨基醚取代的咪唑并吡啶胺、磺酰胺醚取代的咪唑并吡啶胺、尿素取代的咪唑并吡啶醚和硫醚取代的咪唑并吡啶胺；1，2-橋接咪唑喹啉胺；6，7-稠合的環(huán)烷基咪唑并吡啶胺；咪唑并萘啶胺；四氫咪唑并萘啶胺；p惡唑并喹啉胺；噻唑并喹啉胺^惡唑并吡啶胺；噻唑并吡啶胺惡唑并萘啶胺；噻唑并萘啶胺；和與吡啶胺稠合的IH-咪唑二聚體、喹啉胺、四氫喹啉胺、萘啶胺和四氫萘啶胺。
[0097]化合物包括取代的咪唑喹啉胺、四氫咪唑喹啉胺、咪唑并吡啶胺、I，2-橋接的咪唑喹啉胺、6，7-稠合的環(huán)烷基咪唑并吡啶胺、咪唑并萘啶胺、四氫咪唑萘啶胺、0惡唑并喹啉胺、噻唑并喹啉胺、P惡 I唑并吡啶胺、噻唑并吡啶胺、P惡I唑并萘啶胺和噻唑并萘啶胺。
[0098]如本文所用，取代的咪唑喹啉胺指酰胺取代的咪唑喹啉胺、磺酰胺取代的咪唑喹啉胺、尿素取代的咪唑喹啉胺、芳基醚取代的咪唑喹啉胺、雜環(huán)醚取代的咪唑喹啉胺、氨基醚取代的咪唑喹啉胺、磺酰胺醚取代的咪唑喹啉胺、尿素取代的咪唑喹啉醚、硫醚取代的咪唑喹啉胺，或6-、7-、8_或9-芳基或雜芳基取代的咪唑喹啉胺。
[0099]發(fā)揮TLR7配體功能的鳥苷類似物包括某些C8-取代的和N7，C8- 二取代的鳥嘌呤核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸，包括但不限于羅唑利賓(7-烯丙基-8-氧鳥苷)、7_硫代-8-氧鳥苷(TOG)、7_脫氮鳥苷和7-脫氮脫氧鳥苷(Lee等，2003)。在參考文獻(xiàn)中描述了溴匹立明(PNU-54461) (5-鹵代-6-苯基嘧啶酮)和溴匹立明類似物，并且其也適合使用。參閱如Vroegop等(1999)。合適的C8取代鳥苷的額外實(shí)例包括但不限于，8-巰基鳥苷、8-溴代鳥苷、8_甲基鳥苷、8_氧代-7,8- 二氫鳥苷、C8-芳氨基-2’ -脫氧鳥苷、C8-丙塊基鳥苷、C8-和N7-取代的鳥嘌呤核糖核苷，如7-烯丙基-8-氧鳥苷(羅唑利賓)和7-甲基_8_氧鳥苷、8_氨基鳥苷、8_羥基-2’ -脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷。
[0100]在一些實(shí)施方案中，取代的鳥嘌呤TLR7配體是單體。在另一些實(shí)施方案中，取代的鳥嘌呤TLR7配體是多聚的。因此，在一些實(shí)施方案中，TLR7配體具有通式:(B) q，其中B是取代的鳥嘌呤TLR7配體，q是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。多聚TLR7配體中的各TLR7配體單體直接或通過接頭與另一配體共價(jià)或非共價(jià)連接。合適的TLR7激動(dòng)劑包括如美國(guó)專利公開2004 / 0162309中描述的TLR7配體。
[0101 ] 在一些實(shí)施方案中，TLR7激動(dòng)劑是選擇性TLR7激動(dòng)劑，例如所述激動(dòng)劑通過TLR7調(diào)節(jié)細(xì)胞活性，但不通過TLR8調(diào)節(jié)細(xì)胞活性。TLR7選擇性激動(dòng)劑包括在美國(guó)專利公開2004 / 0171086中顯示的那些。此類TLR7選擇性激動(dòng)劑化合物包括但不限于，#-{4_[4_氨基-2-(2-甲氧基乙基)-6，7，8，9-四氫-1H-咪唑[4，5_c]喹啉-1-基]丁基}-4-氟-1-苯磺酰胺、N1-[4-(4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1Η-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)丁基]-4-氟-1-苯磺酰胺、N-[4-(4-氨基-2-丙基-1H-咪唑[4，5_c]喹啉-1-基)丁基]甲磺酰胺、N-{3-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基]-2，2-二甲丙基}苯甲酰胺、N-(2-{2-[4-氨基-2-(2-甲氧乙基)-1Η-咪唑[4，5_c]喹啉-1-基]乙氧基}乙基)-N-甲基甲磺酰胺、N-(2-{2-[4-氨基-2-(2-甲氧乙基)_6，7，8，9-四氫-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基]乙氧基}乙基)苯甲酰胺、N-[4-(4-氨基-2-甲基-1H-咪唑基[4，5-c]喹啉基-1-基)丁基]環(huán)戊甲酰胺、1-[4-(1，1_ 二氧異噻唑烷-2-基)丁基]-2-(2-甲氧基乙基)-1Η-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺、2-甲基_1_[5_甲基磺?；鵠戊基-6，7，8，9-四氫-1H-咪唑[4，5-c]喹啉_4_胺、N-{2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)_6，7- 二甲基-1H-咪唑[4，5-c]吡啶-1-基]-1，1- 二甲基乙基}-N-環(huán)己基脲、N-[2-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)_1，1-二甲基乙基]苯甲酰胺、N-[3-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)-2，2-二甲基丙基]甲磺酰胺、1_[6_(甲磺?；?己基]_6，7-二甲基-2-丙基-1H-咪唑[4，5-c]吡啶_4_胺、6-(6-氨基-2-丙基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)-N-甲氧基-N-甲基己酰胺、1-[2，2-二甲基-3-(甲磺?；?丙基]-2-(乙氧基甲基)-1Η-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺、N-[4-(4-氨基-2-甲基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)丁基]-N-甲基-N-苯脲、1-{3-[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-8-基]苯基}乙酮、7-(4-氨基-2-丙基-1H-咪唑[4，5_c]喹啉-1-基)-2-甲基庚-2-醇、N-甲基-4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑[4，5_c]喹啉-1-基)丁烷-1-磺酰胺、N-(4-甲氧基芐基)-4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑[4，5_c]喹啉-1-基)丁烷-1-磺酰胺、N-{2-[4`-氨基-3-(乙氧基甲基)_6，7-二甲基-1H-咪唑基[4，5_c]吡啶-1-基]-1，1-二甲基乙基}甲磺酰胺、2-乙氧甲基-1-(3-甲氧基丙基)-7-(5-羥甲基吡啶-3-基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺、1-[ (2，2- 二甲基-1，3- 二氧戊環(huán)_4_基)甲基]-2-(乙氧基甲基)-7-(批啶-3-基)-1Η-咪唑[4，5-c]喹啉_4_胺、4-[3_(4_氨基-6，7-二甲基-2-丙基-1!1-加^11匕0[4，5-(3]吡啶_1_基)丙烷_1_磺?；鵠-苯甲酸乙酯、2-丁基-1-{2-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]乙基}-1Η-咪唑[4，5-c]喹啉_4_胺、N-(2-{4-氨基-2-乙氧基甲基_7-[6-(甲磺?；被?己氧基]-1H-咪唑[4，5_c]喹啉-1-基} -1，1- 二甲基乙基)甲磺酰胺、N- (6- {[4-氨基-2-乙氧基甲基-1- (2-甲磺?；被?2-甲基丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-7-基]氧基}己基)乙酰胺、1-[4-(I，1-二氧異噻唑啉-2-基)丁基]-2-乙氧基甲基-7-(吡啶-3-基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉_4_胺、1-[4- (I，1- 二氧異噻唑啉-2-基)丁基]-2-乙氧基甲基-7-(吡啶-4-基)-1H-咪唑[4, 5-c]喹啉-4-胺、l-[4-(l，l-二氧異噻唑啉-2-基)丁基]_2_乙氧基甲基_7_苯基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺、2-(乙氧基甲基)-1_{[1-(甲基磺酰基)哌啶_4_基]甲基}-7_(吡啶-3-基)-1Η-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺、2-(乙氧基甲基)_1_[ (1_異丁基哌啶-4-基)甲基]-7-(吡啶-3-基)-lH-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺、2-(乙氧基甲基)-1_{[1-(嗎啉-4-基羰基)哌啶-4-基]甲基}-7-(吡啶-3-基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺、環(huán)丙烷酸[3-(4-氨基-2-丙基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)丙氧基]酰胺、異丙基氨基甲酸4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1_丙基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-7-基酯、4-(4-氨基-2-丙基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)丁酸乙酯、1-[4-氨基-2-乙基-7-(吡啶-3-基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇、1-(4-氨基-2-乙基-7_[5-{羥甲基}吡啶-3-基]-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙_2_醇、1-(3-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-8-(吡啶-3-基)-1H-咪唑[4，5_c]喹啉-1-基]丙基)吡咯烷-2-酮、N-(2-{4-氨基-2-乙氧基甲基-7-[6-(甲磺酰基氨基)己氧基]-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基}_1，1-二甲基乙基)乙酰胺、1-{3-[4_氨基-7-(3-羥甲基苯基)-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基]丙基}吡咯烷-2-酮、N-{4-[4-氨基-2-乙氧基甲基-7-(吡啶-3-基)-lH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基]丁基}_N’ -丙基脲、N-{4-[4-氨基-2-乙氧基甲基-7-(吡啶-3-基)-1H-咪唑[4，5_c]喹啉-1-基]丁基} 丁酰胺、5-(4-氨基-2-丙基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)-4,4-二甲基戊-2-酮、1-環(huán)己基甲基-2-乙氧基甲基-7-(5-羥甲基吡啶-3-基)-lH-咪唑[4，5-c]喹啉_4_胺、N，N-二甲基-5-(4-氨基-2-乙氧基甲基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)戊烷_1_磺酰胺、N-{3-[(4-氨基-2-乙氧基甲基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)氨基]丙基}甲磺酰胺和/或N，N-二甲基-4-(4-氨基-2-乙氧基甲基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)丁燒-1-磺酰胺。
[0102]其他合適的TLR7選擇性激動(dòng)劑包括但不限于2_(乙氧基甲基)_1_(2_甲基丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺(美國(guó)專利5，389，640) ;2-甲基-1- [2- (3-吡啶-3-基丙氧基)乙基]-1H-咪唑[4, 5-c]喹啉-4-胺(W002 / 46193) ;N_ (2-{2-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-lH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基]乙氧基}乙基)-N-甲基環(huán)己烷羧酰胺(美國(guó)專利公開2004 / 0171086) ;1_[2_(苯甲氧基)乙基]-2-甲基-1H-咪唑[4，5_c]喹啉_4_胺(W002 / 46189) #-{8-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-111-咪唑[4，5-(3]喹啉-1-基]辛基}-N-苯脲(美國(guó)專利公`開2004 / 0171086 (IRM5)) ;2_ 丁基_1-[5_(甲基磺?；?戊基]-1H-咪唑[4, 5-c]喹啉-4-胺(W002 / 46192) ;N_ {3-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基]丙基}-4_甲基苯磺酰胺(美國(guó)專利6，331，539);和N-[4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)丁基]環(huán)己烷羧酰胺(美國(guó)專利公開2004 / 0171086 (IRM8))。也適合使用的是TLR7選擇性激動(dòng)劑N-[4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)丁基_]甲磺酰胺(Gorden等，2005)。
[0103]TLR8激動(dòng)劑.合適的TLR8激動(dòng)劑包括分離的天然TLR8激動(dòng)劑；和合成的TLR8激動(dòng)劑。從天然的TLR8激動(dòng)劑來源分離的TLR8激動(dòng)劑一般是純化的，例如純化的TLR8激動(dòng)劑的純度為至少約80 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約98 %、至少約99 %或高于99 %。合成的TLR8激動(dòng)劑通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備，純度一般為至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或高于99%。
[0104]TLR8激動(dòng)劑包括不附著到任何其他化合物上的TLR8激動(dòng)劑。TLR8激動(dòng)劑包括共價(jià)或非共價(jià)附著到另一化合物上的TLR8激動(dòng)劑。在一些實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑直接附著到另一化合物上。在另一些實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑通過接頭附著到另一化合物上。[0105]TLR8激動(dòng)劑包括但不限于諸如R-848及其衍生物和類似物的化合物。合適的TLR8激動(dòng)劑包括具有與五員含氮雜環(huán)稠合的2-氨基吡啶的化合物。此類化合物包括如咪唑喹啉胺，包括但不限于取代的咪唑喹啉胺，例如酰胺取代的咪唑喹啉胺、磺酰胺取代的咪唑喹啉胺、尿素取代的咪唑喹啉胺、芳基醚取代的咪唑喹啉胺、雜環(huán)醚取代的咪唑喹啉胺、氨基醚取代的咪唑喹啉胺、磺酰胺醚取代的咪唑喹啉胺、尿素取代的咪唑喹啉醚、硫醚取代的咪唑喹啉胺，和6-、7-、8_或9-芳基或雜芳基取代的咪唑喹啉胺；四氫咪唑喹啉胺，包括但不限于酰胺取代的四氫咪唑喹啉胺、磺酰胺取代的四氫咪唑喹啉胺、尿素取代的四氫咪唑喹啉胺、芳基醚取代的四氫咪唑喹啉胺、雜環(huán)醚取代的四氫咪唑喹啉胺、氨基醚取代的四氫咪唑喹啉胺、磺酰胺醚取代的四氫咪唑喹啉胺、尿素取代的四氫咪唑喹啉醚和硫醚取代的四氫咪唑喹啉胺；咪唑并吡啶胺，包括但不限于酰胺取代的咪唑并吡啶胺、磺酰胺取代的咪唑并吡啶胺、尿素取代的咪唑并吡啶胺、芳基醚取代的咪唑并吡啶胺、雜環(huán)醚取代的咪唑并吡啶胺、氨基醚取代的咪唑并吡啶胺、磺酰胺醚取代的咪唑并吡啶胺、尿素取代的咪唑并吡啶醚和硫醚取代的咪唑并吡啶胺；1，2-橋接的咪唑喹啉胺；6，7-稠合的環(huán)烷基咪唑并吡啶胺；咪唑并萘啶胺；四氫咪唑并萘啶胺；p惡唑并喹啉胺；噻唑并喹啉胺惡唑并吡啶胺；噻唑并吡啶胺P惡唑并萘啶胺；噻唑并萘啶胺；和與吡啶胺稠合的IH-咪唑二聚體、喹啉胺、四氫喹啉胺、萘啶胺或四氫萘啶胺。
[0106]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是酰胺取代的咪唑喹啉胺。在一個(gè)備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是磺酰胺取代的咪唑喹啉胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是尿素取代的咪唑喹啉胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是芳基醚取代的咪唑喹啉胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是雜環(huán)醚取代的咪唑喹啉胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是氨基醚取代的咪唑喹啉胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是磺胺醚取代的咪唑喹啉胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是尿素取代的咪唑喹啉醚。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是硫醚取代的咪唑喹啉胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是6-、7-、8_或9-芳基或雜芳基取代的咪唑喹啉胺。
[0107]在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是酰胺取代的四氫咪唑喹啉胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑`是磺酰胺取代的四氫咪唑喹啉胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是尿素取代的四氫咪唑喹啉胺。
[0108]在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是芳基醚取代的四氫咪唑喹啉胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是雜環(huán)醚取代的四氫咪唑喹啉胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是氨基醚取代的四氫咪唑喹啉胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是磺酰胺醚取代的四氫咪唑喹啉胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是尿素取代的四氫咪唑喹啉醚。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是硫醚取代的四氫咪唑喹啉胺。
[0109]在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是酰胺取代的咪唑并吡啶胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是磺酰胺取代的咪唑并吡啶胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是尿素取代的咪唑并吡啶胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是芳基醚取代的咪唑并吡啶胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是雜環(huán)醚取代的咪唑并吡啶胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是氨基醚取代的咪唑并吡啶胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是磺酰胺醚取代的咪唑并吡啶胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是尿素取代的咪唑并吡啶醚。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是硫醚取代的咪唑并吡啶胺。[0110]在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是1，2-橋接咪唑喹啉胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是6，7-稠合的環(huán)烷基咪唑并吡啶胺。
[0111]在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是咪唑并萘啶胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是四氫咪唑并萘啶胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是p惡唑并喹啉胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是噻唑并喹啉胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是p惡唑并吡啶胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是噻唑并吡啶胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是P惡唑并萘啶胺。在另一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是噻唑并萘啶胺。
[0112]在又一備選實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是與吡啶胺稠合的IH-咪唑二聚體、喹啉胺、四氫喹啉胺、萘啶胺或四氫萘啶胺。
[0113]在一些實(shí)施方案中，TLR8激動(dòng)劑是選擇性TLR8激動(dòng)劑，例如所述激動(dòng)劑通過TLR8調(diào)節(jié)細(xì)胞活性，但不通過TLR7調(diào)節(jié)細(xì)胞活性。TLR8選擇性激動(dòng)劑包括在美國(guó)專利公開2004 / 0171086中顯示的那些。此類TLR8選擇性激動(dòng)劑化合物包括但不限于美國(guó)專利公開2004 / 0171086中顯示的化合物，其包括N-{4-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-1-基]丁基}喹啉-3-羧酰胺、N-{4-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基]丁基}喹喔啉-2-羧酰胺、和N-[4-(4-氨基-2-丙基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)丁基]嗎啉-4-羧酰胺。
[0114]其他合適的TLR8選擇性激動(dòng)劑包括但不限于2-丙基噻唑[4，5-c]喹啉_4_胺(美國(guó)專利 6，110,929) #-[2-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑[4，5_c][l，5]萘啶 _1_ 基)乙基]-2-氨基-4-甲基戊酰胺(美國(guó)專利6，194, 425) #-[4-(4-氨基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)丁基] -2-苯氧基-苯甲酰胺(美國(guó)專利6，451，810) #-[2-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)乙基]-1-丙磺酰胺(美國(guó)專利6，331，539)；N-{2-[2-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)乙氧基]乙基}_N’ -苯脲(美國(guó)專利公開2004 / 0171086) ;1-{4_[3，5-二氯苯基]硫基} 丁基)-2-乙基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺(美國(guó)專利公開2004 / 0171086) ;N-{2_[4-氨基_2_(乙氧基甲基)-lH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基]乙基}_N’-(3-氰基苯基)尿素(W000 / 76518和美國(guó)專利
【發(fā)明者】伯頓·迪基, 邁克爾·圖維姆, 斯科特·埃文斯 申請(qǐng)人:德克薩斯大學(xué)系統(tǒng)董事會(huì)