可降解tpgs-pei接枝聚合物、制備方法及在基因藥物傳遞中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥用高分子材料研究領(lǐng)域，具體涉及一種能傳輸基因藥物的可降解d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯-聚乙烯亞胺(TPGS-PEI)接枝聚合物、制備方法和及其在基因傳遞中的應(yīng)用。將偶聯(lián)劑二異氰酸酯與d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯(TPGS)溶于有機(jī)溶劑中，制備活化的TPGS單端基異氰酸酯。將溶有聚乙烯亞胺(PEI)的有機(jī)溶液加入到活化后的TPGS單端基異氰酸酯溶液中，形成接枝聚合物。所述的聚合物是一種聚陽離子基因載體，集成了聚乙烯亞胺(PEI)和TPGS的優(yōu)點(diǎn)，其中d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯分子量為500-3000，聚乙烯亞胺段的分子量為600-25000。所述的聚合物轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性小，細(xì)胞存活率80％以上。
【專利說明】可降解TPGS-PEI接枝聚合物、制備方法及在基因藥物傳遞中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥用高分子材料研究領(lǐng)域，具體涉及可降解d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯-聚乙烯亞胺(TPGS-PEI)接枝聚合物、制備方法及其在基因傳遞中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著基因治療的不斷深入，非病毒基因載體的研究近年來取得了很大進(jìn)展。聚乙烯亞胺(Po lyethylenimine, PEI)是目前研究最為廣泛的陽離子多聚物非病毒基因載體。1995年，Boussif等人首先成功報(bào)道了 PEI作為非病毒基因載體，該聚合物具有獨(dú)特的“質(zhì)子海綿效應(yīng)，，能夠?qū)崿F(xiàn)高效的基因傳遞。(Proceedings of the National Academy ofSciences92 (16)，7297-7301，1995)。
[0003]PEI高效的轉(zhuǎn)染效率原因有兩方面:一方面是由于其較高的電荷密度。PEI主鏈3個(gè)原子中就含有一個(gè)N原子，氨基質(zhì)子化后有利于壓縮DNA，在低氮磷比(N / P)比即獲得最佳最佳轉(zhuǎn)染效率；另一方面得益于它具有較好的質(zhì)子緩沖能力，能夠從內(nèi)涵體中逃逸出來。在生理pH值條件下，PEI中大約有80%的氨基沒有質(zhì)子化，隨著pH的降低，PEI上未質(zhì)子化的氨基會逐步質(zhì)子化，進(jìn)而破壞內(nèi)涵體和溶酶體的膜結(jié)構(gòu)，使復(fù)合物迅速逃離進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中(CHIMIA:1nternational Journal for Chemistry51 (1-2), 34-36,1997 ；Journalof Gene Medicine7(5),657-663, 2005)[0004]從目前的研究結(jié)果來看，PEI的轉(zhuǎn)染性能強(qiáng)烈依賴于分子量，高分子量的PEI具有較好的轉(zhuǎn)染效率，但由于PEI強(qiáng)的滲透作用，破壞細(xì)胞的溶酶體膜，顯出細(xì)胞毒性；而低分子量PEI 毒性雖小，但卻轉(zhuǎn)染效率低下(Journal of Gene Medicine7 (8)，992-1009，2005)。作為金標(biāo)準(zhǔn)的PEI25k(Mn=2.5X IO4Da)雖然具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但細(xì)胞毒性及其不可降解性大大限制了其應(yīng)用。
[0005]為了解決此困難，科學(xué)研究者做了大量的PEI修飾和改性的工作。近年來已有研究證實(shí)，對PEI進(jìn)行聚乙二醇(PEG)修飾后可明顯提高PE1-DNA的溶解性，屏蔽復(fù)合物表面的正電荷，降低細(xì)胞毒性，延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間(Macromolecules35 (18) ,6867-6874，2002)。但米用聚乙二醇1000維生素E玻拍酸酯(D- a -tocopherol polyethyleneglycollOOOsuccinate, TPGS)修飾PEI的接枝聚合物則未見文獻(xiàn)報(bào)道。
[0006]TPGS是天然維生素E的水溶性衍生物，由維生素E琥珀酸酯(vitamin Esuccinate, VES)的羧基與聚乙二醇 1000 (polyethylene glycollOOO, PEG1000)酯化而成。因此，在用作各種藥物載體的過程中，同時(shí)具有PEG及維生素E的優(yōu)點(diǎn)，包括:可以延長藥物在血漿中的半衰期，提高藥物的細(xì)胞攝取率等。TPGS的兩親性質(zhì)和較大的分子表面積，使其成為出色的非離子表面活性劑。被FDA批準(zhǔn)用作制劑中的增溶劑、吸收促進(jìn)劑、乳化劑、增塑劑等。另外，TPGS可以抑制P-糖蛋白的外排作用，提高受P-糖蛋白阻滯的藥物的生物利用度，并能有效克服腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性(multidrugresistance, MDR)(Biomaterials2012,33(19)，4889-4906.)[0007]本領(lǐng)域目前需要得到具有較高的轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞毒性低且可以降解的修飾改性的聚乙烯亞胺(PEI)作為基因藥物載體材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種d-alpha-生育酚琥珀酸聚7 二醇酯接枝聚乙烯亞胺(TPGS-PEI)聚合物、制備方法及其在基因傳遞中的應(yīng)用。所合成的d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯-聚乙烯亞胺(TPGS-PEI)接枝聚合物為可降解陽離子聚合物，未見文獻(xiàn)報(bào)道。
[0009]TPGS-PEI接枝聚合物兼具了 PEI與TPGS的優(yōu)點(diǎn)，其分子電荷密度較高，對基因物質(zhì)負(fù)載能力強(qiáng)，具有良好的生物相容性，克服了 PEI均聚物高毒性、不可降解性的缺點(diǎn)。同時(shí)，本發(fā)明中的d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯(TPGS)-聚乙烯亞胺(PEI)接枝聚合物(TPGS-PEI)具有兩親性質(zhì)，帶有一個(gè)小的疏水的頭部(VE)(約5% )，親水性的聚乙二醇鏈(PEG) (15~20% )及聚乙烯亞胺(PEI) (70~80% )部分。因此新形成的接枝聚合物(TPGS-PEI)具有自乳化功能，在溶液中可以形成自組裝顆粒。以其作為基因藥物載體可以實(shí)現(xiàn)藥物的PH響應(yīng)快速釋放及其TPGS對P-糖蛋白抑制的協(xié)同作用，從而顯著地提高細(xì)胞毒性，尤其對癌癥治療過程中的多藥耐藥(MDR)的細(xì)胞。
[0010]所述的TPGS-PEI接枝聚合物的結(jié)構(gòu)式如下:
[0011]
【權(quán)利要求】
1.可降解TPGS-PEI接枝聚合物，其特征在于:由d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯(TPGS)偶聯(lián)聚乙烯亞胺(PEI)而得到的接枝聚合物，該聚合物的結(jié)構(gòu)式如下:
2.權(quán)利要求1所述的可降解TPGS-PEI接枝聚合物的制備方法，其特征在于步驟和條件如下: (1)d-alpha-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯(TPGS)的異氰酸酯活化 將TPGS先冷凍干燥脫水處理4h，按照TPGS的質(zhì)量e，與有機(jī)溶劑的體積(mL)的配比I~5:10~20，將TPGS用有機(jī)溶劑溶解并投料到反應(yīng)容器中，攪拌溶解，其中有機(jī)溶劑選擇氯仿或二氯甲烷；再按照TPGS與偶聯(lián)劑二異氰酸酯的摩爾配比為I~5:10~20將二異氰酸酯也加入到反應(yīng)容器中，控溫O~70°C攪拌反應(yīng)至少16小時(shí)，反應(yīng)完后所得產(chǎn)物在石油醚中沉淀，沉淀用氯仿溶解，再用石油醚沉淀，此操作重復(fù)多次直至將過量的偶聯(lián)劑二異氰酸酯去除干凈，真空干燥，得異氰酸酯活化的TPGS ； (2)按照異氰酸酯活化的TPGS(TPGS-NCO)的質(zhì)量e，與有機(jī)溶劑的體積(mL)的配比I~5:10~50，將TPGS-NCO用有機(jī)溶劑溶解并投料到反應(yīng)容器中，其中有機(jī)溶劑選擇氯仿或二氯甲烷；按照TPGS中的羥基與聚乙烯亞胺的摩爾配比為2:1~30:1，取聚乙烯亞胺(PEI)于另一干燥反應(yīng)器中，并按照聚乙烯亞胺的質(zhì)量f與有機(jī)溶劑的體積mL的配比1:10~1:100，加入無水有機(jī)溶劑溶解，并將溶解均勻的聚乙烯亞胺的溶液移至恒壓滴液漏斗中；將恒壓滴液漏斗中的聚乙烯亞胺的反應(yīng)液直接滴加到含TPGS-NCO的溶液中，至少30分鐘滴加完畢，滴加過程中反應(yīng)器保持冰浴并攪拌，滴加完畢后，控溫反應(yīng)O~60°C繼續(xù)攪拌反應(yīng)2~72小時(shí)，反應(yīng)完成后在乙醚中沉降，沉降混合液靜置后，傾去上清液，保留沉淀于底部的產(chǎn)物，干燥，得到TPGS-PEI接枝聚合物。
3.權(quán)利要求1所述的可降解TPGS-PEI接枝聚合物在基因傳遞中的應(yīng)用，其特征在于:可降解TPGS-PEI接枝聚合物在體外轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的可降解TPGS-PEI接枝聚合物在基因傳遞中的應(yīng)用，其特征在于，其用法的步驟和條件如下:’ (1)細(xì)胞的培養(yǎng) 細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37°C含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)； (2)體外轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24小時(shí)內(nèi)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后用達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋，按每孔IX IO4細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37°C含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80~90%，轉(zhuǎn)染時(shí)，吸棄前一天加注的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒以及無血清或者含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基至終體積200 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)； (3)體外轉(zhuǎn)染效率的測定 取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，用照度計(jì)測定轉(zhuǎn)染效率； (4)細(xì)胞毒性測試 采用噻唑藍(lán)比色法比較評價(jià)基因載體材料的細(xì)胞毒性； 實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)內(nèi)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后用達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋，按每孔IX IO4細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37°C含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度到達(dá)80~90%，將不同濃度的材料與細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔分別加入20 μ I含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%噻唑藍(lán)的磷酸鹽緩沖液，混合物在37°C繼續(xù)作用4小時(shí)，加入200 μ I 二甲基亞砜溶解噻唑藍(lán)甲臢結(jié)晶10分鐘，然后用酶標(biāo)儀測試每孔的吸收，測試波長選用492nm，細(xì)胞存活率按下公式計(jì)算: 細(xì)胞存活率) = (AsampleAcontrol) XlOO Asample是轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞樣品孔的吸收，Arantajl是不與復(fù)合物溶液作用的細(xì)胞樣品孔的吸收，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
5.權(quán)利要求1中所述的可降解TPGS-PEI接枝聚合物在基因傳遞中的應(yīng)用，其特征在于，可降解TPGS-PEI接枝聚合物在體內(nèi)轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的可降解TPGS-PEI接枝聚合物在在基因傳遞中的應(yīng)用，其特征在于，其用法的步驟和條件如下: 取5周的巴比賽裸鼠，在腹側(cè)皮下接種人宮頸癌上皮細(xì)胞的細(xì)胞株，待腫瘤直徑長至0.4cm后，隨機(jī)分為兩組，每組6只，分別在瘤內(nèi)注射含5 μ g熒光素酶質(zhì)粒的基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒溶液100 μ 1，第二天重復(fù)注射一次，注射后48小時(shí)，用精諾真活體成像儀觀測體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果，在進(jìn)行活體成像觀察之前，將小鼠麻醉，麻醉5分鐘后，向小鼠體內(nèi)注入200 μ I熒光素酶底物，10分鐘后，用活體成像系統(tǒng)觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。
【文檔編號】A61K48/00GK103627006SQ201310586204
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】趙寶娟, 潘杰, 李鳳娟, 王翔, 韓長秀 申請人:天津工業(yè)大學(xué)