楊梅素在制備BMP-Smad通路小分子抑制劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了楊梅素在制備BMP-Smad通路小分子抑制劑中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小分子楊梅素能顯著抑制Smad1/5/8的磷酸化水平，進(jìn)而抑制住BMP-Smad介導(dǎo)的下游信號(hào)通路。基于其天然、綠色、安全的特性，楊梅素為因BMP-Smad紊亂引起的疾病治療提供了可能，特別在相關(guān)疾病的臨床藥物開(kāi)發(fā)有著潛在的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】楊梅素在制備BMP-Smad通路小分子抑制劑中的應(yīng)用
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及楊梅素在制備BMP-Smad通路小分子抑制劑中的應(yīng)用。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogehetic proteins, BMPs)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-ρ(transforming growth factor-β , TGF-β )超家族的一員，最初從礦化的骨骼中提取出來(lái)，并發(fā)現(xiàn)其能夠誘導(dǎo)異位骨的生長(zhǎng)。BMPs是分泌型蛋白，存在于細(xì)胞外，并且可以在血清中檢測(cè)到。細(xì)胞外的BMPs與細(xì)胞膜上的BMP受體(BMPR)結(jié)合后導(dǎo)致受體激酶的激活，活化的受體會(huì)磷酸化細(xì)胞內(nèi)的Smadl/5/8,其與Smad4形成復(fù)合物后進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合到DNA序列上，從而調(diào)節(jié)BMP靶基因的轉(zhuǎn)錄。BMP-Smad信號(hào)通路受到多種機(jī)制的精細(xì)調(diào)節(jié)，尤其是受到一些負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，如受體的內(nèi)吞，Smads的去磷酸化和信號(hào)分子的降解等。
[0003]BMP-Smad信號(hào)通路調(diào)節(jié)干細(xì)胞的自我更新和分化，細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡，以及胚胎發(fā)育和出生后組織體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持。BMP-Smad信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生中也起著十分重要的作用。最近越來(lái)越多的人和小鼠的遺傳學(xué)研究已證明，BMP-Smad的自我平衡在機(jī)體的生理過(guò)程中扮演著重要的角色，如在骨代謝、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、鐵代謝以及腫瘤的形成中起著重要作用。因此，無(wú)論是增強(qiáng)或抑制BMP-Smad都有著重要的生理意義及應(yīng)用，尤其是BMP-Smad通路的小分子抑制劑在干細(xì)胞研究、骨骼重塑治療、異位骨化以及鐵代謝治療方面有著潛在的意義。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供楊梅素在制備BMP-Smad通路小分子抑制劑中的應(yīng)用，為防治BMP-Smad紊亂引起的疾病提供新的藥物。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0006]楊梅素在制備BMP-Smad通路小分子抑制劑中的應(yīng)用。
[0007]楊梅素是一種天然的黃酮醇，是存在于許多水果、蔬菜、漿果及藥材等植物中的黃酮類化合物。楊梅素是紅葡萄酒中的酚類化合物之一。楊梅素可抗氧化。體外研究表明，高濃度的楊梅素可降低低密度脂蛋白膽固醇。芬蘭的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，高楊梅素?cái)z入的人群其前列腺癌的發(fā)生率較低。一項(xiàng)歷時(shí)8年的研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚、槲皮素和楊梅素可降低吸煙者患胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。目前，楊梅素被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健品和化妝品。美國(guó)保健品藥FYI使用楊梅素用作治療預(yù)防關(guān)節(jié)炎和各種炎癥，尤其對(duì)懷孕婦女和哺乳期嬰兒適合使用。
[0008]此前，在人源肝癌細(xì)胞H印G2中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)小分子楊梅素能顯著抑制BMP-Smad通路下游基因鐵調(diào)素Hepcidin的表達(dá)?；诖?，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，楊梅素能在體外顯著降低Smadl/5/8信號(hào)通路的磷酸化水平， 進(jìn)而抑制住下游通路基因的轉(zhuǎn)錄，并呈現(xiàn)較強(qiáng)的時(shí)間、劑量依賴性。通過(guò)BMP-Smad信號(hào)通路激動(dòng)劑BMP6的刺激，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)楊梅素能顯著抑制BMP6引起的Smadl/5/8的磷酸化水平的增加。此外，通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因手段，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)楊梅素能夠顯著抑制BMP6對(duì)BMP-Smad通路下游通路基因的轉(zhuǎn)錄。[0009]綜上，小分子楊梅素能顯著抑制Smadl/5/8的磷酸化水平,進(jìn)而抑制住BMP-Smad介導(dǎo)的下游信號(hào)通路?；谄涮烊弧⒕G色、安全的特性，楊梅素為因BMP-Smad紊亂引起的疾病治療提供了可能，特別在相關(guān)疾病的臨床藥物開(kāi)發(fā)有著潛在的應(yīng)用，如抑制因鐵調(diào)素Hepcidin上升引起的鐵代謝紊亂疾??；抑制產(chǎn)后骨骼的再生成疾病、抑制異位骨化如進(jìn)行性肌肉骨化癥等骨骼性疾??；促進(jìn)如神經(jīng)元干細(xì)胞、心肌干細(xì)胞等分化及其在干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用；以及其在腫瘤方面的應(yīng)用都有著重要的意義。
[0010]具體的，所述楊梅素可用于制備防治BMP-Smad紊亂引起的疾病的藥物。
[0011]更為具體的，所述楊梅素可用于制備防治鐵代謝紊亂疾病、抑制產(chǎn)后骨骼的再生成疾病、或者進(jìn)行性肌肉骨化癥等的藥物。
[0012]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明提供了楊梅素在制備BMP-Smad通路小分子抑制劑中的應(yīng)用，基于其天然、綠色、安全的特性，為因BMP-Smad紊亂引起的疾病治療提供了可能，特別在相關(guān)疾病的臨床藥物開(kāi)發(fā)有著潛在的應(yīng)用。
(四)【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為楊梅素顯著抑制人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞Smadl/5/8的磷酸化水平；
[0014](A)不同濃度的楊梅素處理H印G2細(xì)胞，western blot檢測(cè)BMP-SMAD通路蛋白變化水平，處理時(shí)間12小時(shí)；
[0015](B)濃度為50 u g/mL楊梅素從Oh至24h處理H印G2細(xì)胞對(duì)Ifepcidin表達(dá)通路相關(guān)蛋白的影響，western blot檢測(cè)BMP-SMAD通路蛋白水平；
[0016]圖2為楊梅素顯著抑制BMP6誘導(dǎo)的BMP-Smad信號(hào)通路下游基因的表達(dá)；
[0017]A:楊梅素(50 ii g/mL)和BMP6 (10ng/mL)共處理H印G2細(xì)胞12小時(shí)，對(duì)H印G2細(xì)胞Hepcidin mRNA表達(dá)的抑制效果；
[0018]B:楊梅素(0~IOOii g/mL)和BMP6 (10ng/mL)共處理H印G2細(xì)胞12小時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞Hepcidin表達(dá)的抑制效果，western blot分析磷酸化Smadl/5/8 ；
[0019]圖3為楊梅素顯著抑制BMP6誘導(dǎo)的BMP-Smad信號(hào)通路下游基因的轉(zhuǎn)錄；
[0020]不同濃度的楊梅素(O-lOOii g/mL)和BMP6 (10ng/mL)共處理H印G2細(xì)胞24小時(shí)，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)HAMP基因的轉(zhuǎn)錄情況。
(五)【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0022]實(shí)施例1:
[0023]1.材料和方法
[0024]1.1實(shí)驗(yàn)原料制備
[0025]Myricetin購(gòu)自SIGMA公司。溶于無(wú)菌二甲基亞砜DMSO中，配置成所需濃度。人源BMP6購(gòu)自R&D Systems公司。
[0026]1.2細(xì)胞株
[0027]人肝癌細(xì)胞株IfepG2及人腎臟細(xì)胞株HEK293由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。培養(yǎng)條件:含10% FBS (GIBCO)的DMEM高糖型培養(yǎng)基(GIBCO)，37°C、5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱。
[0028]1.3RNA 提取和 Realtime-PCR
[0029]Trizol (Life Technologies)法提取細(xì)胞和組織的RNA,具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。參考其次文獻(xiàn)，NanodroplOOOSpectrophotometer 上檢測(cè) RNA 純度(0D260/0D280 ~1.9 ~
2.1)及 RNA 濃度(ng/μ 1)，調(diào)整 RNA 濃度到 I μ g/μ I。2.0 μ g RNA 經(jīng) DNase (Promega)處理后，M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)和 Oligo (dT)18primer (Takara Bio Inc.)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。CFX96Real_Time System (Bio-Rad)中進(jìn)行 Realtime PCR,檢測(cè)體積為 IOul,試劑米用iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad),引物序列如下:HAMP:
[0030]forward CAGCTGGATGCCCATGTTC
[0031]reverse CAGCAGCCGCAGCAGAA ；
[0032]ACTIN:
[0033]forward CACGGCATCGTCACCAACT
[0034]reverse CACGCAGCTCATTGTAGAAGGT ；
[0035]1.4Luciferase突光素酶報(bào)告基因檢測(cè)
[0036]按照FuGENE? HD Transfection Reagent-Promega 轉(zhuǎn)染系統(tǒng)說(shuō)明，于轉(zhuǎn)染前
I日接HEK293接種于24孔板，5 X IO4/孔，第2日當(dāng)細(xì)胞約60%融合時(shí)，更新細(xì)胞培養(yǎng)液，共同轉(zhuǎn)染HAMP-promoter2.7kb_pGL3和內(nèi)參Renilla報(bào)告基因質(zhì)粒。共轉(zhuǎn)24h后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，加藥處理不同的濃度、時(shí)間后，裂解收集細(xì)胞，離心取上清，用Dual-LuciferaseReporter Assay System 測(cè)定裂解細(xì)胞上清內(nèi) Luciferase (HAMP Luc 和 Renilla Luc)活性，計(jì)算HAMP Luc/Renilla Luc比值。每種處理各個(gè)設(shè)3復(fù)孔。
[0037]1.5ffestern blot
[0038]用含有PMSF (Sigma-Aldrich)和磷酸酶抑制劑(PhosSTOP，Roche)的 RIPA 裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)裂解細(xì)胞或組織后，提取總蛋白。細(xì)胞蛋白取30ug，肝組織蛋白取lOOug，經(jīng)10%SDS-PAGE膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，該膜與特異性抗體4°C孵育過(guò)夜。洗漆三遍，與過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(ant1-rabbit or ant1-mouse IgGl: 4000濃度稀釋，Proteintech Group)室溫孵育 I 小時(shí)后，Westernblot 試劑盒(ECL system,Pierce, ThermoScientific)顯色。
[0039]所用一抗如下:兔抗anti_pSmadl/5/8antibody (1:1000 濃度稀釋；CellSignaling Technology),兔抗 ant1-Smadlantibody (1:1000 濃度稀釋；Cell SignalingTechnology)以及鼠抗 ant1-β-actin (1:2000 濃度稀釋；Sigma-Aldrich)。
[0040]1.6統(tǒng)計(jì)方法
[0041]所用統(tǒng)計(jì)采用R軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以MeaniSD表示。細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的組間比較采用Tukey’ s檢驗(yàn)(AN0VA)，兩組間比較以Student’s t-test檢驗(yàn)，以P〈0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0042]2 結(jié)果
[0043]2.1楊梅素顯著抑制人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞Smadl/5/8的磷酸化水平
[0044]用含有PMSF (Sigma-Aldrich)和磷酸酶抑制劑(PhosSTOP，Roche)的 RIPA 裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)裂解細(xì)胞或組織后，提取總蛋白。通過(guò)western-blot，檢測(cè)信號(hào)通路BMP-SMAD表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。
[0045]Western Blot結(jié)果顯不，隨著楊梅素濃度的增加,磷酸化Smadl/5/8蛋白表達(dá)水平亦顯著降低(圖1A)，并且6小時(shí)后，Smadl/5/8蛋白磷酸化的水平顯著被抑制(圖1B)，表明楊梅素能顯著降低Smadl/5/8的磷酸化水平。
[0046]2.2楊梅素顯著抑制BMP6誘導(dǎo)的BMP-Smad信號(hào)通路下游基因的表達(dá)
[0047]BMP6是生理?xiàng)l件下最強(qiáng)的H印cidin刺激劑，為了探楊梅素對(duì)BMP6誘導(dǎo)的Hepcidin表達(dá)的抑制效果,將楊梅素(50 ii g/mL)先于BMP6 (10ng/mL)30min加入到HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)12小時(shí)后，檢測(cè)Hepcidin mRNA表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖2。
[0048]BMP6可使H印cidin mRNA表達(dá)量升高到正常值的4_5倍。楊梅素能夠減弱BMP6的刺激作用，H印cidin mRNA的表達(dá)量?jī)H為正常值的40%(圖2A)。Western Blot結(jié)果顯示，BMP6可明顯增加Smadl/5/8蛋白磷酸化水平，隨著楊梅素濃度的增加，BMP6刺激條件下的磷酸化Smadl/5/8蛋白表達(dá)水平亦顯著降低(圖2B)。
[0049]由此推測(cè)楊梅素通過(guò)祀向BMP-Smad信號(hào)通路中蛋白Smadl/5/8的磷酸化水平,進(jìn)而抑制其通路下游信號(hào)基因的水平，如鐵調(diào)素Hepcidin的表達(dá)。
[0050]2.3楊梅素顯著抑制BMP6誘導(dǎo)的BMP-Smad信號(hào)通路下游基因的轉(zhuǎn)錄
[0051]利用HEK293 細(xì)胞株，按照 FuGENE? HD Transfection Reagent-Promega 轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，共同轉(zhuǎn)染HAMP-promoter2.7kb_pGL3和內(nèi)參Renilla報(bào)告基因質(zhì)粒。共轉(zhuǎn)24h后，不同處理后，裂解收集細(xì)胞，離心取上清，用Dual-Luciferase Reporter Assay System測(cè)定裂解細(xì)胞上清內(nèi) Luciferase (HAMP Luc 和 Renilla Luc)活性，計(jì)算 HAMP Luc/RenillaLuc比值，結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0052]為了探討楊梅素對(duì)BMP誘導(dǎo)條件下，BMP-Smad通路下游基因HAMP的轉(zhuǎn)錄的抑制效果，將不同濃度的楊梅素(0-100 Ii g/mL)分別先于BMP6 (lOng/mL) 30min加入到轉(zhuǎn)染后的HEK293細(xì)胞培養(yǎng)液中，24小時(shí)后，同樣利用雙熒光素酶檢測(cè)報(bào)告基因檢。
[0053]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BMP6可使HAMP Luc相對(duì)活性升高到約為正常值的2.5倍，顯著增強(qiáng)HAMP基因的轉(zhuǎn)錄水平。不同濃度的楊梅素能夠減弱BMP6的該種刺激作用，甚至使BMP6對(duì)HAMP基因轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)作用消失(20-100 ii g/mL)，HAMP Luc相對(duì)活性約為正常值的7% (圖3)。
[0054]基于此,楊梅素可顯著抑制BMP-Smad信號(hào)通路中蛋白Smadl/5/8的磷酸化水平，進(jìn)而調(diào)控其下游信號(hào)基因的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄。
【權(quán)利要求】
1.楊梅素在制備BMP-Smad通路小分子抑制劑中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述楊梅素用于制備防治BMP-Smad紊亂引起的疾病的藥物。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述楊梅素用于制備防治鐵代謝紊亂疾病的藥物。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述楊梅素用于制備防治抑制產(chǎn)后骨骼的再生成疾病的藥物。
5.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述楊梅素用于制備防治進(jìn)行性肌肉骨化癥的藥物。
【文檔編號(hào)】A61P21/00GK103655541SQ201310572080
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】王福俤, 穆明道, 伍愛(ài)民, 杜曉利, 安鵬, 吳謙, 邵丹丹, 沈筱筠 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)