淫羊藿多糖及其組分和它們用于疫苗佐劑的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及淫羊藿的多糖提取物，具體地，本發(fā)明涉及從中藥材淫羊藿葉中提取的淫羊藿總多糖及其其中的酸性糖組分和非糖組分，以及它們用于制備疫苗佐劑、疫苗制劑、疫苗組合物或抗體的用途。本發(fā)明還涉及包含所述淫羊藿總多糖及其組分的藥物組合物、疫苗佐劑、疫苗制劑或疫苗組合物。
【專利說明】淫羊藿多糖及其組分和它們用于疫苗佐劑的用途
[0001]本申請是基于申請?zhí)枮?01110220409.0，申請日為2011年8月3日，發(fā)明名稱為“淫羊藿多糖及其組分和它們用于疫苗佐劑的用途”的中國專利申請的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及淫羊藿的多糖提取物，具體地，涉及從中藥材淫羊藿葉提取的淫羊藿總多糖及其其中的酸性糖組分和非糖組分，本發(fā)明還涉及所述的淫羊藿總多糖及其其中的酸性糖組分和非糖組分用于疫苗佐劑、疫苗組合物和抗體制備的用途。
【背景技術(shù)】
[0003]淫羊藿(Epimedium)為小檗臉科(Berberidaceae)植物,常用于補腎壯陽、祛風除濕和益氣。現(xiàn)代藥理研究表明淫羊藿具有鎮(zhèn)咳、去痰、平喘、抑菌等活性。淫羊藿中主要化學(xué)成分有黃酮、木質(zhì)素、生物堿以及多糖等。近年來有以下文獻報道有關(guān)淫羊藿多糖對動物免疫功能的影響，具體內(nèi)容如下:
[0004]徐穎等(沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2000，17 (6):434 一 437)采用淫羊藿水煎、醇沉、洗滌和透析獲得淫羊藿多糖。該多糖腹腔注射給予環(huán)磷酰胺所致的免疫低下小鼠及荷瘤(S180)小鼠，觀察對免疫功能的影響。結(jié)果表明該多糖50、25mg/kgX7d，可使脾重量指數(shù)上升，使下降的溶血素值及空斑形成細胞的溶血能力回升，使下降的白細胞總數(shù)上升。小鼠荷瘤后免疫功能低下，皮下注射該多糖50mg/kgX8d可對抗荷瘤引起的胸腺指數(shù)下降，，使荷瘤小鼠的血清溶血素、空斑形成細胞的溶血能力及遲發(fā)性超敏反應(yīng)能力有所提高.[0005]王剛等(武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003，12 (3):194 - 196)由水煎煮提取、結(jié)晶、透析48h方法獲得淫羊藿多糖。該多糖12.5、25.0和50.011^/1^連續(xù)給予荷瘤小鼠皮下注射8(1。結(jié)果表明淫羊藿多糖可顯著提高小鼠因荷瘤所導(dǎo)致的胸腺指數(shù)下降，溶血素形成減少，溶血空斑值降低以及遲發(fā)性超敏反應(yīng)低下。
[0006]靳錄洋等(甘肅畜牧獸醫(yī)，2004，28 (3):7 一 10)觀察不同濃度的淫羊藿多糖(EPS，多糖含量為32.30%)對正常羅曼雛雞免疫功能的影響。試驗結(jié)果表明EPS可使外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和ND-HI抗體效價明顯升高。羅艷等采用相同的淫羊藿多糖，探討淫羊藿多糖(EPS)對雛雞免疫功能和禽流感一新城疫重組二聯(lián)苗免疫效果的影響。結(jié)果表明不同濃度EPS均能顯著提高淋巴細胞轉(zhuǎn)化率、中性粒細胞吞噬力、A1-HI和ND-HI抗體效價、紅細胞-C3b花環(huán)率，降低紅細胞-1C花環(huán)率，且中劑量效果較好
[0007]張述斌等(甘肅畜牧獸醫(yī)，2004，28 (4):24 — 25)采用Ca (OH) 2水提取工藝制備淫羊藿多糖，苯?)—硫酸法測定糖含量為73.68%。實驗結(jié)果表明該多糖雞新城疫疫苗有明顯的免疫增強作用，用該多糖免疫后雞血清中HI抗體效價比對照雞明顯提高，而且維持時間延長。此外，T淋巴細胞ANAE陽性率與HI抗體效價有相應(yīng)的消長趨勢。
[0008]孔祥峰等(畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2004，35(4)，468-472)用新城疫IV系疫苗免疫雛雞，在免疫前、后分別注射高、低劑量淫羊藿多糖(糖含量為66.38%)，均能不同程度地提高抗體效價，且與給藥時間、劑量和免疫接種次數(shù)有一定關(guān)系。寸.fcVf/^蛋膽柃輯鋱<-1軺惡靶將坩~宕Vfz 8寸~ZT S~寸_側(cè)呎鞞頰趔_軺戩螂辰癍1/|蚺 〔￡300〕。農(nóng)資屮農(nóng)vf/趄癍靼電3嗚諜渺_臌左纏誚Ta^戩螂辰癍運蚺掃頰 〔300〕
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[0025](3)步驟I)中，加入水浸提的溫度為4~60°C，優(yōu)選為20~60°C，更優(yōu)選為20~500C。在此溫度范圍內(nèi)，不會破壞糖的性質(zhì)，且隨溫度升高，糖的得率增加。
[0026](4)步驟I)中，將浸提后得到的淫羊藿葉按照相同條件進行一次或多次浸提，合并水提液；
[0027]在本發(fā)明的一個實施方案中，進行兩次浸提。
[0028](5)步驟I)中水的用量為淫羊藿葉的5 — 20倍量(L/Kg)；
[0029](6)步驟I)中，浸提期間進行攪拌；
[0030](7)步驟I)中，將得到的水提液在50°C — 55°C下進行減壓濃縮，得到濃縮的水提液；
[0031](8)步驟2)中，乙醇沉淀的條件是:醇沉后乙醇的終濃度為60 - 80%，例如70-75% ;優(yōu)選地，醇沉的時間大于12小時，例如為48-72小時；
[0032](9)步驟2)中，將乙醇沉淀后離心得到的沉淀再進行一次或多次乙醇沉淀；
[0033](10)步驟2)中，透析所用的透析袋的截留分子量大于1000 ；
[0034](11)步驟2 )中 ，用自來水和/或蒸餾水進行透析；
[0035](12)步驟2)中，透析時間為24~72小時，透析進行一次或多次；
[0036](13)步驟3)中，在冷凍干燥之前，將得到的透析液在50°C — 55°C下進行減壓濃縮。
[0037]在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的淫羊藿多糖是通過以下方法制備的:
[0038]取淫羊藿葉，向其中加入蒸餾水浸泡，期間不時攪拌；過濾，濾液離心；浸提后的淫羊藿葉在同樣條件下進行第二次提取；合并兩次提取的水提液，減壓濃縮，然后加入3~4倍體積的乙醇進行醇沉；醇沉液離心,將沉淀部分加入水中攪拌溶解，離心，沉淀再同樣操作二次；合并溶解的上清液，裝入透析袋，截留分子量>1000，用水透析；將所得透析液減壓濃縮后，裝入小瓶進行冷凍干燥，獲得所述淫羊藿多糖。
[0039]在另一個實施方案中，本發(fā)明所述的淫羊藿多糖是通過如下方法獲得的:
[0040]取淫羊藿葉，向其中加入石油醚浸沒浸泡；過濾，將濾液減壓回收浸膏；浸提后的淫羊藿葉自然揮干后，向其中加入蒸餾水浸泡，期間不時攪拌；然后過濾，濾液離心，浸提后的淫羊藿葉在同樣條件下進行第二次提?。缓喜纱翁崛〉乃嵋?，減壓濃縮，然后加入3~4倍體積的乙醇進行醇沉；醇沉液離心，向沉淀部分中加入水攪拌溶解，離心，再將沉淀同樣操作二次；合并溶解的上清液，裝入透析袋，截留分子量>1000，用水透析；將得到的透析液減壓濃縮后，裝入小瓶進行冷凍干燥，獲得所述淫羊藿多糖。
[0041]本發(fā)明的第二方面涉及一種淫羊藿多糖，或者根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項所述的淫羊藿多糖，其特征在于
[0042](I)含糖量為25-45% (以葡萄糖計算)，糖醛酸含量為5_20% (以半乳糖醛酸計算)；和/或
[0043]( 2 )其具有附圖1和附圖2所示的特征。
[0044]在本發(fā)明的一個實施方案中，含糖量為35.60% (以葡萄糖計算)，糖醛酸含量為
7.53% (以半乳糖醛酸計算)。
[0045]本發(fā)明的第三方面涉及一種淫羊藿酸性多糖組分，其為根據(jù)本發(fā)明第一方面或第二方面任一項所述的淫羊藿多糖經(jīng)DEAE-纖維素柱層析，得到的具有硫酸-苯酚顯色、490nm波長吸收的0.25mol/L NaHCO3洗脫部分。
[0046]本發(fā)明的第四方面涉及一種淫羊藿酸性多糖組分，或者根據(jù)本發(fā)明第三方面所述的淫羊藿酸性多糖組分，其特征在于:
[0047]包含鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及半乳糖醛酸；以及，其分子量為6000~20000。
[0048]根據(jù)本發(fā)明第四方面的淫羊藿酸性多糖組分，其特征在于，
[0049](I)含糖量為45-65% (以葡萄糖計算)，糖醛酸含量為5_15% (以半乳糖醛酸計算)；和/或
[0050](2)鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的摩爾比為鼠李糖:巖藻糖:阿拉伯糖:木糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=1.00:0.33:4.44:0.38:0.64:0.87:5.26。
[0051]在本發(fā)明的一個實施方案中，含糖量為58.93% (以葡萄糖計算)，糖醛酸含量為
8.40% (以半乳糖醛酸計算)。
[0052]在本發(fā)明的實施方案中，含糖量(以葡萄糖計)的測定方法為硫酸一苯酚法；糖醛酸含量(以半乳糖醛酸計)的測定方法為間羥聯(lián)苯法。
[0053]本發(fā)明的第五方面涉及一種淫羊藿非糖組分，其為本發(fā)明第一方面或第二方面任一項所述的淫羊藿多糖經(jīng)DEAE-纖維素柱層析，得到的具有280nm吸收的0.25mol/LNaHCO3洗脫部分。
[0054]本發(fā)明的第六方面涉及一種淫羊藿非糖組分，或者根據(jù)本發(fā)明第五方面所述的淫羊藿非糖組分，其為淫羊藿多糖的非糖組分，其分子量為2000~10000。
[0055]本發(fā)明的第七方面涉及一種藥物組合物，其包含本發(fā)明第一方面至第六方面任一項的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖組分和/或淫羊藿非糖組分，以及藥學(xué)上可接受的輔料。
[0056]本發(fā)明的第八方面涉及一種疫苗佐劑，其包含本發(fā)明第一方面至第六方面任一項的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖組分和/或淫羊藿非糖組分。
[0057]本發(fā)明的第九方面涉及一種疫苗制劑或疫苗組合物，其包含本發(fā)明第一方面至第六方面任一項的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖組分和/或淫羊藿非糖組分。
[0058]本發(fā)明的第十方面涉及本發(fā)明第一方面至第六方面任一項的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖組分和/或淫羊藿非糖組分用于制備疫苗佐劑、疫苗制劑、疫苗組合物或抗體的用途。
[0059]本發(fā)明還涉及一種制備抗體的方法，其包括使用有效量的本發(fā)明第一方面至第六方面任一項的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖組分和/或淫羊藿非糖組分的步驟。
[0060]本發(fā)明還涉及一種免疫方法或者接種方法，包括給予哺乳動物有效量的疫苗制劑或疫苗組合物的步驟。
[0061]在本發(fā)明中，所述淫羊藿多糖組分是指從淫羊藿總多糖中分離得到的不同組分。在本發(fā)明的一個實施方案中，為其中的酸性糖組分，例如為YYH-Gl。在本發(fā)明的另一個實施方案中，為其中的非糖組分，例如為YYH-G4。
[0062]在本發(fā)明中，所述疫苗包括減毒疫苗、滅活疫苗、蛋白質(zhì)疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗。
[0063] 在本發(fā)明中，所述有效量是指給予哺乳動物實現(xiàn)能夠免疫效果的疫苗制劑或疫苗組合物的劑量。
[0064]發(fā)明的有益效果
[0065]本發(fā)明從淫羊藿葉中通過水浸提的方式提取得到淫羊藿總多糖，進而分離得到其中的多糖組分和非糖組分，并對其進行了鑒定，進一步明確了其組成成分。實驗證明得到的淫羊藿總多糖及其多糖和非糖組分均能夠增強免疫應(yīng)答，具有良好的佐劑作用，為疫苗和抗體的制備提供了新途徑。同時，分離得到了淫羊藿總多糖中具有佐劑作用的多糖組分和非糖組分，為淫羊藿總多糖的佐劑作用機制研究奠定了基礎(chǔ)，為找到具有更好佐劑效果的多糖或非糖制劑提供了可能。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0066]圖1為總多糖YYH-G的DEAE —纖維素柱層析洗脫曲線，苯酚一硫酸法檢測，490nm波長檢測糖吸收峰
[0067]圖2為總多糖YYH-G的DEAE —纖維素柱層析洗脫曲線，280nm波長檢測非糖成分
[0068]圖3為OVA抗原配伍多糖YYH-G免疫I次后小鼠血清抗體滴度，mean土SD，n=5
[0069]圖4為OVA抗原配伍多糖YYH-G免疫2次后小鼠血清抗體滴度，mean土SD，n=5
[0070]圖5為OVA抗原配伍多糖YYH-G免疫3次后小鼠血清抗體滴度，mean土SD，n=5[0071 ] 圖6為OVA抗原配伍多糖YYH-Gl或YYH-G4免疫I次后小鼠的抗體滴度，mean 土 SD，n=5
[0072]圖7為OVA抗原配伍多糖YYH-Gl或YYH-G4免疫2次后小鼠的抗體滴度，mean 土 SD，n=5
[0073]圖8為HlNl病毒抗原配伍多糖YYH-Gl免疫I次后小鼠血清抗體滴度，mean土SD，n=5
[0074]圖9為HlNl病毒抗原配伍多糖YYH-G4免疫I次后小鼠血清抗體滴度，mean土SD，n=5
[0075]圖10為HlNl病毒抗原配伍多糖YYH-Gl免疫2次后小鼠血清抗體滴度，mean土SD，n=5
[0076]圖11為HlNl病毒抗原配伍多糖YYH-G4免疫2次后小鼠血清抗體滴度，mean土SD，n=5
[0077]圖12為HlNl病毒抗原配伍多糖YYH-Gl或YYH-G4免疫I次后小鼠血清抗體滴度，mean 土 SD，n=5
【具體實施方式】
[0078]下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0079]實施例1:淫羊蕾總多糖的制備[0080]淫羊藿葉1kg,室溫下加入石油醚浸沒浸泡24小時,過濾,濾液30~35°C減壓回收浸膏。經(jīng)過石油醚浸提后的淫羊藿葉自然揮干后，加入15L蒸餾水，室溫下(20~30°C)浸泡48小時，期間不時攪拌；然后過濾，濾液離心IOmin(轉(zhuǎn)速3000r/min)，浸提后的淫羊藿葉在同樣條件下進行二次提取。合并二次提取的水提液，50~55°C減壓濃縮至1000ml，然后加入3倍體積(3000ml )95%的乙醇進行48小時的醇沉。醇沉液離心IOmin(轉(zhuǎn)速3000r/min)，沉淀部分加入1000ml水攪拌溶解，離心，沉淀再同樣操作二次。合并溶解的上清液，裝入透析袋(截留分子量>1000)，自來水透析48小時后換蒸餾水再透析24小時。該透析液50~55°C減壓濃縮至200ml左右，裝入小瓶進行冷凍干燥，獲得棕色粉末，即總多糖(得率為 0.74%)。
[0081]實施例2:淫羊蕾總多糖的制備
[0082]淫羊藿葉1kg，室溫下加入15L蒸餾水，室溫下(20~30°C)浸泡48小時，期間不時攪拌；然后過濾，濾液離心IOmin (轉(zhuǎn)速3000r/min),浸提后的淫羊藿葉在同樣條件下進行二次提取。合并二次提取的水提液，50~55°C減壓濃縮至1000ml，然后加入3倍體積(3000ml )95%的乙醇進行48~72小時的醇沉。醇沉液離心IOmin(轉(zhuǎn)速3000r/min)，沉淀部分加入1000ml水攪拌溶解，離心，沉淀再同樣操作二次。合并溶解的上清液，裝入透析袋(截留分子量> 1000 )，自來水透析48小時后換蒸餾水再透析24小時。該透析液50~55 °C減壓濃縮至200ml左右，裝入小瓶進行冷凍干燥，獲得棕色粉末，即總多糖(得率為0.81%)。
[0083]實施例3:淫羊蕾總多糖的制備
[0084]淫羊藿葉1kg，在55~60°C溫度下加入15L蒸餾水，浸泡48小時，期間不時攪拌；然后過濾，濾液離心IOmin (轉(zhuǎn)速3000r/min)，浸提后的淫羊藿葉在同樣條件下進行二次提取。合并二次提取的水提液，50~55°C減壓濃縮至1000ml，然后加入3倍體積(3000ml)95%的乙醇進行48~72小時的醇沉。醇沉液離心IOmin (轉(zhuǎn)速3000r/min)，沉淀部分加A 1000ml水攪拌溶解，離心，沉淀再同樣操作二次。合并溶解的上清液，裝入透析袋(截留分子量>1000)，自來水透析48小時后換蒸餾水再透析24小時。該透析液50~55°C減壓濃縮至200ml左右，裝入小瓶進行冷凍干燥，獲得棕色粉末，即總多糖(得率為1.9%)。
[0085]實施例4:淫羊蕾多糖組分的制備
[0086]室溫浸提的淫羊藿總多糖YYH_G(實施例1制備)lg，加入蒸餾水50ml溶解，溶解液上樣 DEAE-纖維素柱(08cmX35cm)，分別采用水、0.25mol/L NaHCO3>0.5mol/L NaHCO3 和
0.lmol/L NaOH進行連續(xù)洗脫，流速lml/min，IOml/管，相應(yīng)獲得多糖組分YYH_G0(490nm吸收，H20)、YYH-G1 (490nm 吸收，0.25mol/L NaHCO3)、YYH_G2 (490nm 吸收，0.5mol/L NaHCO3),YYH-G3 (490nm 吸收，0.lmol/L NaOH)以及非糖組分 YYH-G4 (280nm 吸收，0.25mol/LNaHCO3)> YYH-G5 (280nm 吸收，0.5mol/L NaHCO3)、YYH-G6 (280nm 吸收，0.lmol/L NaOH)。
[0087]總多糖YYH-G在DEAE —纖維素柱層析的色譜圖如圖1和圖2所示。
[0088]實施例5:淫羊蕾總多糖、酸性多糖組分和非糖組分的理化性質(zhì)
[0089]淫羊藿總多糖YYH-G由實施例4制備，酸性多糖組分YYH-Gl和非糖組分YYH-G4由實施例4制備。
[0090]1.淫羊藿總多糖和酸性多糖組分的含糖量(以葡萄糖計)的測定
[0091]I)實驗方法
[0092]采用硫酸一苯酹法測定糖含量(參考文獻:Dubois M., et al.Colorimetricmethod for detemination of sugars and related substances.Anal.Chem.1956;28:350-56)。
[0093]2)實驗結(jié)果
[0094]總多糖YYH - G為棕色粉末，含糖量為35.60% (以葡萄糖計算)；
[0095]酸性多糖組分YYH-Gl為淡黃色粉末，含糖量為58.93% (以葡萄糖計算)；
[0096]非糖組分YYH-G4為淺黃色粉末。
[0097]2.淫羊藿總多糖和酸性多糖組分的的糖醛酸含量(以半乳糖醛酸計)的測定
[0098]I)實驗方法
[0099]采用間輕聯(lián)苯法測定糖醒酸含量(參考文獻:Blumenkrantz N，et al.New methodfor quantitative determiation of uronic acid.Anal Biocheml973;54:484-89)。
[0100]2)實驗結(jié)果
[0101]總多糖YYH - G的糖醛酸含量為7.53% (以半乳糖醛酸計算)；
[0102]酸性多糖組分YYH-Gl的糖醛酸含量為8.40% (以半乳糖醛酸計算)。
[0103]3.淫羊藿總多糖中酸性多糖組分和非糖組分的分子量測定
[0104]I)實驗方法
[0105]儀器:HPLC，Waters公司；色譜柱:TSKsw4000 ;流動相:0.1M Na2SCM ;流速:0.6ml/min ;檢測器:示差。
[0106]2)實驗結(jié)果
[0107]酸性多糖組分YYH-Gl的分子量為6000~20000 ；
[0108]非糖組分YYH-G4的分子量為2000~10000。
[0109]4.淫羊藿總多糖中酸性多糖組分的單糖組成
[0110]酸性多糖組分YYH-Gl的單糖組成是鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及半乳糖醛酸，摩爾比分別為1.00:0.33:4.44:0.38:0.64:0.87:5.26。
[0111]由于藥材產(chǎn)地、批次不同，其中的糖含量和糖醛酸含量不可能完全相同，而是在本實施例數(shù)值周圍波動。例如總多糖YYH - G的含糖量為25-45%，酸性多糖組分YYH-Gl的含糖量為45-65%，總多糖YYH — G的糖醛酸含量為5_20%，酸性多糖組分YYH-Gl的糖醛酸含量為5-15%
[0112]實施例6:淫羊蕾總多糖的生物學(xué)試驗
[0113]將室溫下提取的淫羊藿總多糖YYH_G(實施例1制備)作為佐劑，以卵清蛋白(OVA)為抗原，二者聯(lián)用肌肉注射小鼠，測定產(chǎn)生的抗體滴度。具體實驗方法如下:
[0114]實驗動物:Balb/C，6_8周，5只/組，雌性。
[0115]藥物濃度:總多糖YYH-G:20mg/ml ；0VA:1.2mg/ml ;招佐劑:2mg/ml ；
[0116]對照溶劑:生理鹽水
[0117]給藥劑量:0VA-60ii g/50 iil/ 鼠；鋁佐劑一100iig/50iil/ 鼠；YYH-G:lmg/50 ii I/ 鼠;
[0118]分組:(I)P 組:PBS+0VA ; (2 )鋁佐劑組:鋁佐劑 +OVA ；(3) YYH-G 組:YYH_G+0VA ；(4)溶劑對照組:生理鹽水。注射前等體積混合，IOOiU/鼠，右后肢肌肉注射。
[0119]免疫方案:動物按照免疫分組首次免疫注射后3周，尾靜脈取血，測定血清中抗體滴度。首次免疫注射后第3周檢測抗體滴度，第4周加強免疫，二次免疫注射后2周，尾靜脈取血，測定血清中抗體滴度，視滴度情況，測定后2周進行第3次免疫。ELISA測定血清中抗體滴度。
[0120]ELISA法所用試劑配制:
[0121]1.抗原包被液:50mmol/L碳酸鹽緩沖液pH9.6。稱取無水Na2CO3L 696g，NaHC032.8 56g 加水溶解到 1000ml，調(diào)節(jié) pH 至 9.6。
[0122]2.洗滌液(10XPBST，pH7.4):稱取 NaC180g, KC12g，Na2HP0429g, KH2P042g，Tween-2010ml,雙蒸水至1000ml,調(diào)節(jié)pH7.4,10倍稀釋使用。
[0123]3.封閉液:1%BSA，用 50mmol/L PBS pH7.4 溶解。
[0124]4.底物液(TMB-H2O2):使用時將底物液A和B等體積混合，加入30%H202，終濃度
0.5%。
[0125]5.底物液A (TMB),稱取TMB200mg,無水乙醇100ml,加雙蒸水至1000ml。
[0126]6.底物液 B (0.lmol/L 檸檬酸-0.2mol/L Na2HPO4 緩沖液)，Na2HP0424.8g，檸檬酸19.33g，加雙蒸水至1000ml，調(diào)節(jié)pH5.0~5.4。
[0127]7.2N H2SO4
[0128]8.0VA溶解于抗原包被液，濃度為4 iig/ml，包被96孔板(Costa) IOOyl/孔，4°C過夜。PBST洗3遍，1%BSA-PBS37°C封閉lh。PBST洗3遍后加入以PBST稀釋的小鼠血清樣品，IOOiU/孔，37°C孵溫 lh。PBST 洗 3 遍，加入 HRP-羊抗小鼠 IgGC 1:1000, PBST)100 U I/?L，37°C孵溫1，PBST洗6遍，加入IOOiU底物液顯色后，加入50iU2N H2SO4終止反應(yīng)測定
A450。
[0129]實驗結(jié)果:
[0130]淫羊藿總多糖YYH-G、生理鹽水、Al (OH)3分別與OVA等體積混合，免疫小鼠，IOOu I/鼠，免疫3周尾靜脈取血，取血清自1:200始至1:12800等比稀釋，ELISA方法檢測血清抗體滴度。實驗結(jié)果表明第一次免疫所有測試組抗體滴度均比較低(圖3)，而經(jīng)過第二、三次免疫后YYH-G注射組動物血清滴度明顯升高(見圖4和圖5)，表明YYH-G具有顯著促進抗體產(chǎn)生作用。
[0131]實施例7:淫羊蕾多糖組分的生物學(xué)試驗
[0132]室溫下提取的淫羊藿總多糖YYH-G (實施例1制備)經(jīng)DEAE —纖維素柱層析，獲得酸性多糖組分YYH-Gl和非糖組分YYH-G4。YYH-Gl和YYH-G4分別作為佐劑，以卵清蛋白(OVA)為抗原，二者聯(lián)用肌肉注射小鼠，測定產(chǎn)生的抗體滴度。具體實驗同實施例6。
[0133]藥物濃度:YYH-GI: 10mg/ml ;YYH_G4:10mg/ml ；0VA:1.2mg/ml ;招佐劑:2mg/ml ；對照溶劑:生理鹽水
[0134]給藥劑量:YYH-60ii g/50 iil/ 鼠；鋁佐劑一100 y g/50 yl/ 鼠；YYH_G1:
0.5mg/50 u I/ 鼠；YYH-G4:0.5mg/50 yl/ 鼠;
[0135]分組:(1)P組:PBS+0VA ; (2)鋁佐劑組:鋁佐劑 +OVA ; (3)YYH_G1 組:YYH_G1+0VA ；
(4)YYH-G4 組:YYH-G4+0VA ；
[0136]注射前等體積混合，100 U I/鼠，右后肢肌肉注射。
[0137]實驗結(jié)果:
[0138]淫羊藿總多糖YYH-G經(jīng)DEAE —纖維素柱層析分離，得到酸性多糖組分YYH-Gl和非糖組分YYH-G4，按照免疫方案進行進一步的佐劑活性功能測定，經(jīng)第二次免疫后檢測，YYH-Gl和YYH-G4組分具有顯著的免疫佐劑活性，能夠促進抗體的產(chǎn)生(圖6和圖7)。
[0139]實施例8淫羊蕾多糖組分的生物學(xué)試驗
[0140]55~60°C下提取淫羊藿總多糖YYH-G (實施例3制備)經(jīng)DEAE —纖維素柱層析，獲得酸性多糖組分YYH-Gl和非糖組分YYH-G4。采用HlNl病毒裂解液為抗原測定兩種糖組分的活性。
[0141]YYH-Gl和YYH-G4分別作為佐劑，以HlNl病毒裂解液為抗原，YYH-Gl和YYH-G4按照不同的劑量分別與甲型流感疫苗HlNl病毒裂解液配伍肌肉注射小鼠，測定產(chǎn)生的抗體滴度。具體實驗同實施例6。
[0142]混合后藥物濃度:YYH-G1:10, 5，2.5，1.25mg/ml ;YYH_G4:5, 2.5，1.25mg/ml ；HlNl:30u g/ml ;鋁佐劑:lmg/ml ;對照溶劑:生理鹽水
[0143]給藥劑量:HlNl:3ug/100u I/ 鼠；鋁佐劑一IOOu g/100u I/ 鼠；YYH-GI:
1.0，0.5，0.25，0.125mg/100 u I/ 鼠;YYH_G4:0.5，0.25，0.125，0mg/100 ii I/ 鼠;
[0144]分組:(I)P組:H1N1 (YYH-Glor YYH-G4:0mg/100 u I/ 鼠);(2)鋁佐劑組:鋁佐劑+HlNl ；(3) YYH-Gl 組:YYH_G1+H1N1 ；(4) YYH-G4 組:YYH_G4+H1N1 ；
[0145]注射前等體積 混合，100 U I/鼠，右后肢肌肉注射。
[0146]實驗結(jié)果:
[0147]淫羊藿總多糖YYH — G經(jīng)DEAE —纖維素柱層析分離，得到酸性多糖組分YYH-Gl和非糖組分YYH-G4，與甲型流感疫苗HlNl病毒裂解液配伍免疫，結(jié)果顯示初次免疫后18天小鼠血清中具有較高HlNl病毒抗體滴度，YYH-Gl免疫劑量每只小鼠為0.125-lmg、YYH-G4免疫劑量每只小鼠為0.125-0.5mg，均具有較高的佐劑活性，劑量組之間沒有明顯的差異，說明低劑量有效(圖8-11)。
[0148]實施例9淫羊蕾多糖組分的生物學(xué)試驗
[0149]室溫下提取淫羊藿總多糖YYH-G (實施例2制備)經(jīng)DEAE —纖維素柱層析，獲得酸性多糖組分YYH-Gl和非糖組分YYH-G4。采用HlNl病毒裂解液為抗原測定兩種糖組分的活性。具體方法如實施例8。結(jié)果顯示室溫提取的YYH-Gl和YYH-G4配伍HlNl抗原初次免疫即可產(chǎn)生較高滴度的抗體(圖12)。
[0150]盡管本發(fā)明的【具體實施方式】已經(jīng)得到詳細的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細節(jié)進行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
【權(quán)利要求】
1.一種淫羊藿多糖，其特征在于 (1)含糖量為25-45%，例如35.60%(以葡萄糖計算)，糖醛酸含量為5_20%，例如7.53%(以半乳糖醛酸計算)；和/或 (2)其具有附圖1和附圖2所示的特征。
2.淫羊藿酸性多糖組分，其為權(quán)利要求1所述的淫羊藿多糖經(jīng)DEAE-纖維素柱層析，得到的利用硫酸-苯酚法顯色、具有490nm波長吸收的0.25mol/L NaHCO3洗脫部分。
3.一種淫羊藿酸性多糖組分，或者權(quán)利要求2所述的淫羊藿酸性多糖組分，其特征在于: 包含鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及半乳糖醛酸；以及，其分子量為6000~20000。
4.權(quán)利要求3的淫羊藿酸性多糖組分，其特征在于， (1)含糖量為45-65%，例如58.93%(以葡萄糖計算)，糖醛酸含量為5_15%，例如8.40%(以半乳糖醛酸計算)；和/或 (2)鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的摩爾比為鼠李糖:巖藻糖:阿拉伯糖:木糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=1.00:0.33:4.44:0.38:0.64:0.87:5.26。
5.淫羊藿非糖組分，其為權(quán)利要求1所述的淫羊藿多糖經(jīng)DEAE-纖維素柱層析，得到的具有280nm吸收的0.25mol/L NaHCO3洗脫部分。
6.一種淫羊藿非糖組分，或者權(quán)利要求5所述的淫羊藿非糖組分，其為淫羊藿多糖的非糖組分，其分子量為2000~10000。
7.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-6任一項的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖組分和/或淫羊藿非糖組分，以及藥學(xué)上可接受的輔料。
8.一種疫苗佐劑，其包含權(quán)利要求1-6任一項的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖組分和/或淫羊藿非糖組分。
9.一種疫苗制劑或疫苗組合物，其包含權(quán)利要求1-6任一項的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖組分和/或淫羊藿非糖組分。
10.權(quán)利要求1-6任一項的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖組分和/或淫羊藿非糖組分用于制備疫苗佐劑、疫苗制劑、疫苗組合物或抗體的用途。
11.一種制備抗體的方法，其包括使用有效量的權(quán)利要求1-6任一項的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖組分和/或淫羊藿非糖組分的步驟。
【文檔編號】A61K39/39GK103613675SQ201310562420
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2011年8月3日 優(yōu)先權(quán)日:2010年11月5日
【發(fā)明者】單俊杰, 王玉霞, 朱婷, 賈培媛, 武軍華, 趙修南, 刁玉林, 王晨宇, 段丹丹, 王佩瑞 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所