糖類(lèi)在制備治療血小板數(shù)量相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了糖類(lèi)在制備治療血小板數(shù)量相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。糖類(lèi)可以是單糖類(lèi)、所述單糖類(lèi)的氧化還原衍生物、寡糖、多糖、復(fù)合多糖和糖苷類(lèi)中的一種或多種。血小板數(shù)量相關(guān)的疾病包括原發(fā)性或繼發(fā)性血小板增多癥、原發(fā)性或繼發(fā)性血小板減少癥。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗血小板GPIbαN端抗體可誘導(dǎo)血小板活化、凋亡，可導(dǎo)致血小板在肝臟被巨噬細(xì)胞迅速清除，而糖類(lèi)能顯著抑制抗血小板GPIbα抗體導(dǎo)致的血小板清除，調(diào)控血小板數(shù)量。本發(fā)明首次提出糖類(lèi)在制備治療血小板數(shù)量相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用，拓展了糖類(lèi)的新用途。
【專(zhuān)利說(shuō)明】糖類(lèi)在制備治療血小板數(shù)量相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體涉及糖類(lèi)在制備治療血小板數(shù)量相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]臨床上各種因素導(dǎo)致的血小板數(shù)量異常會(huì)引起相關(guān)疾病，如原發(fā)性或繼發(fā)性血小板增多癥、原發(fā)性或繼發(fā)性血小板減少，包括免疫性血小板減少癥等。血小板增多癥是一種原因不明的異常增生伴血小板持續(xù)增多為主的骨髓增生性疾病，其臨床特點(diǎn)為多見(jiàn)于40歲以上的成年人、常伴有自發(fā)性皮膚黏膜出血，反復(fù)發(fā)作、可以有血栓形成、脾腫大、血小板持久性明顯增多，病因不明。該病的出血機(jī)理可能與血小板功能障礙或纖維蛋白溶解增強(qiáng)有關(guān)。按照歐美5國(guó)對(duì)原發(fā)性血小板增多癥的流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)病率為
0.59/10 萬(wàn)~2.53/10 萬(wàn)，近 20 年來(lái)，發(fā)病率增加了 3.2 倍(Johansson P.Epidemiologyof the myeloproliferative disorders polycytothemia vera and essentialthrombocythemia.Sem Thromb Haemost，2006，32:171-173)。
[0003]在血小板減少癥中免疫性血小板減少性紫癜(immune thrombocytopenia, ITP)是臨床常見(jiàn)的出血性疾病,約占出血性疾病總數(shù)的30% (侯明，戴克勝，彭軍，主編，《血小板疾病》，第二版，科技文獻(xiàn)出版社，2012年，142頁(yè))。研究表明ITP是一種自身免疫性疾病，該病的發(fā)生是由于體內(nèi)產(chǎn)生抗巨核細(xì)胞或血小板的自身抗體，其中抗血小板的抗體主要由抗血小板膜糖蛋白glycoprotein (GP) Ib-1X-V和GPIIb/IIIa的兩大類(lèi)抗體組成(MichelleLee Webster, Ebrahim Sayeh,Min Crow,Pingguo Chen,Bernhard Nieswandt, JohnFreedman, and Heyu N1.Relative efficacy of intravenous immunoglobulin G inameliorating thrombocytopenia induced by antiplatelet GPIIbIIIa versusGPIb a antibodies.Blood, 2006108:943-946)。兩大類(lèi)抗體與病人體內(nèi)血小板結(jié)合后，主要通過(guò)抗體的Fe端與人體內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticuloendothelial system, RES)結(jié)合,導(dǎo)致血小板被脾臟等器官清除。
[0004]雖然，近年來(lái)，ITP的發(fā)病機(jī)制研究取得了一系列的進(jìn)展，在體液免疫機(jī)制方面提出了自身抗體介導(dǎo)的巨核細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量異常。在細(xì)胞免疫機(jī)制方面提出了細(xì)胞毒T細(xì)胞直接溶解血小板的理論，但是，關(guān)于ITP的確切發(fā)病機(jī)理尚未明確。
[0005]由于發(fā)病機(jī)理尚未弄明確，因此，尚無(wú)根治的方法。美國(guó)ITP指南建議血小板低于20~30 X 109/L或低于50 X 109/L合并明顯皮膚黏膜出血以及有出血危險(xiǎn)因素者接受治療。目前主要的治療策略是抑制抗體的產(chǎn)生和血小板的破壞，促進(jìn)血小板的產(chǎn)生，包括各種免疫抑制劑、切除脾臟，促血小板生成等。治療的目的是使患者血小板計(jì)數(shù)提高到安全水平，降低病死率。
[0006]當(dāng)前的治療藥物主要為造血因子血小板生成素、白介素-11和免疫干預(yù)的糖皮質(zhì)激素、單克隆抗體等。然而上述各種治療藥物各自具有各自的局限性，如ITP常用治療藥物重組人血小板生成素(rhTPO)存在血栓、骨髓纖維化、靜脈堵塞等潛在副作用；靜脈內(nèi)注射免疫球蛋白(IVIG)適用于難治性或需緊急治療ITP患者，副作用輕，使用無(wú)限制，但由于其作用時(shí)間短，價(jià)格昂貴，限制了臨床應(yīng)用(Beardsley DS, ErtemM.Platelet autoantibodies in immune thrombocytopenic purpura.TransfusSc1.1998; 19:237-244)。因此找到一種有效治療血小板數(shù)量相關(guān)疾病的藥物是臨床醫(yī)學(xué)凾待解決的問(wèn)題。
[0007]糖類(lèi)又稱(chēng)為碳水化合物，其結(jié)構(gòu)指多羥基醛、酮、醇及其衍生物以及由糖苷鍵連接的此類(lèi)化合物的多聚體。糖類(lèi)化合物包括有單糖及其氧化還原衍生物、寡糖、多糖和復(fù)合多糖及糖苷類(lèi)。目前人類(lèi)使用的糖類(lèi)藥物已不下500多個(gè)，包括有多種抗生素、核苷、多糖、糖月旨、糖蛋白等。糖類(lèi)廣泛存在于自然界中，價(jià)格低廉，來(lái)源廣泛。但是糖類(lèi)藥物在治療血小板數(shù)量相關(guān)疾病中的應(yīng)用尚未見(jiàn)過(guò)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明目的是提供一種能有效治療血小板數(shù)量相關(guān)疾病的藥物。 [0009]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0010]糖類(lèi)在制備治療血小板數(shù)量相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0011]上述應(yīng)用中的所述糖類(lèi)可以是單糖類(lèi)、所述單糖類(lèi)的氧化還原衍生物、寡糖、多糖、復(fù)合多糖和糖苷類(lèi)中的一種或多種。
[0012]上述應(yīng)用中的所述單糖類(lèi)為以N-乙酸-D-葡糖胺、P-N-乙酸-D-葡糖胺、甲基-P -D-葡糖苷、D-葡萄糖為代表的所有單糖類(lèi)。
[0013]上述應(yīng)用中所述的血小板數(shù)量相關(guān)疾病包括原發(fā)性或繼發(fā)性血小板增多癥、原發(fā)性或繼發(fā)性血小板減少癥，但并不限于上述疾病，凡是由血小板數(shù)量引起的疾病都包含在內(nèi)。上述應(yīng)用中所述的血小板減少癥以免疫性血小板減少癥為代表,但不限于免疫性血小板減少癥。
[0014]上述應(yīng)用中所述的藥品可以是糖類(lèi)。
[0015]上述應(yīng)用中所述的藥品可以是包含糖類(lèi)的組合物。
[0016]上述應(yīng)用中所述的藥品按照通常的方式可以制備成各種劑型。
[0017]上述應(yīng)用中所述的藥品可以口服或者注射或者局部應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)抗血小板GPIb a N端抗體可誘導(dǎo)血小板活化、凋亡，可導(dǎo)致血小板在肝臟被巨噬細(xì)胞迅速清除，而糖類(lèi)能顯著抑制血小板GPIb a抗體導(dǎo)致的血小板清除，調(diào)控血小板數(shù)量。
[0019]本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)抗血小板GPIb a N端抗體可誘導(dǎo)血小板聚集,抗血小板GPIb a N端抗體誘導(dǎo)的血小板聚集依賴(lài)于抗體誘導(dǎo)的GPIb a聚集，不依賴(lài)于Fe段。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0021](I)基于新的發(fā)病機(jī)制，具有療效好、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。
[0022](2)本發(fā)明發(fā)掘了糖類(lèi)在用于制備治療血小板數(shù)量相關(guān)疾病藥物的新領(lǐng)域。
[0023]( 3 )糖類(lèi)來(lái)源廣泛、成本低廉，臨床應(yīng)用前景廣闊。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1顯示了抗血小板GPIb a抗體AN51可誘導(dǎo)血小板聚集。圖1A.分別向PRP中加入2 u g/ml的IgG和AN51，用血小板聚集儀記錄血小板聚集的變化。Risto代表瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集；圖1B.多種單克隆抗體對(duì)血小板聚集的影響，縱坐標(biāo)表示15min中內(nèi)血小板的最大聚集率，其中僅有AN51可顯著的誘導(dǎo)血小板聚集；圖1C.分別向PRP中加A 2 u g/ml的IgG和AN51在聚集儀中攪動(dòng)15min后，物鏡放大40倍后呈像結(jié)果。
[0025]圖2顯示了 AN51誘導(dǎo)的血小板聚集依賴(lài)于抗體誘導(dǎo)的GPIb a聚集，不依賴(lài)于Fe段。圖2A.PRP分別與10 u g/ml的小鼠IgG.1V.3在常溫下溫育lOmin，加入2 u g/mlAN51,血小板聚集儀記錄血小板聚集變化；圖2B.圖2A15min內(nèi)最大聚集率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；圖2C.分別向PRP中加入PBS和2 ii g/ml的AN51F(ab’)2片段，血小板聚集儀記錄血小板聚集變化；圖2D.圖2C15min內(nèi)最大聚集率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；圖2E.分別向PRP中加入2 u g/ml的AN51單體Fab片段、二聚體(AN51)和四聚體(AN51加羊抗小鼠F (ab ’)2，AN51 + GAM)，血小板聚集儀記錄血小板聚集變化；圖2F.圖2E15min內(nèi)最大聚集率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0026]圖3顯示了 AN51誘導(dǎo)血小板凋亡。圖3A.2 ii g/ml的IgG、AN51與洗滌血小板溫育1-6個(gè)小時(shí)后凋亡血小板的比例；圖3B.2 ii g/ml IgG, HIPl和AN51與洗滌血小板溫育6小時(shí)血小板凋亡蛋白表達(dá)的變化。
[0027]圖4顯示了 AN51可導(dǎo)致豚鼠體內(nèi)血小板數(shù)迅速下降。通過(guò)豚鼠前臂靜脈分別向不同的豚鼠注射正常小鼠IgG、0.05mg/kg、0.lmg/kg和0.2mg/kgAN51,在指定時(shí)間點(diǎn)眼眶采血，計(jì)數(shù)血小板。圖中每點(diǎn)代表該時(shí)間點(diǎn)血小板計(jì)數(shù)除以注射糖前血小板計(jì)數(shù)的倍數(shù)。
[0028]圖5顯示了 GlcNac可抑制AN51誘導(dǎo)的豚鼠血小板清除。通過(guò)豚鼠前臂靜脈分別向豚鼠注射PBS、5mM和IOmMGlcNac后，通過(guò)另一側(cè)前臂靜脈注射0.2 u g/kg AN51，在指定時(shí)間點(diǎn)眼眶采血，計(jì)數(shù)血小板。圖中每點(diǎn)代表指定時(shí)間血小板計(jì)數(shù)除以注射糖前血小板計(jì)數(shù)的倍數(shù)。
[0029]圖6顯示了 P -GlcNac可抑制AN51誘導(dǎo)的豚鼠血小板清除。通過(guò)豚鼠前臂靜脈分別向豚鼠注射PBS、5 ii M的P-GlcNac后，通過(guò)另一側(cè)前臂靜脈注射0.g/kgAN51，在注射抗體前和注射抗體后5min眼眶采血，計(jì)數(shù)血小板?？v坐標(biāo)代表剩余血小板數(shù)占注射抗體血小板數(shù)的百分比。
[0030]圖7顯示了 P -Glc可抑制AN51誘導(dǎo)的豚鼠血小板清除。通過(guò)豚鼠前臂靜脈分別向豚鼠注射PBS、25mM的P -Glc后，通過(guò)另一側(cè)前臂靜脈注射0.2 u g/kgAN51，在注射抗體前和注射抗體后5min眼眶采血，計(jì)數(shù)血小板。縱坐標(biāo)代表剩余血小板數(shù)占注射抗體血小板數(shù)的百分比。
【具體實(shí)施方式】
[0031]本發(fā)明中所述糖類(lèi)可以根據(jù)已知常規(guī)方法制備(方志杰，編著，《糖類(lèi)藥物合成與制備》，第一版，化學(xué)工業(yè)出版社，2010年)或1991年發(fā)明專(zhuān)利公開(kāi)的糖類(lèi)制備方法制備(專(zhuān)利號(hào):91108011，發(fā)明名稱(chēng):糖類(lèi)的制備方法)。另外，所述糖類(lèi)也可以通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)得。
[0032]本發(fā)明的藥物可以?xún)H是糖類(lèi)，也可以是含有糖類(lèi)的組合物。
[0033]通常，可將藥物制成各種劑型，所述藥物可以是口服或者注射或者局部應(yīng)用。
[0034]本發(fā)明中血小板數(shù)量相關(guān)疾病包括原發(fā)性或繼發(fā)性血小板增多癥、原發(fā)性或繼發(fā)性血小板減少癥，但并不限于上述疾病， 凡是由血小板數(shù)量引起的疾病都包含在內(nèi)。
[0035]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，抗血小板膜糖蛋白GPIb-1X-V的抗體與人的血小板結(jié)合后會(huì)導(dǎo)致血小板GPIb a胞外端聚集在一起，同時(shí)使得GPIb a N-末端上連接的P -N-乙酰-D-葡糖胺聚集在一起。聚集后的P-N-乙酰-D-葡糖胺對(duì)肝臟巨噬細(xì)胞表面aM02integrin受體的親和力大大增加，使得血小板被肝臟巨噬細(xì)胞吞噬清除。基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。
[0036]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)糖類(lèi)能抑制血小板破壞，調(diào)控血小板數(shù)量。實(shí)驗(yàn)證實(shí)糖類(lèi)調(diào)控血小板數(shù)量的機(jī)制之一為抑制抗體AN51導(dǎo)致的血小板清除。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述血小板數(shù)量相關(guān)疾病選自ITP。當(dāng)然，血小板數(shù)量相關(guān)疾病不只包括ITP，還包括原發(fā)性或繼發(fā)性血小板增多癥、非免疫性血小板減少癥等。
[0037]下面以實(shí)驗(yàn)例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0038]實(shí)驗(yàn)材料
[0039]小鼠抗人血小板GPIb a N端抗體AN51、抗人GPIX抗體SZl和抗人GPIIIa抗體SZ21由小鼠腹水通過(guò)protein G親和層析法純化得到。小鼠抗人GPIba抗體麗23由杜小平惠贈(zèng)。其他抗人GPIb a抗體AK2、HIPl和VM16d分別購(gòu)自Abeam、eBioscience和 Thermo Scientifc 公司。N-乙酸-D-葡糖胺(N-acetyle-D-glucosamine, GlcNac)、3 -N-乙酸-D-葡糖胺(3 -N-acetyle-D-glucosamine, 3 -GlcNac)、甲基-D-葡糖苷(methyl-^ -D-glucopyranoside, 3_Glc), D_ 葡萄糖(D-glucose，Glc)，瑞斯托霉素，從Sigma-Aldrich公司購(gòu)買(mǎi)。小鼠IgG片段化試劑盒購(gòu)自ThermoScientific公司。ProteinG瓊脂糖凝膠購(gòu)自GE healthcare o正常小鼠IgG從Santa Cruz公司購(gòu)買(mǎi)?？谷薋cyRIIA單克隆抗體IV.3購(gòu)自S temCell公司。JC-1、抗Bak, Bad, Bcl_2, Bcl-xl的抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。
[0040]血小板的分離與洗滌
[0041]取正常人新鮮靜脈血用A⑶以1:7抗凝。300g分離出富含血小板血漿(PRP)，PRP通過(guò)1500g離心得到血小板，CGS緩沖液洗滌2次后，重懸在改良的Tyrode’ s緩沖液中至3X108/ml，在常溫下靜置1-2h。用于血小板聚集實(shí)驗(yàn)的血液用3.8%檸檬酸鈉1:9抗凝，300g分離出PRP。
[0042]血小板聚集
[0043]取檸檬酸鈉抗凝的PRP分別加入正常小鼠IgG、抗血小板GPIb a多種單克隆抗體、瑞斯托霉素或AN51F (ab’)2,用血小板聚集儀(Chrono-1og)檢測(cè)血小板聚集。在研究抗Fe y RIIA的單克隆抗體IV.3對(duì)AN51誘導(dǎo)的血小板聚集實(shí)驗(yàn)中，10 u g/mlIV.3先與PRP在常溫下溫育5分鐘，再加入AN51檢測(cè)聚集。
[0044]流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板凋亡
[0045]洗滌血小板與2 U g/mlAN51分別溫育1_6小時(shí)后，JC-1標(biāo)記血小板線粒體膜電位，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板線粒體膜電位變化，將紅色熒光轉(zhuǎn)化為綠色熒光的血小板定義為凋亡血小板，并記凋亡血小板群體的百分比。
[0046]SDS-PAGE 和 Western Blot
[0047]洗滌血小板與正常小鼠IgG、對(duì)照抗體HIPl及AN51分別在37°C下溫育6小時(shí)后經(jīng)細(xì)胞裂解液在冰上裂解30min后加入6X SDS上樣緩沖液。蛋白由SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜后進(jìn)行Western Blot。一抗分別為抗Bak, Bad, Bcl-2, Bcl-xl的抗體,二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體，ECL發(fā)光法顯色。[0048]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
[0049]通過(guò)豚鼠前臂靜脈注射0.05mg/kg、0.lmg/kg 和 0.2mg/kgAN51 或 0.2mg/kg 正常小鼠IgG，在指定時(shí)間點(diǎn)通過(guò)眼眶采血，用3.8%檸檬酸鈉抗凝。抗凝血用血小板分析儀計(jì)數(shù)血小板。在研究糖對(duì)血小板清除影響的實(shí)驗(yàn)中，先通過(guò)豚鼠前臂靜脈注射不同濃度的N-乙酰-D-葡糖胺、e -N-乙酰-D-葡糖胺、甲基-P -D-葡糖苷或D-葡萄糖，5分鐘后，再通過(guò)另一側(cè)前臂靜脈注射0.2mg/kgAN51,同上采血并計(jì)數(shù)血小板。
[0050]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0051]1、抗血小板GPIb a N端抗體AN51可導(dǎo)致血小板聚集
[0052]單克隆抗體AN51的表位位于人血小板GPIb a N端1 一 35氨基酸殘基處，如附圖1A和B所示，用AN51與PRP溫育可誘導(dǎo)血小板發(fā)生聚集(聚集率為10% — 20%)。抗血小板 GPIb a 其他表位的抗體如 AK2 (35 — 59)、HIPl (59 — 81)、VM16d (201 — 168)、WM23(macroglycopeptide)或抗其他蛋白的抗體如SZl (GPIX)、SZ21 (GPIIIa)不能顯著地誘導(dǎo)血小板聚集發(fā)生(附圖1B)。顯微成像結(jié)果表明AN51誘導(dǎo)血小板形成小聚集物(附圖1C)。
[0053]2、AN51誘導(dǎo)的血小板聚集依賴(lài)于抗體誘導(dǎo)的GPIb a聚集，不依賴(lài)于Fe段
[0054]抗血小板抗體的Fe段可通過(guò)與Fe y RIIA受體結(jié)合誘導(dǎo)血小板發(fā)生活化和聚集。為了研究AN51是否通過(guò)與Fe y RIIA結(jié)合誘導(dǎo)血小板聚集，檢測(cè)了拮抗Fe y RIIA的抗體IV.3對(duì)AN51誘導(dǎo)的血小板聚集的影響。附圖2A表明IV.3不抑制AN51誘導(dǎo)的聚集。另外，不包含F(xiàn)e段的AN51F(ab’)2片段也可誘導(dǎo)血小板聚集(附圖2B)，進(jìn)一步說(shuō)明AN51導(dǎo)致血小板聚集不依賴(lài)于Fe段。
[0055]血小板GPIba多聚化可誘導(dǎo)血小板聚集，為了探討AN51是否通過(guò)誘導(dǎo)GPIb a聚集從而活化血小板，檢測(cè)了 AN51單體Fab片段、AN51IgG (二聚體)及羊抗小鼠(GAM) 二抗耦連的AN51 (四聚體)對(duì)血小板聚集的影響。如附圖2C所示，單體(Fab)不能誘導(dǎo)血小板聚集；與二聚體(AN51)相比，四聚體(AN51+GAM)可誘導(dǎo)更大的聚集發(fā)生(10% vs20% )。
[0056]因此，AN51誘導(dǎo)的血小板聚集依賴(lài)于抗體誘導(dǎo)的GPIb a聚集，不依賴(lài)于Fe段。
[0057]3、AN51可誘導(dǎo)血小板凋亡
[0058]線粒體膜電位去極化可作為血小板凋亡的指標(biāo)之一。洗滌血小板與分別與2 μ g/ml的小鼠IgG、AN51在37°C下溫育1_6小時(shí)，通過(guò)檢測(cè)線粒體膜電位去極化檢測(cè)細(xì)胞凋亡。圖3A顯示溫育4小時(shí)后，AN51引起的凋亡細(xì)胞的比例與IgG相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并呈時(shí)間依賴(lài)趨勢(shì)。另外檢測(cè)了小鼠IgG、對(duì)照抗體HIPl及AN51對(duì)血小板凋亡蛋白表達(dá)的影響。
2μg/ml抗體與洗漆血小板溫育6小時(shí)后裂解血小板，Western Blot結(jié)果(附圖3B)表明，與IgG和對(duì)照抗體HIPl相比，AN51可導(dǎo)致促凋亡蛋白Bad和Bak的表達(dá)上調(diào)，抑凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl表達(dá)下調(diào)。因此，AN51可誘導(dǎo)線粒體途徑依賴(lài)的血小板凋亡。
[0059]4、AN51可導(dǎo)致豚鼠體內(nèi)血小板迅速被清除
[0060]抗GPIba的抗體具有清除小鼠體內(nèi)血小板的作用。AN51可特異性的與豚鼠GPIba結(jié)合并導(dǎo)致GPIb a發(fā)生聚集。為探討AN51是否可清除豚鼠體內(nèi)血小板，通過(guò)向豚鼠前臂靜脈注射0.05mg/kg、0.lmg/kg和0.2mg/kg的AN51,在注射抗體前、注射抗體后5min、20min、lhr、3hr分別眼眶取血計(jì)數(shù)血小板。附圖4表明,AN51在5分鐘后即可清除血小板，并呈劑量依賴(lài)趨勢(shì)。豚鼠血小板在注射抗體3小時(shí)后逐漸恢復(fù)到正常水平。AN51的F(ab’)2片段也可導(dǎo)致豚鼠血小板迅速減少。注射正常小鼠IgG對(duì)豚鼠血小板計(jì)數(shù)沒(méi)有影響。
[0061]5、N-乙酰-D-葡糖胺顯著抑制抗體AN51導(dǎo)致的血小板清除
[0062]在注射AN51前，通過(guò)豚鼠前臂靜脈分別注射5mM和IOmM的GlcNac后，再向另一側(cè)前臂靜脈注射0.2mg/kg的AN51，分別在指定時(shí)間點(diǎn)眼眶采血后計(jì)數(shù)血小板。附圖5顯示IOmM的GlcNac可顯著抑制AN51誘導(dǎo)的血小板清除。
[0063]6、P -N-乙酰-D-葡糖胺顯著抑制抗體AN51導(dǎo)致的血小板清除
[0064]在注射AN51前通過(guò)豚鼠前臂靜脈分別注射IOii M的P-GlcNac后，再向另一側(cè)前臂靜脈注射0.2mg/kg的AN51，分別在指定時(shí)間點(diǎn)眼眶采血后計(jì)數(shù)血小板。附圖6顯示注射抗體5分鐘后10 ii M的 P -GlcNac可顯著抑制AN51誘導(dǎo)的血小板清除。
[0065]7、甲基-P-D-葡糖苷顯著抑制抗體AN51導(dǎo)致的血小板清除
[0066]通過(guò)豚鼠前臂靜脈分別注射25mM的P -Glc后，再向另一側(cè)前臂靜脈注射0.2mg/kg的AN51，分別在指定時(shí)間點(diǎn)眼眶采血后計(jì)數(shù)血小板。附圖7顯示注射抗體5分鐘后25mM的3 -Glc可顯著抑制AN51誘導(dǎo)的血小板清除。
[0067]8、D-葡萄糖顯著抑制抗體AN51導(dǎo)致的血小板清除
[0068]在注射AN51前通過(guò)豚鼠前臂靜脈分別注射IOOmM的Glc后，再向另一側(cè)前臂靜脈注射0.2mg/kg的AN51,分別在指定時(shí)間點(diǎn)眼眶采血后計(jì)數(shù)血小板。注射抗體5分鐘后IOOmM的Glc可顯著抑制AN51誘導(dǎo)的血小板清除。
【權(quán)利要求】
1.糖類(lèi)在制備治療血小板數(shù)量相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的糖類(lèi)可以是單糖類(lèi)、所述單糖類(lèi)的氧化還原衍生物、寡糖、多糖、復(fù)合多糖和糖苷類(lèi)中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述單糖類(lèi)為以N-乙酰-D-葡糖胺、3 -N-乙酸-D-匍糖胺、甲基_ P -D-匍糖苷、D-匍萄糖為代表的所有單糖類(lèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的血小板數(shù)量相關(guān)疾病包括原發(fā)性或繼發(fā)性血小板增多癥、原發(fā)性或繼發(fā)性血小板減少癥。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的血小板數(shù)量相關(guān)疾病為以免疫性血小板減少癥為代表的所有血小板減少癥。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物可以是糖類(lèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物可以是包含糖類(lèi)的組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物可以是各種劑型。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物可以是口服或者注射或者局部應(yīng)用。`
【文檔編號(hào)】A61P7/00GK103610684SQ201310547607
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月7日
【發(fā)明者】戴克勝 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)