白蓮蒿總黃酮的病理學(xué)及其新應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物，其包含白蓮蒿總黃酮作為活性成分，療效顯著，原料來源方便，制備方法簡單，有很高的臨床應(yīng)用價值。
【專利說明】白蓮蒿總黃酮的病理學(xué)及其新應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)病理學(xué)，具體涉及白蓮蒿總黃酮在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。 【背景技術(shù)】
[0002]類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種病因尚未明了的慢性全身性炎癥性疾病，以慢性、對稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，屬于自身免疫炎性疾病?；疾≡缙谟嘘P(guān)節(jié)紅腫熱痛和功能障礙表現(xiàn)，到達(dá)晚期時，關(guān)節(jié)可出現(xiàn)不同程度的僵硬畸形，并伴有骨和骨骼肌的萎縮，極易致殘。RA的特征性表現(xiàn)是滑膜增生，在滑膜與軟骨-骨交界處有局灶性侵襲的傾向。研究表明，滑膜細(xì)胞凋亡減少是RA發(fā)病的主要機(jī)制之一。由于滑膜細(xì)胞的增殖和凋亡之間的不平衡，亦即以滑膜增殖為主導(dǎo)，最終導(dǎo)致RA局部的病變。因此致力于控制關(guān)節(jié)局部的滑膜病變，已成為改善RA預(yù)后的關(guān)鍵所在。
[0003]Caspase家族是細(xì)胞凋亡調(diào)控重要因子，這些Caspase蛋白分子均以休眠狀態(tài)的酶原形式存在于正常細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入凋亡時被激活，并可促進(jìn)半胱氨酸蛋白酶家族的其他成員一起促進(jìn)細(xì)胞凋亡。正是由于此家族的激活最終導(dǎo)致內(nèi)源性核酸酶的激活和細(xì)胞骨架重新組合所致的細(xì)胞結(jié)構(gòu)解體，形成不可逆的凋亡，在凋亡過程中處于核心地位的Caspase-3很可能參與了這個過程。正常情況下，胞質(zhì)中Caspase-3以無活性、相對分子量約為32000的前Caspase-3形式存在，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，通過Asp-28-Ser_29和 Asp-175-Ser-176兩個位點(diǎn)酶切變?yōu)橛谢钚訡aspase-3，其活化可裂解多種細(xì)胞內(nèi)酶，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
[0004]白蓮蒿為菊科蒿屬植物，別名萬年蒿、鐵桿蒿。除高寒地區(qū)外，幾乎遍布全中國， 各地均有分布，資源豐富；日本、朝鮮、蒙古、阿富汗、印度、巴基斯坦、尼泊爾、俄羅斯、克什米爾地區(qū)也有。性味苦，辛，平。具有清熱解毒、涼血止痛、祛風(fēng)利濕之功效。我國民間用于治療急慢性肝炎、小兒驚風(fēng)、退熱、殺蟲、闌尾炎、急慢性胃腸炎、婦女內(nèi)寒證等；又作為止血藥，飼料?，F(xiàn)有技術(shù)公開了數(shù)種白蓮蒿總黃酮的提取方法，可以參見相關(guān)期刊，特別是在 ZL201210157137.9中公開了其微波提取法，在此將其全部引入本文。
[0005]本發(fā)明人進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)了白蓮蒿總黃酮具有較好的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供白蓮蒿總黃酮在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
[0007]在另一個方面，本發(fā)明還提供一種藥物組合物，包含白蓮蒿總黃酮與藥用輔料。
[0008]在一個實(shí)施方案中，所述藥物組合物為片劑、膠囊劑、滴丸、顆粒劑、注射劑或氣霧劑等。
[0009]通常，上述制劑可以使用藥學(xué)載體或稀釋劑以常規(guī)方式來制備。在治療包括人的哺乳動物時，本發(fā)明的白蓮蒿總黃酮的每日劑量在經(jīng)口給藥時為約0.01至250mg / kg體重，在腸胃外給藥時為約0.0Ol至250mg / kg體重?；钚猿煞值某Ｓ萌談┝靠梢栽谳^大范圍內(nèi)變化，并將取決于各種因素，比如給藥途徑，患者的年齡、體重和性別，而且可以由醫(yī)生根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來確定。
[0010]本發(fā)明的白蓮蒿總黃酮可以單獨(dú)使用，但是通常將以藥物制劑的形式給藥，其中所述化合物與藥學(xué)可接受的稀釋劑或載體組合。根據(jù)給藥方式，所述藥物制劑可以包括
0.05至99% w / w,例如0.10至80% w / w的活性成分。
[0011]本發(fā)明提供了一種新的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物，而且是從中藥提取物中制備的藥物，克服了現(xiàn)有治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物的不足之處，療效顯著，副反應(yīng)少，原料來源方便，制備方法簡單，有較大的臨床應(yīng)用價值。
【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)施例1動物藥效學(xué)試驗(yàn)
[0013]1.材料
[0014]動物選用日本大耳白兔48只,雌雄各半,周齡15~17周,適應(yīng)性飼養(yǎng)I周后用于實(shí)驗(yàn)。
[0015]藥物由ZL201210157137.9制備的白蓮蒿總黃酮。
[0016]試劑雞卵蛋白(分子量45000，Ig)，購于上海伯奧生物科技有限公司；弗氏完全佐劑(批號5881，IOmL)，Sigma公司產(chǎn)品。Caspase-3活性檢測試劑盒(批號201302)，CytC免疫組化試劑盒(201302)由武漢博士德公司提供。
[0017]2.方法
[0018]2.1模型復(fù)制:卵蛋白誘導(dǎo)性兔關(guān)節(jié)炎模型是通過皮下反復(fù)注射抗原致敏，刺激兔體內(nèi)生成大量抗體，之后在兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入一定劑量的相同抗原，從而產(chǎn)生相應(yīng)的抗原-抗體復(fù)合物沉積在關(guān)節(jié)滑膜上。此復(fù)合物本身不但可以激活補(bǔ)體產(chǎn)生局部炎性反應(yīng)，而且還可進(jìn)一步誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，從而形成慢性滑膜炎、滑膜增生，隨后血管增生和炎性細(xì)胞浸潤逐漸形成血管翳，其覆蓋軟骨后導(dǎo)致其變性和降解，整個病理過程與人的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相似。
[0019]將雞卵蛋白用無菌生理鹽水配制成濃度為20g / L的溶液，取相同體積的弗氏完全佐劑，二者混合數(shù)IOmin至混合液完全乳化,制成乳化液最終濃度為10g/L,滴于冰水上5-10min內(nèi)完全不擴(kuò)散為合格。從48只日本大耳白兔中隨機(jī)挑選8只兔作為正常對照組，并將所剩余家兔作為模型誘導(dǎo)組。取上述乳化液ImL在兔肩胛間區(qū)分5個部位皮下注射，第2周及第3周分別用相同方法加免疫一次。
[0020]第4周關(guān)節(jié)炎模型的誘發(fā):將兔固定于手術(shù)臺上，雙膝關(guān)節(jié)部位剪毛，常規(guī)酒精消毒，垂直于皮膚進(jìn)針1cm，雙膝各注射0.5mL雞卵蛋白溶液(含雞卵蛋白5mg)，注射后將兔放回原籠自由活動。定期觀察家兔的一般狀況，四肢關(guān)節(jié)腫脹、顏色、關(guān)節(jié)活動情況等變化。
[0021]2.2分組與給藥:
[0022]通過觀察家兔相繼在免疫后出現(xiàn)繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎癥狀，四肢出現(xiàn)發(fā)紅腫脹，檢測其膝關(guān)節(jié)腫脹程度及表面溫度。將模型日本大耳白兔隨機(jī)分為模型對照組、白蓮蒿總黃酮低劑量組、白蓮蒿總黃酮中劑量組、白蓮蒿總黃酮高劑量組、激素組，每組8只。與第5周開始耳緣靜脈注射藥物。白蓮蒿總黃酮低劑量組1.0mg / kg / d、白蓮蒿總黃酮中劑量組2.0mg / kg/d、白蓮蒿總黃酮高劑量組4.0mg / kg/d,激素組醋酸波尼松龍ImL / d (IOmg), 持續(xù)給藥2周。
[0023]2.3指標(biāo)檢測
[0024]家兔給藥2周后，耳緣靜脈空氣栓塞處死家兔，耳緣靜脈取血，收集家兔關(guān)節(jié)滑膜組織，滑膜細(xì)胞原代培養(yǎng)，將獲得滑膜組織采用雙酶消化法得到滑膜細(xì)胞5% CO2培養(yǎng)箱中孵化0.25%胰蛋白酶消化傳代。均采用第3代滑膜細(xì)胞用于試驗(yàn)。進(jìn)行滑膜細(xì)胞 Caspase-3, CytC的檢測,具體按試劑盒說明書操作。其中CytC陽性細(xì)胞數(shù)=陽性細(xì)胞數(shù)/ 計數(shù)細(xì)胞總數(shù)X 100，陽性細(xì)胞為光鏡下胞質(zhì)染色呈棕黃色的細(xì)胞。
[0025]2.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(x土 s) 表示，多組間比較用方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)，P〈0.05為差異有顯著性。
[0026]3.結(jié)果
[0027]3.1家兔一般狀態(tài)的觀察
[0028]正常對照組兔隨著飼養(yǎng)時間的延長，體重逐漸增加，精神狀態(tài)好，背毛有光澤，活動自如；而造模兔精神萎靡，活動減少，體重增加緩慢，注射部位出現(xiàn)多處小潰瘍，并不斷擴(kuò)大，軟組織損傷，最終形成大面積潰爛，活動受限。
[0029]3.2指標(biāo)檢測各組家兔膝關(guān)節(jié)直徑，膝關(guān)節(jié)表面溫度及滑膜細(xì)胞Caspase-3、CytC 比較。如表1結(jié)果顯示:模型組膝關(guān)節(jié)直徑、表面溫度均顯著升高，與正常組比較由顯著性差異(P〈0.01);白蓮蒿總黃酮低劑量組，中劑量組，高劑量組均可顯著性提高滑膜細(xì)胞 Caspase-3、CytC 水平(P〈0.01 或 P〈0.05)。
【權(quán)利要求】
1.白蓮蒿總黃酮在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
2.一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，包含白蓮蒿總黃酮與藥用輔料。
3.權(quán)利要求2的藥 物組合物，其為片劑、膠囊劑、滴丸、顆粒劑、注射劑或氣霧劑等。
【文檔編號】A61P29/00GK103520241SQ201310478687
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】王敏, 周莉 申請人:王敏, 周莉