一種胡椒堿的提取方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種胡椒堿的提取方法，采用超臨界萃取和微波萃取制備而成，使得含量有很大提高，本發(fā)明還提供了提供胡椒堿在制備抑制人宮頸癌細(xì)胞HELA細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用和制備增加骨密度藥物中的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】—種胡椒堿的提取方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥提取【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種胡椒堿的提取方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]胡椒堿是一種廣譜抗驚厥藥，對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性電驚厥有良好的對(duì)抗作用，對(duì)戊四氮、印防己毒素、士的寧，以及腦室內(nèi)注射筒箭毒堿、谷氨酸等引起的驚厥發(fā)作和聽源性發(fā)作，都有不同程度的對(duì)抗作用。對(duì)某些類型的癲癇病也有療效。胡椒堿對(duì)蠅類的毒性比除蟲菊聞。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有胡椒堿在提取制備方面采用超臨界和微波技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用報(bào)道，而目前的提取方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過(guò)大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種胡椒堿的提取方法。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供胡椒堿在制備抑制人宮頸癌細(xì)胞HELA細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用和制備增加骨密度藥物中的應(yīng)用。
[0006]技術(shù)方案:本發(fā)明的目的是通過(guò)如下的方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]—種胡椒堿的提取方法，取胡椒，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l-3ml/g生藥.min,萃取時(shí)間150_180min,得超臨界萃取物,加入70%乙醇,投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，每次加入的70%乙醇的量為藥材重量的2倍，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得胡椒堿提取物。
[0008]上述胡椒堿的提取方法，所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5% ο
[0009]上述胡椒堿的提取方法，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.min,萃取時(shí)間160min。
[0010]上述胡椒堿的提取方法，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。
[0011]上述胡椒堿在制備抑制人宮頸癌細(xì)胞HELA細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，胡椒堿的提取步驟為:取胡椒，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.min，萃取時(shí)間150-180min，得超臨界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，每次加入的70%乙醇的量為藥材重量的2倍，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得胡椒堿提取物。
[0012]上述胡椒堿在制備抑制人宮頸癌細(xì)胞HELA細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，胡椒堿的提取方法中所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.min，萃取時(shí)間160min，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。
[0013]上述胡椒堿在制備增加骨密度藥物中的應(yīng)用，胡椒堿的提取步驟為:取胡椒，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.π?η，萃取時(shí)間150_180min，得超臨界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，每次加入的70%乙醇的量為藥材重量的2倍，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得胡椒堿提取物。
[0014]上述胡椒堿在制備增加骨密度藥物中的應(yīng)用，胡椒堿的提取方法中所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.min，萃取時(shí)間160min，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。
[0015]現(xiàn)有技術(shù)中，胡椒堿采用醇提的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過(guò)大，不方便服用，本發(fā)明制備的胡椒堿得率增加，含量高，純度達(dá)98-99%，現(xiàn)有技術(shù)未發(fā)現(xiàn)其在制備抑制人宮頸癌細(xì)胞HELA細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用和制備增加骨密度藥物中的應(yīng)用，表明本品有希望做成這樣的藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下通過(guò)實(shí)施例形式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的 范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0017]實(shí)施例1
[0018]取胡椒lOOOg，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，CO2流量lml/g生藥.min，萃取時(shí)間150min，得超臨界萃取物，再加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400W,萃取2次，每次4分鐘，每次加入的70%乙醇量為2000g，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得胡椒堿提取物，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定胡椒堿的含量為98.4%。
[0019]實(shí)施例2
[0020]取胡椒lOOOg，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，CO2流量3ml/g生藥.min，萃取時(shí)間180min，得超臨界萃取物，再加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600W,萃取2次，每次8分鐘，每次加入的70%乙醇量為2000g，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得胡椒堿提取物，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定胡椒堿的含量為98.5%。
[0021]實(shí)施例3
[0022]取胡椒lOOOg，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.min，萃取時(shí)間160min，得超臨界萃取物，再加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率500W,萃取2次，每次6分鐘，每次加入的70%乙醇量為2000g，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得胡椒堿提取物，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定胡椒堿的含量為99.1%。
[0023]上述實(shí)施例中胡椒為胡椒科植物胡椒Piper nigrum L.的干燥近成熟或成熟果
實(shí)。
[0024]實(shí)施例4:胡椒堿抑制人宮頸癌細(xì)胞HELA細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究資料
[0025]I實(shí)驗(yàn)材料
[0026]1.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株
[0027]人宮頸癌細(xì)胞(HELA)，南京正亮醫(yī)藥科技有限公司實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)，DMEM+10%FBS
常規(guī)培養(yǎng)。
[0028]1.2實(shí)驗(yàn)藥物
[0029]研究藥物:本發(fā)明胡椒堿:按實(shí)施例3方法制備。
[0030]藥液儲(chǔ)液:稱取IOOmg胡椒堿，溶于5ml無(wú)水乙醇中，0.2 μ m濾器過(guò)濾,500 μ Idoff管分裝，-20°C存儲(chǔ)，同時(shí)0.2 μ m濾器過(guò)濾無(wú)水乙醇以備對(duì)照組之用。
[0031]1.3實(shí)驗(yàn)試劑
[0032]DMEM (GIBC0 公司 Cat.N0.12100_061Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419)；NaHC03 (上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat.N0.11810_033Lot.N0.1088387)；Trypsin (AMRESC0 公司批號(hào):2010/04)；EDTA (AMRESC0 公司批號(hào):2009/10);Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0 公司批號(hào):2010242);Str 印 tomycin Su I fat e( AMRE SCO公司批號(hào):2010382);無(wú)水乙醇(南京化學(xué)試劑有限公司批號(hào):080310182);MTT(Biosharp批號(hào):0793) ; PBS (實(shí)驗(yàn)室自配)；1.4實(shí)驗(yàn)器材
[0033]萊卡倒置顯微鏡(德國(guó)Leica型號(hào):DM1L);可見-紫外光微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)MD公司型號(hào):SPECTRA MAX190) ；C02培養(yǎng)箱(FORMA型號(hào):3111);超凈臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型號(hào):SW-CJ-ZFD);純水儀(美國(guó)Spring公司型號(hào):S/N020579);精密移液器(法國(guó)吉爾森公司型號(hào):P2);電子天平(德國(guó)賽多利斯有限公司型號(hào):BT323S);全自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號(hào):MLS-3020);臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號(hào):DHG9123A);冰箱(西門子公司型號(hào):KG18V21TI);液氮罐(CBS型號(hào):2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠型號(hào):ΚΑ-1000) ;0.2μπι濾器(MILLIP0RE型號(hào):SLGP033RB) ;IOcm培養(yǎng)皿(NEST公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0034]2實(shí)驗(yàn)方法
[0035]I) HELA 細(xì)胞用 DMEM+10%FBS 于 37 °C、5%C02 進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(IOcm 培養(yǎng)皿)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.049ffiDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，1000rpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3X 104個(gè)/ml。
[0036]2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180 μ I,培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 °C，5%C02 )常規(guī)培養(yǎng)。
[0037]3)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般長(zhǎng)至50%_70%，加入得生片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。[0038]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT),繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0039]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。
[0040]6)同時(shí)設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。
[0041]7)結(jié)果以藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率表示:
[0042]細(xì)胞增值抑制率(％)=(對(duì)照孔OD值-給藥孔OD值)/對(duì)照孔OD值X 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0043] 3統(tǒng)計(jì)處理
[0044]采用Microsoft Excel2003軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以mean+ S.D.表不。
[0045]4實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0046]MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時(shí)，對(duì)HELA細(xì)胞增殖抑制有差異(p〈0.05)，劑量在10mg/ml時(shí)該差異具有顯著性(P〈0.01)，當(dāng)劑量達(dá)到15-20mg/ml時(shí)有極顯著性差異(Ρ〈0.001)。
[0047]表1胡椒堿對(duì)HELA細(xì)胞增殖抑制影響研究(又土SD)
【權(quán)利要求】
1.一種胡椒堿的提取方法，其特征在于取胡椒，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l-3ml/g生藥.min，萃取時(shí)間150_180min，得超臨界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，每次加入的70%乙醇的量為藥材重量的2倍，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得胡椒堿提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種胡椒堿的提取方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種胡椒堿的提取方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa,溫度40°C, CO2流量2ml/g生藥.min,萃取時(shí)間160min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種胡椒堿的提取方法，其特征在于所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種胡椒堿在制備抑制人宮頸癌細(xì)胞HELA細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，其特征在于胡椒堿的提取步驟為:取胡椒，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l-3ml/g生藥.min,萃取時(shí)間150_180min,得超臨界萃取物,加入70%乙醇,投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，每次加入的70%乙醇的量為藥材重量的2倍，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得胡椒堿提取物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種胡椒堿在制備抑制人宮頸癌細(xì)胞HELA細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，其特征在于胡椒堿的提取方法中所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C，C02流量2ml/g生藥.π?η，萃取時(shí)間160min，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種胡椒堿在制備增加骨密度藥物中的應(yīng)用，其特征在于胡椒堿的提取步驟為:取胡椒，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.π?η，萃取時(shí)間150-180min，得超臨界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，每次加入的70%乙醇的量為藥材重量的2倍，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得胡椒堿提取物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種胡椒堿在制備增加骨密度藥物中的應(yīng)用，其特征在于胡椒堿的提取方法中所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.min，萃取時(shí)間160min，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103483309SQ201310466721
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月9日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:南京正亮醫(yī)藥科技有限公司