用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料及其制備與用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，其包括人羊膜及與其膠原蛋白特異結(jié)合的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，并固定結(jié)合鈣蛋白酶的抑制劑；本發(fā)明還提供一種該功能組織工程材料的制備方法，采用構(gòu)建特異結(jié)合膠原蛋白結(jié)合域的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白，以及共價(jià)交聯(lián)鈣蛋白酶的抑制劑，形成引導(dǎo)神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，可以有效地使得人羊膜特異結(jié)合神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，再生神經(jīng)形成正確的突觸連接，并消除鈣蛋白酶的神經(jīng)再次損傷作用，可用于中樞神經(jīng)損傷疾病靶向治療和神經(jīng)功能修復(fù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料及其制備與用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中樞神經(jīng)損傷疾病中促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，以及該功能組織工程材料制備及其在中樞神經(jīng)損傷疾病靶向治療、神經(jīng)功能修復(fù)和抑制神經(jīng)再次損傷中的用途。本發(fā)明涉及的功能組織工程材料包括人羊膜及與其膠原蛋白特異結(jié)合的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，并固定結(jié)合鈣蛋白酶的抑制劑，可用于中樞神經(jīng)損傷患者靶向治療、神經(jīng)功能修復(fù)和神經(jīng)再次損傷的臨床用藥。
【背景技術(shù)】
[0002]中樞神經(jīng)損傷是致殘率最高的疾病之一，其中外傷性腦損傷、腦出血、腦缺血和脊髓損傷是目前發(fā)病率極高的。中樞神經(jīng)損傷后，神經(jīng)元經(jīng)歷凋亡或壞死，軸突斷裂，導(dǎo)致神經(jīng)功能喪失。中樞神經(jīng)損傷臨床預(yù)后較差，目前臨床上沒(méi)有明確的治療手段和特效藥物，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和心理健康。
[0003]臨床治療中樞神經(jīng)損傷需要促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，不僅要促使受損神經(jīng)元的存活以及軸突生長(zhǎng)，還要克服引起神經(jīng)再次損傷的關(guān)鍵分子的作用，提供良好的再生和修復(fù)環(huán)境。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能支持神經(jīng)元存活，并促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)、分化以及維持其功能，已經(jīng)在臨床上應(yīng)用。但是簡(jiǎn)單施加于損傷原位的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子不能長(zhǎng)時(shí)間富集于損傷部位，而會(huì)隨體液擴(kuò)散到周?chē)＝M織，導(dǎo)致神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的損失，不能維持其有效治療濃度，治療效果低；周期性重復(fù)給藥雖可 維持損傷部位的藥物濃度，但易導(dǎo)致神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的過(guò)量使用，引發(fā)炎癥反應(yīng)和腦部癲癇。而且當(dāng)更加嚴(yán)重的神經(jīng)損傷發(fā)生時(shí)，損傷部位會(huì)出現(xiàn)不同程度的組織缺損，這時(shí)單純依靠原位施加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子已不能滿(mǎn)足促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的需要，同時(shí)損傷部位微環(huán)境中異常激活了造成神經(jīng)再次損傷的鈣蛋白酶。
[0004]目前，還沒(méi)有專(zhuān)門(mén)針對(duì)中樞神經(jīng)損傷的組織損傷、鈣蛋白酶的存在和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏的這三大因素的產(chǎn)品和治療手段。本發(fā)明針對(duì)中樞神經(jīng)損傷這三大因素，應(yīng)用人羊膜，與其膠原蛋白特異結(jié)合的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，并固定結(jié)合鈣蛋白酶的抑制劑制備成中樞神經(jīng)損傷中促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，實(shí)現(xiàn)對(duì)中樞神經(jīng)損傷的靶向治療，減少成本，增加療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]中樞神經(jīng)損傷疾病是神經(jīng)損傷后經(jīng)歷神經(jīng)元壞死和軸突斷裂，以致神經(jīng)功能喪失。中樞神經(jīng)損傷整個(gè)發(fā)病過(guò)程中涉及神經(jīng)組織損傷后神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏，并異常激活了造成神經(jīng)再次損傷的鈣蛋白酶，嚴(yán)重影響組織缺損部位神經(jīng)修復(fù)，發(fā)生退行性變化以及鈣蛋白酶的再次損傷作用。本發(fā)明遴選出幾乎無(wú)免疫原性和生物相容性好的人羊膜作為引導(dǎo)神經(jīng)修復(fù)的生物材料，通過(guò)膠原蛋白特異結(jié)合了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其與促使神經(jīng)元存活，以及促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)、分化和維持其功能密切相關(guān)；同時(shí)人羊膜上固定結(jié)合了鈣蛋白酶的抑制劑。
[0006]人羊膜成細(xì)絲狀的有序排列的基質(zhì)材料，具有生物相容性好，幾乎無(wú)免疫原性，可引導(dǎo)神經(jīng)生長(zhǎng)和延伸，支持神經(jīng)元正常生長(zhǎng)并具有促使神經(jīng)修復(fù)和恢復(fù)其功能，并且自身含有很多促使細(xì)胞增殖的營(yíng)養(yǎng)因子。它來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，取材和保存簡(jiǎn)便。
[0007]人羊膜上膠原蛋白特異結(jié)合的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophin, NT)包括腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等，它們?cè)诖偈股窠?jīng)元存活、生長(zhǎng)、分化和維持其功能方面發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brainderived neurotrophic factors, BDNF)對(duì)周?chē)窠?jīng)元和中樞神經(jīng)元具有廣譜的營(yíng)養(yǎng)保護(hù)作用；神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)是具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)和促突起生長(zhǎng)雙重生物學(xué)功能；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(neUix)tr0phin-3，NT-3)參與調(diào)控脊髓發(fā)育，影響神經(jīng)-肌肉突觸功能活性；膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophicfactor,⑶NF)對(duì)保護(hù)多巴胺運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、中樞及外周的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、感覺(jué)神經(jīng)元及交感神經(jīng)元等都具有同等的營(yíng)養(yǎng)作用。需要應(yīng)用這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子靶向神經(jīng)元存活、生長(zhǎng)、分化和維持其功能，將有助于減少患者退行性變化和促進(jìn)神經(jīng)組織再生。同時(shí)采用鈣蛋白酶的抑制劑，即異常激活的鈣蛋白酶引起神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，隨時(shí)間推移而擴(kuò)大神經(jīng)損傷區(qū)；通過(guò)鈣蛋白酶的抑制劑，如鈣蛋白酶抑制劑1、鈣蛋白酶抑制劑I1、MDL28170、PD150606、亮抑酶肽和鈣蛋白酶抑制蛋白等，特異性抑制鈣蛋白酶的作用，使鈣蛋白酶不能引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而構(gòu)建良好的神經(jīng)組織再生的微環(huán)境。
[0008]本發(fā)明涉及一種用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，其特征在于，包括人羊膜作為載體，含有通過(guò)膠原蛋白特異結(jié)合的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，并固定結(jié)合鈣蛋白酶的抑制劑。
[0009]本發(fā)明涉及一種用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，包括通過(guò)膠原蛋白特異結(jié)合了促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，即腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等；該神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是通過(guò)基因工程方法構(gòu)建成神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與膠原蛋白特異結(jié)合域的融合蛋白，含有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的成熟肽和與膠原蛋白結(jié)合域(Collagen bindin g domain, CBD)的多肽TKKTLRT。優(yōu)選地,膠原蛋白特異結(jié)合的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為兩種或兩種以上神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的混合物。
[0010]本發(fā)明涉及一種用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，還包括鈣蛋白酶的抑制劑為鈣蛋白酶抑制劑，即鈣蛋白酶抑制劑1、鈣蛋白酶抑制劑I1、MDL28170、PD150606、亮抑酶肽和鈣蛋白酶抑制蛋白等，通過(guò)共價(jià)交聯(lián)固定在人羊膜膠原上。優(yōu)選地，人羊膜膠原共價(jià)交聯(lián)固定的鈣蛋白酶的抑制劑為鈣蛋白酶抑制劑I或鈣蛋白酶抑制劑II。
[0011]本發(fā)明還提供一種用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料的制備方法。該制備方法為:首先獲取新鮮人羊膜和制備重組神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與膠原蛋白特異結(jié)合的多肽融合蛋白；將鈣蛋白酶抑制劑共價(jià)交聯(lián)到人羊膜上，后利用膠原蛋白特異結(jié)合多肽吸附到人羊膜上，形成具有消除鈣蛋白酶作用，富含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，又能定向引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)的功能組織工程材料。
[0012]本發(fā)明還提供所述功能組織工程材料在中樞神經(jīng)損傷疾病靶向治療和神經(jīng)功能修復(fù)中的應(yīng)用，具有很好的生物相容性，支持細(xì)胞正常生長(zhǎng)，保護(hù)神經(jīng)元的生長(zhǎng)不受其他因素的干擾，可有效修復(fù)中樞神經(jīng)損傷患者的神經(jīng)組織。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1表示本發(fā)明所述功能組織工程材料移植腦出血大鼠模型后mNSS評(píng)分改善圖[0014]圖2表示本發(fā)明所述功能組織工程材料移植腦出血大鼠模型核磁共振檢測(cè)血腫區(qū)域的大小改善圖
[0015]圖3表示本發(fā)明所述功能組織工程材料移植腦出血大鼠模型蘇木素-伊紅染色相對(duì)組織缺損改善圖
[0016]圖4表示本發(fā)明所述功能組織工程材料移植腦出血大鼠模型免疫組化檢測(cè)神經(jīng)絲蛋白表達(dá)率圖
[0017]圖5表示本發(fā)明所述功能組織工程材料移植腦出血大鼠模型免疫組化檢測(cè)成熟神經(jīng)元數(shù)量圖
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明通過(guò)自主設(shè)計(jì)遴選適合作為組織工程材料載體的人羊膜，其富含大量膠質(zhì)蛋白，通過(guò)膠原酶上能與CBD的多肽，TKKTLRT，通過(guò)基因工程技術(shù)重組到神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中，形成具有特異結(jié)合膠原蛋白的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白。鈣蛋白酶的抑制劑通過(guò)共價(jià)交聯(lián)到人羊膜上，再特異吸附神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白得到神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，不僅能使得神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子靶向錨定于神經(jīng)損傷部位，而且能消除鈣蛋白酶的作用，減少成本并增加有效性。
[0019]對(duì)本發(fā)明涉及的用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料進(jìn)行具體說(shuō)明。本發(fā)明涉及一種用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，其特征在于，包括人羊膜作為載體，含有通過(guò)膠原蛋白特異結(jié)合的神經(jīng) 營(yíng)養(yǎng)因子，并固定結(jié)合鈣蛋白酶的抑制劑。
[0020]本發(fā)明涉及一種用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，包括人羊膜采用無(wú)病毒感染的健康產(chǎn)婦來(lái)源的胎膜，即乙型肝炎5項(xiàng)、人類(lèi)丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒、梅毒和人乳頭狀瘤病毒等其他相關(guān)傳染性指標(biāo)均呈陰性。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備成不含上皮細(xì)胞的人羊膜，作為本發(fā)明中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的載體。
[0021]本發(fā)明涉及一種用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，包括通過(guò)膠原蛋白特異結(jié)合了促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，即腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等；該神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是通過(guò)基因工程方法構(gòu)建成神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與膠原蛋白特異結(jié)合域的融合蛋白，含有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的成熟肽和與膠原結(jié)合域CBD的多肽TKKTLRT。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，通過(guò)構(gòu)建含膠原結(jié)合域CBD和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到宿主中誘導(dǎo)表達(dá)和純化獲得含CBD域多肽的NT融合蛋白。
[0022]優(yōu)選地，膠原蛋白特異結(jié)合的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為兩種或兩種以上神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的混合物。
[0023]本發(fā)明涉及一種用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，還包括鈣蛋白酶的抑制劑為鈣蛋白酶抑制劑，即鈣蛋白酶抑制劑1、鈣蛋白酶抑制劑I1、MDL28170、PD150606、亮抑酶肽和鈣蛋白酶抑制蛋白等，通過(guò)共價(jià)交聯(lián)固定在人羊膜膠原上。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，2-亞氨氫氯化硫醇(Traut' s試劑)和4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(Sulf0-SMCC)的兩步偶聯(lián)反應(yīng)將鈣蛋白酶抑制劑固定在人羊膜上。
[0024]優(yōu)選地，人羊膜膠原共價(jià)交聯(lián)固定的鈣蛋白酶的抑制劑為鈣蛋白酶抑制劑I或鈣蛋白酶抑制劑II。[0025]本發(fā)明涉及用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料的制備，應(yīng)用上述的人羊膜、含膠原蛋白結(jié)合域的CBD的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以及鈣蛋白酶的抑制劑來(lái)實(shí)施。
[0026]其中，人羊膜為新鮮來(lái)源，經(jīng)修剪后浸泡于DMEM/F12培養(yǎng)基中，于4°C保存；
[0027]含膠原蛋白結(jié)合域CBD的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為用生物軟件Primer5.0設(shè)計(jì)合成引物后，將CBD的TKKTLRT基因序列引入到神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子上游引物，從人cDNA中擴(kuò)增出神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子成熟片段，并在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因上下游分別含有Nde I和Xba I酶切位點(diǎn)，與含有Nde I和Xba I酶切位點(diǎn)的ρΕΤ3--質(zhì)粒連接，構(gòu)建成含CBD區(qū)基因-神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子成熟片段的ρΕΤ3?重組質(zhì)粒。膠原結(jié)合域CBD與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子成熟肽融合蛋白的編碼序列的原核表達(dá)載體PET-CBD-NT轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，LB平板培養(yǎng)后挑選克隆轉(zhuǎn)至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并擴(kuò)大培養(yǎng)后誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，融合蛋白進(jìn)行洗滌和溶解，透析復(fù)性以及親和層析獲取目的蛋白；
[0028]功能組織工程材料的制備方法如下:Traut' s試劑和Sulfo-SMCC分別溶于磷酸鹽緩沖液(PBS，pH8.0,4mM EDTA)和PBS (pH7.2，4mM EDTA)中，將制備好的人羊膜浸泡于PBS(pH8.0，4mM EDTA)中，將Traut' s試劑與人羊膜在4°C下反應(yīng)過(guò)夜后，去除多余交聯(lián)劑，并用PBS (pH7.2,4mM EDTA)洗滌3次；另外將鈣蛋白酶抑制劑與Sulfo-SMCC在PBS(pH7.2，4mM EDTA)中室溫反應(yīng)30分鐘，然后與Traut' s試劑處理后的人羊膜室溫反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)完后用PBS(pH7.2，4mM EDTA)徹底洗滌，并用5%甘氨酸中和多余反應(yīng)基團(tuán)，得到固定了鈣蛋白酶的抑制劑的人羊膜；
[0029]取固 定了鈣蛋白酶的抑制劑的人羊膜置于6孔板中，加入一個(gè)或一個(gè)以上的含膠原蛋白結(jié)合域CBD的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白，室溫孵育2小時(shí)，然后將制備好的功能組織工程材料放置無(wú)菌錫箔袋中，用生理鹽水浸潤(rùn)后密封，即吸附CBD-NF融合蛋白并交聯(lián)鈣蛋白酶抑制劑I的人羊膜，于4°C保存。
[0030]本發(fā)明所涉及的鈣蛋白酶抑制劑是商業(yè)上可以購(gòu)買(mǎi)的，主要為鈣蛋白酶抑制劑1、鈣蛋白酶抑制劑I1、MDL28170、PD150606、亮抑酶肽和鈣蛋白酶抑制蛋白等，可以從美國(guó)西格瑪公司和美國(guó)R&D公司等。
[0031]采用本發(fā)明用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，對(duì)腦出血模型大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，大鼠血腫部位處敷上本發(fā)明的功能組織工程材料；與對(duì)照組相比，手術(shù)后第4周改良神經(jīng)功能損傷評(píng)分(mNSS評(píng)分)分值顯著低于其他對(duì)照組，表明促使了腦出血大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)；手術(shù)后第4周核磁共振檢測(cè)血腫區(qū)域的大小明顯小于對(duì)照組；蘇木素-伊紅染色表明實(shí)驗(yàn)組相對(duì)組織缺損面積明顯小于對(duì)照組；免疫組化分析大部分大鼠組織神經(jīng)絲蛋白陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，并且成熟神經(jīng)元數(shù)量明顯比對(duì)照組更高，表示其更好地促進(jìn)了神經(jīng)元的再生；同時(shí)促進(jìn)了血腫周?chē)鷧^(qū)成熟神經(jīng)元的存活；其中吸附了兩種以上神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子并交聯(lián)鈣蛋白酶抑制劑I的人羊膜效果更顯著。
[0032]本發(fā)明的該功能組織工程材料手術(shù)操作簡(jiǎn)單而且?guī)缀醪话l(fā)生免疫排斥反應(yīng)，為臨床上治療中樞神經(jīng)損傷疾病具有明顯優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用價(jià)值。
[0033]以下，結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更具體的描述，但本發(fā)明不限于此。
[0034]實(shí)施例一
[0035]人羊膜的制備
[0036]羊膜取材:人羊膜采用無(wú)病毒感染的健康產(chǎn)婦來(lái)源的胎膜(與捐獻(xiàn)者簽署了知情同意書(shū))，即乙型肝炎5項(xiàng)、人類(lèi)丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒、梅毒和人乳頭狀瘤病毒等其他相關(guān)傳染性指標(biāo)均呈陰性。
[0037]人羊膜含抗生素(4000U/ml的慶大霉素、青霉素500U/ml、鏈霉素500 μ g/ml) IXPBS (pH7.2)洗去胎盤(pán)的血凝塊，鈍性剝離羊膜，使其與絨毛膜分離，同時(shí)用含抗生素的PBS沖洗干凈后浸泡20min，上皮面朝上平鋪于硝酸纖維素膜上。將上述附有羊膜的紙片修剪成2.5cmX2.5cm的小塊。PBS沖洗2次，置于細(xì)胞培養(yǎng)板中DMEM/F12培養(yǎng)液(含100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素,無(wú)血清)浸泡,4°C保存?zhèn)溆茫蒲蚰ぞ谌〔暮?2h內(nèi)使用。
[0038]羊膜去上皮:用0.25%胰酶(含0.01% EDTA)37°C消化40min，用細(xì)胞刮刀輕輕刮除上皮細(xì)胞，PBS清洗2次，相差倒置顯微鏡下確認(rèn)上皮細(xì)胞全部清除。浸泡DMEM/F12培養(yǎng)液中置于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0039]實(shí)施例二
[0040]制備含膠原蛋白結(jié)合域CBD的⑶NF融合蛋白
[0041]用生物軟件Primer5.0設(shè)計(jì)合成引物后，以⑶NF為例，將CBD的TKKTLRT基因序列引入到⑶NF上游引物中，
[0042]上游引物1:5' -GGTCTACGGAGACCGGATCCG-3'；
[0043]上游引物 2:5' -CATATGACTAAGAAAACCCTGCGTACTGGGGTCTACGGAG-3'；
[0044]下游引物:5'-CTCGAG TCTCTGGAGCCAGAGATCT-3'
[0045]應(yīng)用上游引物I和下游引物從人cDNA中擴(kuò)增出⑶NF成熟片段，PCR擴(kuò)增反應(yīng)液為:2yL10XPCR緩沖液(大連TaKaRa公司)，2U-5U的Taq酶(大連TaKaRa公司)，
0.2~1.0mM的dNTPs (大連TaKaRa公司)以及0.2 μ mo I的上游引物I和下游引物(美國(guó)Invitrogen公司合成)；將配制好的體系放入PCR儀(博奧公司)中，應(yīng)用擴(kuò)增程序如下:940C 5 分鐘；94°C 30 秒，45°C 30 秒，72°C 40 秒，15 個(gè)循環(huán)；94°C 30 秒，60°C 30 秒，72°C 40秒，30個(gè)循環(huán)；72V 10分鐘，4°C保持。
[0046]應(yīng)用上游引物2和下游引物以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，將CBD片段基因引入⑶NF中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)液和擴(kuò)增程序與上述第一輪PCR —樣，第二輪PCR的CBD-PDNF產(chǎn)物同時(shí)引入Nda I和Xba I酶切位點(diǎn)，與含Nde I和XbaI酶切位點(diǎn)的ρΕΤ3 α質(zhì)粒連接。將20μπιο1CBD-PDNF產(chǎn)物與20μπιο1 ρΕΤ3 α質(zhì)粒在IOU的DNA連接酶作用，37 °C下反應(yīng)2小時(shí)，得到重組 pET3 a -CBD-PDNF 質(zhì)粒。
[0047]原核表達(dá)載體pET3(5-CBD-PDNF轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，LB平板37°C培養(yǎng)后挑選克隆轉(zhuǎn)至LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，并擴(kuò)大到500mLLB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)到0D600值約為0.8后，加入終濃度ImM的IPTG繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。6000轉(zhuǎn)每分鐘離心收集菌體，用IXPBS(pH7.2)洗滌后再次離心收集菌體，超聲破碎菌體后離心收集包涵體，用含0.4% 3-巰基乙醇過(guò)夜溶解包涵體，溶解好的包涵體加入復(fù)性液透析復(fù)性，采用鎳柱親和層析獲取目的蛋白，測(cè)樣品濃度后凍干備用。
[0048]其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，即BDNF、NGF和NT-3與CBD形成融合蛋白的方法與I3DNF —樣，制備成CBD-BDNF、CBD-NGF和CBD-NT-3的融合蛋白。
[0049]實(shí)施例三
[0050]人羊膜交聯(lián)上鈣蛋白酶的抑制劑[0051]Traut' s試劑(生工生物工程(上海)股份有限公司)和Sulfo-SMCC(美國(guó)西格瑪公司)分別溶于磷酸鹽緩沖液(PBS，pH8.0,4mM EDTA)和PBS (ρΗ7.2，4mMEDTA)中，將實(shí)施例一中制備好的人羊膜浸泡于PBS (pH8.0,4mM EDTA)中，將Traut' s試劑與人羊膜在4°C下反應(yīng)過(guò)夜后，去除多余交聯(lián)劑，并用PBS (pH7.2 ArM EDTA)洗滌3次。
[0052]另外按人羊膜平方毫米加入5微克鈣蛋白酶抑制劑I與Sulfo-SMCC在PBS(pH7.2ArM EDTA)中室溫反應(yīng)30分鐘，然后與Traut' s試劑處理后的人羊膜室溫反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)完后用PBS(pH7.2，4mM EDTA)徹底洗滌，并用5%甘氨酸中和多余反應(yīng)基團(tuán)，得到固定了鈣蛋白酶抑制劑1-人羊膜。
[0053]實(shí)施例四
[0054]功能組織工程材料的制備
[0055]取實(shí)施例三中制備好的鈣蛋白酶抑制劑1-人羊膜置于6孔板中，按人羊膜平方毫米加入I納摩爾總數(shù)量，加入實(shí)施例二中制備好的一個(gè)或一個(gè)以上的CBD-NF融合蛋白(一個(gè)以上CBD-NF融合蛋白按等比例加入)，室溫孵育2小時(shí)，然后將制備好的功能組織工程材料放置無(wú)菌錫箔袋中，用生理鹽水浸潤(rùn)后密封，即吸附CBD-NF融合蛋白并交聯(lián)鈣蛋白酶抑制劑I的人羊膜，于4°C保存。
[0056]實(shí)施例五
[0057]大鼠腦出血后神經(jīng)損傷修復(fù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
[0058]購(gòu)自北 京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心的36只實(shí)驗(yàn)SD大鼠，用10%水合氯醛(400mg/kg)溶液腹腔注射麻醉后，俯臥位固定在立體定向儀上，根據(jù)大鼠大腦立體定位圖譜，調(diào)整立體定向儀使門(mén)齒溝平面比耳間線平面低2.4mm，此時(shí)前鹵和后鹵在同一平面上。將頭部背側(cè)的鼠毛剪去，皮膚消毒、切開(kāi)皮膚暴露顱骨，30%過(guò)氧化氫液腐蝕顱骨上腱膜及顱骨外膜，暴露前鹵，用牙科鉆在前鹵點(diǎn)前0.5mm，右3.5mm處鉆孔，用微量注射器沿鉆孔方向垂直進(jìn)針5mm，緩慢均速推注肝素膠原酶IV生理鹽水液2ul (含肝素4U，膠原酶0.4U) 5分鐘，靜置2分鐘緩慢退出，縫合皮膚切口，建立腦出血大鼠模型。
[0059]建立的腦出血大鼠模型隨機(jī)分為A、B、C、D、E和F六組，每組6只，A組為實(shí)施例一制備的生理鹽水浸泡的人羊膜對(duì)照組，B組實(shí)施例三制備的交聯(lián)鈣蛋白酶抑制劑I的人羊膜治療組，C組為實(shí)施例四制備的吸附CBD-PDNF融合蛋白并交聯(lián)鈣蛋白酶抑制劑I的人羊膜治療組，D組為實(shí)施例四制備的吸附CBD-PDNF及CBD-BDNF融合蛋白并交聯(lián)鈣蛋白酶抑制劑I的人羊膜治療組，E組實(shí)施例4制備的為吸附CBD-PDNF、CBD-BDNF和CBD-NGF融合蛋白并交聯(lián)鈣蛋白酶抑制劑I的人羊膜治療組，F(xiàn)組為實(shí)施例四制備的吸附CBD-PDNF、CBD-BDNF、CBD-NGF和CBD-NT-3融合蛋白并交聯(lián)鈣蛋白酶抑制劑I的人羊膜治療組。
[0060]建立的腦出血大鼠模型分籠飼養(yǎng)72小時(shí)后，再度麻醉,俯臥位固定在立體定向儀上，根據(jù)大鼠大腦立體定位圖譜，同樣用牙科鉆在前鹵點(diǎn)推注肝素膠原酶IV位置鉆孔，直徑5mm，切開(kāi)硬腦膜、蛛網(wǎng)膜，找到血腫部位，敷上人羊膜，分層縫合，分籠飼養(yǎng)。分別于移植后I天和移植后第1、2、3、4、6周對(duì)所有大鼠進(jìn)行改良神經(jīng)功能缺失評(píng)分(modifiedNeurological Severity Scores, mNSS),結(jié)果如下表 I 所不。
[0061]表1
[0062]
【權(quán)利要求】
1.一種用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，其特征在于，其包括:作為載體的人羊膜；通過(guò)膠原蛋白特異結(jié)合的促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；以及固定結(jié)合鈣蛋白酶的抑制劑。
2.一種如權(quán)利要求1所述的用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，其特征在于，所述的促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，包括腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中的一種或多種；該神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是通過(guò)基因工程方法構(gòu)建成神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與膠原蛋白特異結(jié)合域的融合蛋白。
3.—種如權(quán)利要求3所述的用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，其特征在于，所述促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子優(yōu)選為兩種或兩種以上上述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的混合物；并吸附到人羊膜膠原蛋白上。
4.一種如權(quán)利要求1-2所述的用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，其特征在于，所述的鈣蛋白酶的抑制劑為鈣蛋白酶抑制劑1、鈣蛋白酶抑制劑I1、MDL28170、PD150606、亮抑酶肽和鈣蛋白酶抑制蛋白中的一種；并通過(guò)共價(jià)交聯(lián)固定在人羊膜膠原上。
5.一種如權(quán)利要求4所述的用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，其特征在于，所述的鈣蛋白酶的抑制劑優(yōu)選為鈣蛋白酶抑制劑I或鈣蛋白酶抑制劑II。
6.一種用于神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，其特征在于，其使用步驟如下: 含膠原蛋白結(jié)合域CBD的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為用生物軟件Primerf.0設(shè)計(jì)合成引物后，將CBD的TKKTLRT基因序列引入到神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子上游引物，從人cDNA中擴(kuò)增出神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子成熟片段，并在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因上下游分別含有Nde I和Xba I酶切位點(diǎn)，與含有Nde I和Xba I酶切位點(diǎn)的ρΕΤ3--質(zhì)粒連接，構(gòu)建成含CBD區(qū)基因-神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子成熟片段的ρΕΤ3α重組質(zhì)粒；含有膠原結(jié)合域CBD與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子成熟肽的融合蛋白的編碼序列的原核表達(dá)載體PET-CBD-NT轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，LB平板培養(yǎng)后挑選克隆轉(zhuǎn)至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并擴(kuò)大培養(yǎng)后誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，融合蛋白進(jìn)行洗滌和溶解，透析復(fù)性以及親和層析獲取目的蛋白； 功能組織工程材料的制備方法如下:Traut' s試劑和Sulfo-SMCC分別溶于IX磷酸鹽緩沖液(PBS)中，將制備好的人羊膜浸泡于IXPBS中，將Traut' s試劑與人羊膜在4°C下反應(yīng)過(guò)夜后，去除多余交聯(lián)劑，并用PBS洗滌3次；另外將鈣蛋白酶抑制劑與Sulfo-SMCC在I XPBS中室溫反應(yīng)30分鐘，然后與Traut' s試劑處理后的人羊膜室溫反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)完后用IXPBS徹底洗滌，并用5%甘氨酸中和多余反應(yīng)基團(tuán)，得到固定了鈣蛋白酶的抑制劑的人羊膜； 取固定了鈣蛋白酶的抑制劑的人羊膜置于6孔板中，加入一個(gè)或一個(gè)以上的含膠原蛋白結(jié)合域CBD的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白，室溫孵育2小時(shí)，然后將制備好的功能組織工程材料放置無(wú)菌錫箔袋中，用生理鹽水浸潤(rùn)后密封，即吸附CBD-NF融合蛋白并的，于4°C保存。
7.—種如權(quán)利要求6所述的神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，其特征在于，所述交聯(lián)到人羊膜的鈣蛋白酶抑制劑的數(shù)量為1-20微克每平方毫米，優(yōu)選為5微克每平方毫米。
8.—種如權(quán)利要求6所述的神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料，其特征在于，所述吸附到人羊膜的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的總摩爾數(shù)為0.5-10納摩爾每平方毫米，優(yōu)選為I納摩爾每平方毫米。
9.一種如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的神經(jīng)修復(fù)的功能組織工程材料的制備方法。
10.一種如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的功能組織工程材料在中樞神經(jīng)損傷疾病靶向治療或神經(jīng)功能修復(fù)中的應(yīng)用 。
【文檔編號(hào)】A61L31/00GK103705979SQ201310425493
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】張劍寧, 錢(qián)陽(yáng)明, 田麗麗, 劉爽 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院